Name: Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Lernen Sie die Differenzierung von menschlichen pluripotenten Stammzellen in retinale Pigmentepithelzellen für die Erforschung von BEST1-Mutationen und Bestrophinopathien. Diese Methode ermöglicht funktionelle Analysen und zellbasierte Therapieansätze.

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Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien EY025290, GM127652 und University of Rochester Anschubfinanzierung finanziert.

1. Differenzierung der hPSC, RPE
<ol><li>Pflegen und Durchgang hPSCs wie oben beschrieben18. Hinweis: Alle Zellen (einschließlich hPSCs und hPSC RPEs) werden bei 37 ° C um 5 % CO2 während der gesamten Dauer der Wachstum und Differenzierung Protokolle angebaut.</li>
	<li>
Vor der Differenzierung, konfluierende hPSCs für vorbeschichtete 6-Well-Platten aufgeteilt.
	<ol>
<li>Zum Beschichten Platten, Basalmembran Matrix für ca. 1 h auf Eis Auftauen, auszusetzen Sondennahrung Matrix bei 4 ° C DMEM Medium eine 01:50 Verdünnung, jedes gut 800 µL beschichtungsmischung hinzu, und mindestens 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Wenn die Beschichtung abgeschlossen ist, Aspirieren Sie die Mischung und fügen Sie sofort 1,5 – 2 mL Medium in die Vertiefungen.</li>
		<li>Um hPSCs von den alten Kultur-Platten heben, inkubieren Sie Zellen mit PBS plus 0,5 mM EDTA für 5 min bei Raumtemperatur, Aspirieren Sie die Lösung und aufzuwirbeln Sie Zellen in kleinen Klumpen mit Kulturmedium.</li>
		<li>Samenzellen bei ~ 20 % Konfluenz in die neuen Platten. Hinweis: Bewahren Sie Basalmembran Matrix in 100 µL-Aliquots bei-20 ° C auf und verwenden Sie eine Aliquote, um eine 6-Well-Platte zu beschichten. Die Zeit für die Beschichtung erweiterbar bis zu 4 h bei 37 ° C oder über Nacht bei Raumtemperatur. Es ist wichtig, auszusetzen und Samen hPSCs als kleine Klumpen von 3 – 5 Zellen anstatt einzelner Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn Zellen zur vollen Konfluenz angebaut werden, ersetzen Sie das Kulturmedium mit Differenzierung Medium (4 mL/na) (Tabelle 1, ohne Activin-A). Kultur für 14 Tage, Ändern des Mediums (4 mL/na) 3 X / Woche. Hinweis: Der hPSC Platte Dichte Doppel ca. alle 24 Std. erhebliche Zelltod wird nach dem Start des Verfahrens Differenzierung erwartet. Aggregate von abgestorbenen Zellen und Schmutz in den Vertiefungen ist während der mittleren Änderungen mit dem bloßen Auge zu sehen.</li>
	<li>Von 15 Tag zu Tag 28 Differenzierung Medium mit 100 ng/mL Human Activin-A (Tabelle 1, mit menschlichen Activin-A) zu ergänzen. Ändern Sie das Medium (4 mL/na) 3 X / Woche.</li>
	<li>Activin-A-Supplementierung ab Tag 29 (Tabelle 1, ohne menschlichen Activin-A) zu stoppen. Fahren Sie fort, Zelle Kultivierung in Differenzierung Medium für 8 – 10 Wochen bis pigmentierten hPSC-RPE-Cluster (Abbildung 1A-B) angezeigt werden. Hinweis: Cluster von pigmentierten Zellen können gesehen werden als kleine dunkle Punkte auf einer Zellplatte Kultur mit dem bloßen Auge (Abbildung 1A-B, oben). Einzelne pigmentierte Zellen mit der Signatur Kopfsteinpflaster Form sehen unter 20 X Mikroskop (Abbildung 1A-B, unten).</li>
