Name: Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Lernen Sie die Ovarialgewebekultur zur Untersuchung von Follikelentwicklung, Ovulation und Atresie in Mäusen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung ovarialer Prozesse unter kontrollierten Bedingungen.

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Wir danken Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) für die Bereitstellung der Oog1pro3.9 Mäuse. Diese Forschung wurde von der JSPS (KAKENHI # JP15H06275) und der Nitto-Stiftung unterstützt.

Mäuse wurden in einem ökologisch kontrollierten Raum 23 ±1 ° C mit einem 12 h Licht/12 h dunklen Zyklus untergebracht. Tierbetreuung Protokolle und Experimente wurden gemäß den Richtlinien für Tier-Experimente an der Aichi Medical University durchgeführt und von der etablierten Tier Pflege und Nutzung Ausschuss angenommen wurden.
1. Vorbereitung des Kulturmediums und Gerichte
<ol><li>Fügen Sie um grundlegende Kulturmedium vorzubereiten, fetalen bovine Serum (FBS, 5 % V/V), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) und Penicillin-Streptomycin (Penicillin, 100 U/mL; Streptomycin, 100 mg/mL), minimale wesentliche mittlere Alpha (MEM-Alpha) und mischen in 50 mL Röhrchen. Hinweis: Gesamtvolumen der erforderlichen Nährmedien variieren zwischen Experimente, aber 1 mL Kulturmedium ist in der Regel ausreichend für 3,5 cm Glasboden Kultur Gerichte.</li>
	<li>Gießen Sie 1 mL Aliquote gemischte Kulturmedium in 3,5 cm Glasboden Kultur Gerichte und Gerichte eingelassen Sie statt 30 mm Zelle Kultur Einsätze. Wärmen Sie vor, Medien und Gerichte in einem Inkubator (5 % CO2 und 37 ° C).</li>
</ol>2. Vorbereitung von Eierstockgewebe
<ol><li>Pre-warme Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (−) und MEM-Alpha mit 5 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin im Inkubator (5 % CO2 und 37 ° C). Hinweis: Etwa 3 mL Aliquote von PBS (−) pro Eierstock sind ausreichend für den Einsatz im Eierstock Sezierungen, und 1 mL Aliquots der MEM-Alpha sind ausreichend für die vorübergehende Speicherung einzelner Eierstöcke in 3,5 cm Gerichte.</li>
	<li>
Verbrauchsteuern Sie Eierstöcke aus 4 - Wochen alten weiblichen ICR (benannt nach dem Institute of Cancer Research) Mäusen und trimmen Sie das Gewebe um den Eierstock mit Schere und Pinzette stereoskopische Mikroskop zu. Reservieren Sie die entfernten Eierstöcken in Kulturmedium (siehe Punkt 2.1) bis zur Verwendung.
	<ol>
<li>Statt einzelne Eierstöcke auf Filterpapier befeuchtet mit vorgewärmt PBS (−) (siehe Punkt 2.1) und in Scheiben schneiden in 4 Stücke, die mit einem Mikrotom Klinge unter dem stereoskopische Mikroskop. Hinweis: Eierstöcke der 4 - Wochen alten ICR Mäuse sind ca. 2 mm im Durchmesser. Die Anzahl der Stücke hängt von der Eierstock-Größe; etwa 500 µm Dicke Stücke erlauben jedoch für korrekte Follikel Beobachtungen (in Stücke dicker als 500 mm, Gewebe Transparenz wird verringert; in Stücke dünner als 500 mm, viele antrale Follikel sind gebrochen und verloren).</li>
		<li>Legen Sie nach Dissektion die in Scheiben geschnittenen Eierstock Exemplare in vorgewärmten Kulturmedium in 3,5 cm Gerichte (siehe Punkt 2.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Eierstock Gewebekultur
<ol><li>Fallen etwa 0,5 µL Kulturmedium pro geschnitten eierstockgewebe auf die Zelle Kultur einfügen wo werden die ovarielle Gewebe mit einer Mikropipette eingestellt.</li>
	<li>Platzieren Sie jedes geschnittene Muster zu einem Tropfen Kulturmedium auf die Zelle-Kultur-Einsätze mit einer Pinzette.</li>
	<li>Kultur der Eierstock-Gewebe in 5 % CO2 bei 37 ° C.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen vorgewärmten Medium alle 2 Tage. Hinweis: Der Zeitplan für mittlere Veränderungen für die Kultur der Eierstock Abschnitte von 4 - Wochen alten ICR Mäusen ist in Abbildung 1dargestellt.<ol>
<li>Für die Reproduktion den LH-Anstieg behandeln Sie kultivierten 4 - Wochen alten ICR Mäuse Eierstöcke mit dem Medium mit 100 mU/mL FSH und LH für 12 h alle 4 Tage (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Mikroskopaufnahmen kultivierten Eierstöcke
