Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der ionenkanalbedingten Netzhauterkrankungen zu den molekularen Mechanismen von BEST1-Mutationen und der Pathologie von Bestrophinopathien zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Schwierigkeit umgeht, RPE-Zellen direkt vom Menschen zu gewinnen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Bestrophinopathien, einschließlich der Best-Krankheit, da die RPE-Zellen sowohl für Forschungszwecke als auch für Zellersatztherapien verwendet werden können.

Wenn die hPSC-Kultur die Konfluenz erreicht, ersetzen Sie das Kulturmedium durch vier Milliliter Differenzierungsmedium pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Nach zweiwöchiger Kultivierung wird das Differenzierungsmedium mit 100 Nanogramm pro Milliliter humanem Activin-A ergänzt und das supplementierte Medium für weitere 14 Tage dreimal pro Woche gewechselt. Am Tag 29 wird für weitere acht bis 10 Wochen auf ein nicht supplementiertes Differenzierungsmedium umgestellt, bis pigmentierte RPE-Zellcluster auftreten.

Um die pigmentierten RPE-Zellen zu isolieren, halten Sie zunächst einzelne neun Zoll große Pasteur-Glaspipetten horizontal über die Flamme eines Bunsenbrenners, etwa zwei Drittel entlang der Länge des dünnen Teils der Pipette. Wenn das erhitzte Glas weich wird, ziehen Sie die beiden Enden schnell auseinander, um am neuen Ende der Pipette eine mikroschaberartige Spitze zu bilden. Besprühen Sie die gezogenen Pipetten mit 70%Ethanol und lassen Sie sie in einer Zellkulturhaube an der Luft trocknen.

Wenn die Pipetten fertig sind, waschen Sie jede Vertiefung der Differenzierungskultur mit PBS und geben Sie einen Milliliter 0,05 % Trypsin, ergänzt mit einer Einheit Kollagenase pro Mikroliter, in jede Vertiefung. Nach 20 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius stoppen Sie den Aufschluss mit zwei Millilitern 37 Grad Celsius RPE-Medium pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und stellen Sie die Platte auf einen Mikroskoptisch. Klopfen Sie mit einer gezogenen Pipette vorsichtig auf die pigmentierten RPE-Cluster.

Sobald sich die Zellen vom Boden der Vertiefung lösen, verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Mikropipette, um dissoziierte Zellen in einzelne Vertiefungen einer neuen Zellkulturplatte mit RPE-Medium zu überführen. Wenn etwa 5.000 RPE-Zellen in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte gegeben wurden, erhöhen Sie das endgültige Volumen mit frischem RPE-Medium auf zwei Milliliter und kultivieren Sie die isolierten hPSC-RPE-Zellen für weitere sechs bis acht Wochen, bis eine Monoschicht aus pigmentierten und kopfsteinpflasterförmigen reifen RPE-Zellen beobachtet wird. Waschen Sie die pigmentierten Monolayer-Zellen 24 bis 72 Stunden vor der Patch-Klemme mit zwei Millilitern PBS und fügen Sie dann nach dem Entfernen des PBS einen Milliliter 0,05 % Trypsin plus eine Einheit pro Mikroliter Kollagenase zu den Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte für eine achtminütige Inkubationszeit bei 37 Grad Celsius hinzu.

Wenn sich die Zellen zu lösen beginnen, waschen Sie die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette vorsichtig vom Boden der Vertiefung und geben Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie einen Milliliter 37 Grad Celsius heiße Trypsin-Kollagenase-Lösung in die Vertiefung. Inkubieren Sie weitere acht Minuten bei 37 Grad Celsius, waschen Sie dann alle verbleibenden Zellen vom Boden der Vertiefung und kombinieren Sie die Zellsuspension mit demselben konischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Inkubieren Sie die Zellen acht Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Trockenbad und verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Mikropipette, um die Zellen 10 bis 15 Mal vorsichtig zu zerreiben. Nachdem Sie die Zellen zwei weitere Male inkubiert und verzerrt haben, geben Sie fünf Milliliter 37 Grad Celsius heißes RPE-Medium in die Einzelzellensuspension und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in dem für die Aussaat geeigneten Volumen auf vorbeschichtete Platten mit Deckgläsern bei 10 bis 20 % Konfluenz und führen Sie die Ganzzell-Patch-Klemmung gemäß den Standardprotokollen durch.

Nach erfolgreicher Isolierung sollten mehr als 90% der Zellen in der Passage-Null-Population reifen, um die charakteristische RPE-Zellmorphologie zu zeigen. Mit dem hPSC-RPE-basierten Disease-in-a-Dish-Ansatz kann jede patientenspezifische BEST1-Mutation umfassend auf ihre Proteinexpression, ihren Membrantransport und ihre Ionenkanalfunktion charakterisiert werden, um wichtige Informationen für die Aufklärung pathologischer RPE-Mechanismen zu erhalten. Es sollte beachtet werden, dass einige BEST1-Mutationen die Proteinexpression beeinflussen können, so dass auch andere gut etablierte RPE-Marker überprüft werden sollten.

Die Differenzierung humaner pluripotenter Stamm-RPE-Zellen dauert je nach humaner pluripotenter Stammzelllinie und Mutationstyp drei bis sechs Monate, und die Isolierung der differenzierten humanen pluripotenten Zellen kann in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Beim Versuch, die Zellen für die Patch-Klemme zu spalten, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen sehr sanft zu zerreiben, um einen übermäßigen Zelltod zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die 3D-RPE-Zellkultur durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie der Ionentransport auf den apikalen und basalen Membranen von RPE-Zellen durch BEST1-Mutationen beeinflusst wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher auf dem Gebiet der degenerativen Netzhauterkrankungen, um die physiologischen Phänotypen und pathologischen Mechanismen von patienteneigenen RPE-Zellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pluripotente Stammzellen in retinale Pigmentepithelzellen unterscheidet und die RPE-Zellen für die Ganzzell-Patch-Clamp vorbereitet.