</ol>2. Isolierung und Kultur von differenzierten RPE-Zellen
<ol><li>Entfernen Sie das Medium Differenzierung, einmal mit PBS waschen, fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin plus 1 U/µL der Kollagenbildung in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 20-30 min. entfernen die Trypsin/Kollagenase und sanft 2 mL vorgewärmten RPE-Medium in jede Vertiefung des 6-Well-Platte (< C0 > Tabelle 2). Hinweis: Verwenden Sie einem inversen Mikroskop, um die Morphologie der hPSC RPE-Zellen, die polygonale vor Trypsin/Kollagenase-Behandlung sind, zu überwachen und werden Sie Runde nach ausreichende Verdauung.</li>
	<li>
Verwenden Sie einen Bunsenbrenner zu ziehen-Glas, das Pasteur Pipetten.
	<ol>
<li>Mit beiden Händen halten eine lange (9 Zoll) Pasteurpipette an beiden Enden, so ist die horizontale, und über dem Bunsenbrenner ca. 2/3 über die gesamte Länge des dünnen Teils der Pipette.</li>
		<li>Sobald das Glas von der Flamme weich wird, ziehen Sie schnell die beiden Enden auseinander, so dass eine Mikro Schaber-wie Spitze an das neue Ende der Pipette (Abbildung 2) gebildet wird.</li>
		<li>Wiederholen Sie mehrmals erstelle ich mehrere "Zell-Schaber". Spray zog Pipetten mit 70 % igem Ethanol für die Sterilisation und trocknen sie in der Zelle-Kultur-Haube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Unter dem Mikroskop verwenden eine Mikro "Zelle Schaber" sanft pigmentierten hPSC-RPE-Cluster von der Platte zu trennen.
	<ol>
<li>Klopfen Sie leicht (nicht reiben) direkt auf die pigmentierten Zellen, die schwimmt bis in das Kulturmedium sobald sie von der Unterseite des Brunnens zu distanzieren.</li>
		<li>Sofort verwenden Sie eine 20 µL Mikropipette sanft Absaugen der dissoziierten hPSC-RPE-Zellen und übertragen Sie sie auf eine vorbeschichtete 6-Well-Platte mit RPE mittlere24.</li>
		<li>~ 5 x 103 Zellen (~ 10 % Konfluenz wie unter einem 20 X Mikroskop beobachtet) in jedem vorbeschichtet gut von einem 12-Well-Platte durch Wiederholen der Schritte 2.3.1–2.3.2 mehrfach, je nach Bedarf zu sammeln. Bringen Sie das Endvolumen des Mediums zu 2 mL. Hinweis: Zur Vermeidung von dissoziierten hPSC-RPE vermeiden Zellen von schwimmenden entfernt, Bewegung der Platten bei der Dissoziation so, dass die dissoziierten Zellen mittelfristig schwimmende sind aber noch lokal konzentriert bleiben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur neu isoliert hPSC-RPE Zellen (P0) auf 12-Well-Platten im RPE Medium für weitere 6-8 Wochen damit sie sich eine pigmentierte Monolayer (Abbildung 1) bilden.</li>