<ol><li>Starten Sie imaging die kultivierten Eierstöcke nach Tag 1 Wenn das Gewebe auf die Zelle Kultur Einsätze geklebt haben und konfokale oder umgekehrtes Mikroskop Analysen in 24 h Abständen ausreichend Follikelwachstums zwischen Zeitpunkten zu ermöglichen. Hinweis: Konfokale Mikroskopie ist besser als invertierte Mikroskopie zur Beobachtung von Follikeln in ganzen kultivierten Eierstöcke.</li>
</ol>(5) Zeitraffer Imaging kultivierten Eierstöcke
<ol><li>
Optimieren Sie die Time-Lapse imaging Bedingungen, einschließlich Laser-Intensitäten und Belichtungszeiten für die imaging-System (Tabelle 1).
	<ol>
<li>Wählen Sie gepaarten Eierstock Proben von einzelnen Mäusen für den Einsatz als Behandlung und Kontrollgruppen. Variieren Sie Laser Intensitäten und Belichtungszeit, die besten Bilder (Tabelle 1) zu erreichen.</li>
		<li>Vergleichen Sie Follikelwachstums unter jeder Bedingung Kultur durch die Messung der Follikel Bereiche in Bildern von Kontrollproben in 24-Stunden-Intervallen und in Zeitraffer bildgebenden Proben (siehe Schritt 6). Gleichzeitig die Anzahl der Eisprung Eizellen in jedem Eierstock-Satz und wählen Sie die optimale Zeitraffer imaging Bedingungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Aufnahmen Sie in 30 min Abständen mit Zeitraffer-imaging-System unter den festgelegten Bedingungen (Tabelle 1).</li>
</ol>(6) Follikel Wachstum Analyse
<ol><li>
Um die Entwicklung der Follikel zu analysieren, Messen Sie die Follikel Bereiche der aufgenommenen Bilder mit ImageJ-Software (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
<li>Zunächst legen Sie den Maßstab des Bildes durch Klicken auf "Set Scale" unter "Analysieren" in der Symbolleiste. Geben Sie die Seitenlängen der das aufgenommene Bild und der entsprechenden Anzahl von Pixel in die leeren Felder der "Bekannten Abstand" und "Abstand in Pixel", beziehungsweise.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Freie Hand" in der Symbolleiste und skizzieren Sie die Follikel in den erfassten Hellfeld-Bildern zu.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Messen" unter "Analysieren" in der Symbolleiste. Hinweis: Wenn andere Messdaten gewünscht werden, klicken Sie auf "Messung" unter "Analysieren" in der Werkzeugleiste, und überprüfen Sie die entsprechenden Felder in der Liste.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analyse der Entwicklung der Follikel mit transgenen Mäusen
<ol><li>Sammeln Sie Eierstöcke von postnatalen Tagen 0 und 4 (P0 und P4) weibliche Transgene Mäuse mit den transgenen Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherrund Kultur auf Einsätze wie in beschrieben Schritte 1.1 – 3.2, außer nicht Slice der P0 und P4 Eierstöcke.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen, vorgewärmten Medium in 3,5 cm Gerichte in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C alle 2 Tage. Hinweis: Die Konzentration von LH in das Kulturmedium P0 und P4 Eierstöcke kann konstant bleiben, weil LH Überspannungen in P0 und P4 Mäuse nicht vorkommen.</li>
	<li>Legen Sie das Mikroskop nur AcGFP1-positiven primären Follikel in kultivierten P4 Eierstöcken (Tabelle 1) zu visualisieren. Hinweis: Nur ursprüngliche und primäre Follikel sind in P4 weibliche Maus Eierstöcke.</li>
	<li>Die Aufnahmen der kultivierten P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry Transgene Mäuse Eierstöcke in 30 min Abständen mit den Einstellungen für P4 Eierstöcke (siehe Punkt 5.2).</li>
	<li>Verfolgen Sie und analysieren Sie Follikel Entwicklung mit AcGFP1 und H2B-mCHerry Signale.</li>
</ol>

<ol><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
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<li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice%3A+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li>
<li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive%2C+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie haben wir zwei neue Methoden für die Untersuchung der Entwicklung der Follikel in den Eierstöcken Maus entwickelt. Die erste Methode beinhaltet Kultur der geschnittenen Eierstock Erwachsener Mäuse Gewebe gefolgt von Analysen zur Entwicklung der Follikel, und die zweite beinhaltet die Verwendung von Time-Lapse imaging zu visualisieren, frühe Entwicklung der Follikel bei der Gonadotropin-unabhängig. Zuvor wir verwendet das vorliegende Eierstock Gewebekultur Verfahren zur Beurteilung der Wirkung von hemmend...