	<li>Ändern Sie das Medium 3 X / Woche. Wenn Sie das Medium wechseln, lassen Sie etwa 1/3 Volumen des alten Mediums in jede Vertiefung und Volumen Sie 2/3 des frischen, vorgewärmten RPE-Mediums. Zu diesem Zeitpunkt verwenden Sie 2 mL RPE Medium für jede Vertiefung in einem 12-Well-Platte (1,3 mL Medium austauschen so jedes Mal). Hinweis: Der Monolage von P0 hPSC-RPE-Zellen bilden kann Kuppeln, was darauf hindeutet, dass die Zellen sind aktiv Transport von Flüssigkeiten und durch die tight Junctions25verankert sind. Kuppel Bildung ist daher ein Indikator für Reife RPE-Status.</li>
</ol>(3) RPE Schicksal Validierung durch Immunoblotting
<ol><li>Machen Sie die hPSC-RPE Zelle lysate mit Säugetier-Protein Extraktionspuffer ergänzt mit Proteinase Inhibitor cocktail. Inkubieren Sie die Zelle lysate auf Eis für 30 min vor der Zentrifugation bei 13.000 X g für 15 min bei 4 ° C, ungelöste zellenrückstand zu verwerfen. Messen Sie die Gesamt-Protein-Konzentration von lysate.</li>
	<li>Denaturieren 40 µg Gesamt-Protein in Laemmli SDS-Probenpuffer bei 75 ° C für 10 min. trennen das Protein Proben auf einem 10 %-Tris-Glycin SDS-PAGE-Gel bei einer Konstanten Spannung von 90 V für 15 min und dann 150 V bis der Farbstoff vorderen erreicht die Unterseite des Gels.</li>
	<li>Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran in vorgekühlte Tris-Glycin Puffer mit 10 % Methanol bei 100 V für 1 h ergänzt.</li>
	<li>Blockieren Sie die Membran in Tris gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel (TBST) und 5 % fettfreie Trockenmilch für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit Primärantikörpern verdünnt in den blockierenden Puffer bei 4 ° C über Nacht. Verdünnen Sie die Antikörper, die gezielt RPE-spezifische Marker-Proteine wie folgt: RPE65, 1:1 000; AUTOANTIGEN, 1:1 000; BEST1, 1:1 000. Verdünnen Sie die Antikörper gegen β-Aktin bei 1: 10.000, β-Actin als Kontrolle laden zu erkennen.</li>
	<li>Die Membran mit TBST 3 Mal mit 5 Minuten für jede Wäsche zu waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit Fluorophor konjugierten Ziege Anti-Maus IgG Sekundärantikörper verdünnt 1: 10.000 in blocking-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die Membran mit TBST 4 mal mit 10 min für jede Wäsche zu waschen.</li>
	<li>Erkennen Sie die Proteine, die über eine Infrarot imaging-System (Abbildung 3).</li>
</ol>4. Überprüfung BEST1 subzelluläre Lokalisation durch Immunostaining
<ol><li>HPSC RPE-Zellen mit 2 mL PBS einmal waschen und in 2 mL 4 % Paraformaldehyd für 45 min bei Raumtemperatur zu beheben.</li>
	<li>Zweimal mit 2 mL PBS waschen Sie und inkubieren Sie die Zellen in 2 mL PBS mit 0,1 % nichtionische Tenside und 2 % Esel-Serum für 45 min um die unspezifischen Bindungsstellen blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit BEST1 Antikörper (Verdünnung 1: 200) für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS 3 Mal. Inkubieren mit Fluorophor konjugiert sekundäre IgG (1:1, 000) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie mit 2 mL PBS 3mal, ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.</li>
	<li>Beobachten Sie gefärbte Zellen durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 4).</li>
</ol>5. Aufnahme Ca2 +-abhängigen Cl– Stromin hPSC-RPE von Whole-Cell Patch Clamp
<ol><li>24-72 h vor der Patch-Clamp, split ein voll konfluierende (auf einem 12-Well-Platte) der Reifen P0 hPSC-RPE Zellen (Kopfsteinpflaster-förmigen und pigmentierten). Aspirieren Sie die einmal Mittel, Waschen mit PBS, und 1 mL 0,05 % Trypsin plus 1 U/µL Kollagenase in den Brunnen. Hinweis: Vorwärmen der Trypsin/Kollagenase auf 37 ° C direkt vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Bei 37 ° C 8 min inkubieren. Hinweis: Nach diesem Schritt sind die hPSC RPE-Zellen noch anhaftende und verbunden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 1 mL mikropipette, um die Zellen aus der Platte vorsichtig waschen und übertragen Sie Zellen in der Verdauung Mischung auf eine 15 mL konische Rohr. Waschen Sie den Brunnen mit 1 mL vorgewärmten Trypsin/Kollagenase, die restlichen Zellen zu sammeln und kombinieren sie in der 15 mL konische Röhrchen. Hinweis: Der hPSC RPE-Zellen sind zu diesem Zeitpunkt noch in großen Klumpen. Versuchen Sie nicht, die Zelle Klumpen von kräftig pipettieren zu brechen. Einige Klumpen können an der Innenwand der 1 mL Spitze haften.</li>
	<li>Inkubieren Sie das konische Rohr in einem 37 ° C trocken Bad für 8 min.</li>
	<li>Verwenden einer Mikropipette 1 mL Pipette vorsichtig nach oben und unten 10-15 Mal die Verdauung Mischung. Hinweis: Die Zelle Klumpen werden viel kleiner, aber immer noch sichtbar. Vermeiden Sie kräftig pipettieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte. Hinweis: Die meisten Zellen sollte in Single-Zellsuspension nach pipettieren. Es gibt möglicherweise noch einige winzige Zelle Klumpen, die akzeptabel sind. Optional: Inkubieren Sie das konische Rohr bei 37 ° C für eine zusätzliche 5 min, gefolgt von sanften pipettieren. Die Gesamtzeit in der Trypsin/Kollagenase bei 37 ° C sollte 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29) nicht überschreiten.</li>
	<li>Die 15 mL konische Röhrchen mit den verdauten Zellen fügen Sie 5 mL vorgewärmten RPE Medium hinzu. Drehen Sie mit 200 X g für 5 min um die Zellen zu sammeln. Wieder aussetzen und Samen Zellen auf vorbeschichtete 35 mm Schalen bei 10 – 20 % Konfluenz (z.B., eine 100 % gut auf ein 12-Well-Platte, 5 35 mm Gerichte für 10 % Konfluenz konfluierende). Hinweis: Zu allen Zeiten, vermeiden Sie kräftig pipettieren, das kann erhebliche Zelltod auslösen, vertreten durch scheinbare dunklen zellenrückstand im überstand nach Zentrifugation. Gut getrennten einzellige Aussaat ist essentiell für Patch-Clamp-Aufnahme.</li>
	<li>Führen Sie die gesamte Zelle Patch Klemmen Sie wie zuvor beschrieben18,26,27,28,29,30,31. Aktuelle Spuren aus einer Familie von Schritt Potenziale zu erwerben (-100 bis + 100 mV aus einem Holding Potential 0 mV) (Abbildung 5). Hinweis: Die Rezepte der internen und externen Lösungen sind in Tabelle 3 und Tabelle 4, bzw. beschrieben.</li>
</ol>