Weibliche Maus Eierstöcke enthalten mehrere tausend Follikel1und regelmäßigen Eisprung reift etwa zehn Eizellen bei jedem Brunst-Zyklus. Follikel sind in mehrere Entwicklungsstufen eingeteilt: Primordial, Primar-, Sekundar-, antral, und Graafian Follikel, abhängig von der Form der Granulosa zellulärer Ebene rund um jede Eizelle. Die meisten primordialfollikel ruhen, und einige von ihnen werden aktiviert und wachsen in primären Follikel bei jeder Östrus Zyklus2. Nach der sekundären follikuläre Phase ist Follikel Entwicklung vor allem von Gonadotropinen, follikuläre stimulierende Hormon (FSH) und Luteinisierendes Hormon (LH) geregelt. Jedoch ursprüngliche und primäre Follikel Entwicklung ist unabhängig von der Gonadotropin und Regulationsmechanismen, die diese Stufen Regeln bleiben schlecht Inderstood3,4,5. Die ursprüngliche und primäre Follikel ist zusätzlich Wachstumsfaktoren und Hormone die Interaktionen zwischen den Follikeln6,7geregelt. Daher wir Analysen der Follikel Dynamik in Maus Eierstock Gewebe durchgeführt, und die damit verbundenen Regulationsmechanismen mit Eierstockkrebs Gewebekulturen8,9,10untersucht.
Hier stellen wir zwei Eierstöcke Gewebekultur Modell Methoden. Die erste dient zur Follikel Entwicklung analysieren durch Messung der follikulären Bereiche, und die zweite wird verwendet, um den Regulierungsmechanismus in frühen Entwicklung der Follikel aus ur auf sekundäre Follikel Bühne mit transgenen Mäusen zu studieren. Für Follikel Entwicklungsanalyse benutzten wir hauptsächlich Eierstöcke der 4 - Wochen alten weiblichen Mäusen, weil sie für einfache Visualisierung der Follikel ermöglichen. Um regelmäßige Ovulation und Modellentwicklung in Vivo Follikel zu induzieren, reproduziert wir LH-Anstieg und beobachteten Eisprung Follikel Atresie und Sekretion von Estradiol Gewebekultur Bedingungen. Bilder der kultivierten Eierstöcke wurden gefangen genommen, und die Follikel Entwicklungsprozesse durch Rückverfolgung Veränderungen im Bereich follikulären analysiert wurden. Allerdings war die Unterscheidung zwischen ursprünglicher und frühen primären Follikel im Hellfeld Mikroskopieren Analysen, unklar. So wir entwickelten eine Methode, um kleine Follikel zu erkennen und zu unterscheiden zwischen dem ursprünglichen, primäre, und sekundäre Follikel in kultivierten ovariellen Gewebe mit Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 und R26-H2B-mCherry Transgene Mäuse Eierstöcke bei 0 und 4 Tage nach Geburt11. Oog1 Ausdruck ist nachweisbar in Eizellen nach Inkrafttreten der Meiose und allmählich mit der Entwicklung der Follikel, so dass Beobachtung des Übergangs vom ursprünglichen primären Follikel mit Zeitraffer-Bilder der kultivierten eierstockgewebe11 ,12. Obwohl morphologische Methoden verwendet wurden, um Faktoren zu untersuchen, die ruhende primordialfollikel13,14,15,16aktivieren, ist die Entwicklung der physiologischen Follikel in den Eierstöcken schwer zu beobachten, und die Effekte verschiedener Faktoren bleiben fußgelenkes. Die gegenwärtige Kulturmethoden wurden entwickelt, um diesen Mangel in Echtzeit Analysen Ziel Faktoren anzugehen.
In der vorliegenden Studie wir follikulären Entwicklung mit einem Zeitraffer bildgebenden Methode verfolgt und charakterisiert den Prozess der Entwicklung der Follikel. Unsere neuartigen Methoden bieten ein noch nie da gewesenen Instrument zur Erforschung der Physiologie der Eierstöcke.