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<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das wichtigste Verfahren für die Krankheit im Gericht Ansatz soll hPSCs mit einer krankheitsverursachenden Mutation auf die richtige Zelle Abstammung zu unterscheiden, die RPE für BEST1ist. So sollte nach jeder Differenzierung Experiment die resultierenden hPSC RPE-Zellen sorgfältig für ihren Reifen Status von RPE-spezifische Morphologien und Protein-Marker16,17,18überprüft werden. Zur Minimierung von klonalen Artefakt ...

Es ist dokumentiert worden, die mindestens fünf degenerative Netzhauterkrankungen durch genetische Mutationen im BEST1 gen1,2,3,4,5,6 entstehen , 7 , 8, mit der Anzahl der gemeldeten Mutationen bereits mehr als 200 und noch immer. Diese BEST1-assoziierten Krankheiten, auch bekannt als Bestrophinopathies, fortschreitenden Sehverlust und sogar Blindheit verursachen, und es gibt derzeit keine wirksamen Therapien. Die Protein-Produkt von BEST1, nämlich BESTROPHIN1 (BEST1), ist ein Ca2 +-aktivierte Cl– -Kanal (CaCC) speziell in das retinale Pigmentepithel (RPE) der Augen5,6, ausgedrückt 8,9. Wichtig ist, einen klinischen Phänotyp BEST1-Folgeerkrankungen ist die reduzierte visuelle Antwort auf lichtreize, namens light Peak (LP) gemessen in der Electrooculogram10,11; LP wird geglaubt, um durch ein CaCC RPE12,13,14vermittelt werden. Um die pathologischen Mechanismen der BEST1 Mutationen besser zu verstehen und darauf hinarbeiten, mögliche Therapien, unbedingt studieren mutierten BEST1 Kanäle endogen in menschlichen RPE-Zellen exprimiert.
Jedoch RPE Zellen direkt vom live-Patienten ist sehr unpraktisch. Obwohl native RPE-Zellen aus Biopsien von menschlichen Leichen und Föten geerntet werden können, schränkt der schwierige Zugang zu diesen Quellen deutlich wissenschaftlichen Forschung. Daher ist es wichtig, alternative RPE-Quellen als das menschliche Auge. Dieser Aufruf wurde durch die jüngsten Fortschritte in der Stammzellenforschung Techniken beantwortet wie funktionale RPE-Zellen können jetzt aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs), einschließlich der embryonalen Stammzellen (hESC) unterschieden und pluripotente Stammzellen (HiPSCs), letzteres induzierte durch Umprogrammierung primäre Haut Fibroblasten vom Geber16,17,18generiert wird. Wichtig ist, der Selbsterneuerung und Pluripotenz von hPSCs gewährleisten eine zuverlässige Quelle um RPEs, zu erzeugen, während die Patienten Spezifität der HiPSCs und genomic Änderung Potenzial embryonaler (z. B.durch CRISPR) bieten ein vielseitiges Krankheit-Gericht-Modell für gewünschte BEST1 Mutationen.
hPSC-RPE hat mehrere Vorteile gegenüber Mäusen RPE Modelle: 1) BEST1 -Knockout-Mäusen zeigen kein Netzhaut Anomalie19, Anhebung der Möglichkeit unterschiedliche genetische Anforderungen der BEST1 im RPE zwischen Mäusen und Menschen; (2) nur 3 % der menschlichen RPE-Zellen sind zweikernige, im Gegensatz zu 35 % in Mäusen20; (3) HiPSC-RPE potenziert autologe Transplantation in der klinischen Behandlung von retinalen Erkrankungen des21. Dennoch, Tiermodelle sind nach wie vor unverzichtbar für ein Studium RPE Physiologie und Pathologie in einem live-System und die Onkogene Potential des HiPSC nicht zu übersehen.
Hier wird beschrieben, eine nützliche und mäßig einfach hPSC RPE Differenzierung-Protokolls, die für Forschung und klinische Zwecke verwendet werden können. Dieses Protokoll verwendet Nicotinamid (Vitamin B3) Differenzierung des hPSCs, Nervengewebe, erweitern die weitere induziert wird, in RPE zu unterscheiden durch die Behandlung mit Activin-A. Nicotinamid Behandlung ist gezeigt worden, die Zahl der pigmentierten Zellen (ein Zeichen der Differenzierung in RPE), möglicherweise durch mildernde die Aktivität Apoptotic Zellen22zu unterscheiden. Die resultierenden hPSC RPE-Zellen anzeigen die gleiche wichtige Marker, Kopfsteinpflaster Morphologie und zelluläre Funktionen als native menschlichen RPE Zellen22. Somit eignen sich inmitten der Forschung, die resultierenden hPSC RPE-Zellen für nachgeschaltete Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunostaining und ganze Zelle Patch Clamp, für die detaillierte experimentelle Verfahren sind ebenfalls vorhanden. RPE Zellen aus Stammzellen haben klinisch, großes Potenzial für die Transplantation Behandlung der Makula-Degeneration in tierexperimentellen Studien und Studien am Menschen23gezeigt.