<table><tbody><tr><td>Follikelstimulierendes Hormon aus der menschlichen Hypophyse</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Lutenisierendes Hormon aus der Hypophyse des Pferdes</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a, GlutaMax, ohne Nukleotide</td><td>Thermo Fisher</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>35mm Schale, Nr. 0 Deckglas, 10mm Glasdurchmesser</td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz</td><td>Merck Millipore PICM0RG50</td><td></td><td>Durchmesser: 315 mm, Porengröße: 0,4 mm, Material: hydrophil PTTE</td></tr><tr><td>3,5cm Zellkulturschalen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50ml / Zentrifugenröhrchen mit dreifacher Verschlusskappe</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>Low-Profile Einwegklingen 819</td><td>Leica</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>CellVoyager, CV1000</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td></td><td>Zeitrafferaufnahmen</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>KEYENCE</td><td></td><td>Zeitrafferaufnahmen</td></tr></tbody></table>

ovarian tissue culture phänomene in der maus eierstock zu visualisieren

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Säugetier-Frauen Eisprung in regelmäßigen Abständen eine nahezu konstante Anzahl von Eizellen bei jedem Brunst-Zyklus. Um solche Regelmäßigkeit und Häufigkeit zu erhalten, tritt die Verordnung auf die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse-Ebene und auf die Entwicklung der Follikel in den Eierstöcken. Trotz aktiven Studien sind Follikel Fördermechanismen nicht klar wegen der mehrere Schritte aus der ruhenden primordialen Follikel-Aktivierung zur Ovulation und aufgrund der Komplexität der Verordnung, die in jeder follikuläre Phase unterscheidet. Um die Mechanismen der Entwicklung der Follikel und die Dynamik der Follikel während des Östrus Zyklus zu untersuchen, entwickelten wir ein Mausmodell ovariellen Gewebe-Kultur, die verwendet werden, um die Entwicklung der Follikel mit einem Mikroskop zu beobachten. Systematische Follikel Entwicklung und regelmäßigen Eisprung Follikel Atresie können alle im kultivierten Eierstock Modell reproduziert werden, und die Kulturbedingungen experimentell moduliert werden können. Hier zeigen wir die Nützlichkeit dieser Methode in der Studie die regulatorischen Mechanismen der Entwicklung der Follikel und anderen Eierstock Phänomene.

Abbildung 1 zeigt das Protokoll für Änderungen in den Medien während der ovariellen Gewebe-Kultur. Nach diesem Programm 4 Wochen alten ICR Mäuse Eierstöcke wurden kultiviert und in 24-Stunden-Abständen mit konfokalen Mikroskopie (Abbildung 2) abgebildet. Während der Kultur der Eierstock Gewebe für 3 Wochen die meisten antral und sekundäre Follikel wurden durch Follikel Atresie degeneriert und einige waren Eisprung (<strong class=...

Eierstöcke Gewebekulturen als Modelle der Follikel Entwicklung, Eisprung und Follikel Atresie einsetzbar und regulatorische Mechanismen der Eierstöcke Dynamiken zeigen.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in der Eierstockforschung über Follikelentwicklung, Follikelatresie und Operation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Phänomene der Eierstöcke unter kontrollierten Kulturbedingungen für die Beobachtung in Echtzeit reproduzieren können. So bereiten Sie die Eierstöcke einer vier Wochen alten Maus des Institute of Cancer Research für die Kultur vor: Schneiden Sie mit Schere und Pinzette das umgebende Gewebe unter einem Stereomikroskop von den Eierstöcken ab und legen Sie die gereinigten Eierstöcke in eine Schale mit frischem Nährmedium.Wenn alle Eierstöcke beschnitten sind, übertragen Sie die einzelnen Eierstöcke auf ein mit 37 Grad Celsius PBS angefeuchtetes Stück Filterpapier und schneiden Sie jeden Eierstock mit einer Mikrotomklinge in vier Stücke. Übertragen Sie die Scheiben in eine 3,5 Zentimeter große Schale mit 37 Grad Celsius heißem Kulturmedium und geben Sie mit einer Mikropipette einen etwa 0,5 Mikrometer großen Tropfen Kulturmedium auf einen Zellkultureinsatz pro Eierstockgewebeschnitt. In einer zweiten 3,5 Zentimeter großen Zellkulturschale mit Glasboden, die einen Millimeter Medium enthält: Übertragen Sie mit einer Pinzette eine Gewebeprobe in jedes Tröpfchen und stellen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator.Ersetzen Sie den Überstand in der Schale alle zwei Tage durch frisches Nährmedium mit 37 Grad Celsius und behandeln Sie die Eierstöcke jeden vierten Tag 12 Stunden lang mit 100 Millieinheiten pro Milliliter FSH und LH. Beginnen Sie mit der Bildgebung der kultivierten Eierstöcke alle 24 Stunden nach einem Tag der Kultur, um ein ausreichendes Follikelwachstum zwischen den Bildgebungssitzungen zu ermöglichen. Aufnahme von Bildern im 30-Minuten-Takt mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem unter den entsprechenden experimentellen Bedingungen. So analysieren Sie die Entwicklung der Eierstockfollikel: Öffnen Sie die Bilder in ImageJ und öffnen Sie das Analysemenü, um die Skala einstellen auszuwählen.Geben Sie die Seitenlängen der aufgenommenen Bilder und die entsprechende Anzahl von Pixeln in die Felder "Bekannte Entfernung" bzw. "Entfernung in Pixel" ein. Verwenden Sie dann das Freihandwerkzeug, um die Follikel zu umreißen, und klicken Sie auf Messen. Während einer dreiwöchigen Kulturperiode in Eierstockgewebeschnitten werden die meisten antralen und sekundären Follikel durch Follikelatresie degeneriert, und einige haben einen Eisprung.Einige Follikel entwickeln sich während jedes LH-Anstiegszyklus in Gruppen. Während sich der Zeitpunkt des Eisprungs und die Anzahl der ovulierten Eizellen zwischen den Eierstöcken der Maus unterscheiden, erfolgt der Eisprung aus kultivierten Eierstöcken überwiegend innerhalb von 48 Stunden nach jedem LH-Anstieg. Beachten Sie, dass nicht alle ovulierten Eizellen nach dem Eisprung die ersten Polkörper freisetzen.Primordiale und primäre Follikel sind gleichzeitig in den Eierstöcken der Maus nach der Geburt am vierten Tag vorhanden. Während in den Eierstöcken nach der Geburt am Tag Null nur primordiale Follikel vorhanden sind. Primäre Follikel werden jedoch in kultivierten postnatalen Eierstöcken am Tag Null nach 30 bis 40 Stunden Kultur nachweisbar, wie gezeigt.Primordiale und primäre Follikel können auch in den kultivierten Eierstöcken, die aus mCherry-transgenen Tieren isoliert wurden, durch die mCherry-positiven Kerne von Granulosazellen unterschieden werden; Dies ermöglicht die Verfolgung der Follikelstadien in den Eierstockschnittkulturen. Ich hoffe, dass diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Reproduktionstechnologie den Weg ebnet, um neue Techniken für die Fruchtbarkeitsbehandlung zu erforschen.

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Dieses Protokoll beschreibt die Primärkultur / Co-Kultur von Maus-Eierstockgewebe, mit Eierstöcke von neugeborenen Mäusen und individuelle Eibläschen von präpubertären Mäusen. Die Kulturtechniken unterstützt Entwicklung in einer hoch physiologischer Weise ermöglicht Untersuchung der Wirkung von äußeren Mitteln an den Eierstöcken und der Wechselwirkungen zwischen Follikeln.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

In-vitro-Kultur der rindereigenen Ovarialrinde und die Wirkung der ernährungsphysiologischen Stair-Step-Diät auf die ovarielle Mikroumgebung wird vorgestellt. Eierstockkortexstücke wurden sieben Tage lang kultiviert und Steroide, Zytokine und Follikelstadien wurden bewertet. Die Stair-Step-Diätbehandlung hatte eine erhöhte Steroidogenese, was zu einer Follikelprogression in Kultur führte.

Gewebekultur der Rinderovariarinde

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Wir beschreiben Methoden zur Isolierung somatischer maus-ovarialer Zellen aus einem stroma-angereicherten Anteil des Eierstocks und zur Erzeugung maus-ovarialer somatischer Organoide mittels eines gerüstfreien Ansatzes.

Untersuchung des Ovarialmikroumfelds: Methoden zur Isolierung, 2D-Kultur und organoiden Kultur somatischer Maus-Ovarialzellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Bewertung der Proliferations-, Differenzierungs- und Gefäßbildungspotenziale vaskulärer endothelialer Stammzellen (VESCs) durch Mamma-Fett-Pad-Transplantation, gefolgt von einer ganzheitlichen Gewebepräparation für die mikroskopische Beobachtung. Eine Abstammungsstrategie zur Untersuchung des Verhaltens von VESCs in vivo wird ebenfalls vorgestellt.

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion mit konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus-Linien und mit Pfad-Inhibitoren für mechanistische Einsicht verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die Live-Bildgebung in anderen Entwicklungssystemen angepasst werden.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

Lernen Sie die Ovarialgewebekultur zur Untersuchung von Follikelentwicklung, Ovulation und Atresie in Mäusen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung ovarialer Prozesse unter kontrollierten Bedingungen.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

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