<table><tbody><tr><td>Knock-Out (KO) DMEM</td><td>ThermoFisher 10829018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KO Serumersatz</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Activin-A</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (eine Modifikation)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1 Ergänzung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin-Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>Trijod-Thyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP</td> <td>AntikörperAbcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1 Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>Beta Aktin Antikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugierter Esel Anti-Maus ThermoFisher</td><td></td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus</td><td>IgG ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10 Patch-Clamp-Verstärker</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

differenzierung, wartung und analyse der menschlichen retina pigment epithelzellen: eine krankheit im gericht-modell für best1 mutationen

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Obwohl über 200 Genmutationen im menschlichen BEST1 gen identifiziert und mit degenerativen Netzhauterkrankungen verknüpft wurden, bleiben die pathologischen Mechanismen schwer vor allem aufgrund des Fehlens eines guten in Vivo -Modells für das Studium BEST1 und seine Mutationen unter physiologischen Bedingungen. BEST1 kodiert einen Ionenkanal, nämlich BESTROPHIN1 (BEST1), welche Funktionen im retinalen Pigmentepithel (RPE); jedoch ist der äußerst begrenzte Zugang zu nativen menschlichen RPE-Zellen eine große Herausforderung für die wissenschaftliche Forschung. Dieses Protokoll beschreibt die menschliche RPEs Lager BEST1 krankheitsauslösende Mutationen durch induzierte Differenzierung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) zu generieren. Da hPSCs selbst erneuerbar sind, dieser Ansatz erlaubt es den Forschern, eine stete Quelle der hPSC RPEs für verschiedene experimentelle Analysen, z. B. Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp, zu haben und bietet somit ein sehr leistungsfähiges Krankheit im Gericht-Modell für BEST1-retinale Bedingungen verbunden. Insbesondere kann diese Strategie angewendet werden, um RPE (Patho) Physiologie und andere Gene von Interesse, die nativ in RPE zu studieren.

Der technisch anspruchsvolle Schritt ist die manuelle Isolierung, deren Ziel es ist, eine hohe Reinheit einer differenzierten P0 hPSC-RPE Bevölkerung zu erreichen. Nach einem erfolgreichen Isolierung &gt; 90 % der Zellen in der P-0 -Bevölkerung werden wachsen und Reifen Signatur RPE Morphologien (Abbildung 1) angezeigt. Die Existenz des einen geringen Anteil von nicht-RPE oder unreif RPE-Zellen in der P-0 -Bevölkerung ist fast...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen tragen Patienten abgeleitet Mutationen zu unterscheiden. Die mutierten Zelllinien können für Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp verwendet werden. Dieser Krankheit im Gericht Ansatz umgeht die Schwierigkeit, native menschlichen RPE-Zellen.

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der ionenkanalbedingten Netzhauterkrankungen zu den molekularen Mechanismen von BEST1-Mutationen und der Pathologie von Bestrophinopathien zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Schwierigkeit umgeht, RPE-Zellen direkt vom Menschen zu gewinnen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Bestrophinopathien, einschließlich der Best-Krankheit, da die RPE-Zellen sowohl für Forschungszwecke als auch für Zellersatztherapien verwendet werden können.Wenn die hPSC-Kultur die Konfluenz erreicht, ersetzen Sie das Kulturmedium durch vier Milliliter Differenzierungsmedium pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Nach zweiwöchiger Kultivierung wird das Differenzierungsmedium mit 100 Nanogramm pro Milliliter humanem Activin-A ergänzt und das supplementierte Medium für weitere 14 Tage dreimal pro Woche gewechselt. Am Tag 29 wird für weitere acht bis 10 Wochen auf ein nicht supplementiertes Differenzierungsmedium umgestellt, bis pigmentierte RPE-Zellcluster auftreten.Um die pigmentierten RPE-Zellen zu isolieren, halten Sie zunächst einzelne neun Zoll große Pasteur-Glaspipetten

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die retinalen Pigment Epithelzellen (RPE) aus pluripotenten Stammzellen zu produzieren. Die Methode verwendet eine Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, um die Differenzierung von Stammzellen in unreifen RPE in vierzehn Tagen und Reifen, funktionale RPE nach drei Monaten zu lenken.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Der nicht-menschliche Primat (NHP) ist aufgrund der anatomischen und genetischen Ähnlichkeiten ein ideales Modell für die Untersuchung der zellulären Therapeutika der menschlichen Netzhaut. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation von retinalen Pigmentepithelzellen im NHP-Auge und Strategien zur Verhinderung intraoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit der Makulamanipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Hier präsentieren wir menschliche Zellkulturprotokolle zur Analyse von Translationsinitiationsfaktoren, die die 5'-Kappe von mRNA unter physiologischen Sauerstoffbedingungen binden. Diese Methode verwendet ein Agarose-gebundenes m7GTP Kappenanalogon und eignet sich zur Untersuchung von Kappenbindungsfaktoren und deren interagierenden Partnern.

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Lernen Sie die Differenzierung von menschlichen pluripotenten Stammzellen in retinale Pigmentepithelzellen für die Erforschung von BEST1-Mutationen und Bestrophinopathien. Diese Methode ermöglicht funktionelle Analysen und zellbasierte Therapieansätze.

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen (Video) | JoVE Journal

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

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