Name: Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung und Wiederherstellung von TRPV1 für spektroskopische Analysen mittels EPR- und DEER-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung konformationeller Änderungen bei der Aktivierung von Ionenkanälen.

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Wir sind sehr dankbar, Dr. H. Mchaourab für den Zugriff auf die EPR und Hirsche Spektrometer und Dr. T. Rosenbaum für die Bereitstellung der Full-Length Cystein-weniger TRPV1 Plasmid.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Aktuelle Technologien für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Membranproteine machten es möglich, ausreichende Mengen an Protein für spektroskopische Untersuchungen14,15,16,42zu erhalten. Hier haben wir diese Technologien, um auszudrücken, zu reinigen, rekonstruieren und spektroskopische Analysen in TRPV1 angepasst.
Unter den kritischen Schritten in das Protokoll ...

Mit den jüngsten Fortschritten in der Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) wurden Säugetier-Ion Kanalstrukturen zu einem außergewöhnlichen Preis gewonnen. Insbesondere haben strukturelle Studien Polymodal Ionenkanäle, wie z. B. die Transienten Rezeptor potential Vanilloid 1 (TRPV1), weitere Verständnis für seine Aktivierung Mechanismen1,2,3, zur Verfügung gestellt 4 , 5. dynamischer Informationen über Ionenkanäle in einer Membran-Umgebung eingebettet ist jedoch erforderlich, ihre Polymodal gating und Medikament-Bindung Mechanismen zu verstehen.
Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron Resonanz (Hirsch) Spectroscopies haben einige der am meisten definitive mechanistische Modelle für Ionen-Kanäle6,7,8,9 , zur Verfügung gestellt , 10 , 11 , 12 , 13. diese Ansätze wurden hauptsächlich beschränkt sich auf die Prüfung der prokaryotischen und Archeal Ion Kanäle, liefern eine große Menge an Waschmittel-gereinigte Proteine als bei Bakterien überexprimiert. Mit der Entwicklung der Eukaryoten Membran Proteine Produktion in Insekt und Säugerzellen für funktionelle und strukturelle Charakterisierung14,15,16ist es jetzt möglich, biochemische zu erhalten Mengen von Waschmittel-gereinigte Proteine für spektroskopische Untersuchungen.
Die EPR und Hirsche Signale ergeben sich aus ein Paramagneticspin Etikett (SL) (d.h. Methanethiosulfonate), ein Single-Cystein Rückstand in das Protein. Die Spin-Etiketten Berichten drei Arten von Strukturinformationen: Bewegung, Erreichbarkeiten und Entfernungen. Diese Informationen ermöglichen es, festzustellen, ob Rückstände innerhalb des Proteins liegen oder der Membran oder wässrigen Umgebung in die Apo und Liganden-gebundenen Staaten13,17,18,19ausgesetzt sind. Im Rahmen einer hochauflösenden Struktur (wenn vorhanden) bieten die EPR und Hirsch-Daten eine Auflistung von Einschränkungen für die Ableitung von dynamischer Models in ihrer natürlichen Umgebung während der Überwachung reversible gating Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Darüber hinaus konnte flexibele Regionen, die möglicherweise schwierig zu bestimmen, durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM abgerufen werden, mithilfe dieser ökologischen Datensätze zum Sekundärstrukturen sowie Lage innerhalb der Protein-20zuweisen. Cryo-EM Strukturen erhalten in Lipid-Nanodiscs zur Verfügung gestellt, wertvolle Informationen über die Anspritzung von Ionen-Kanäle3,21,22,23,24, 25; Spektroskopische Methoden könnte jedoch dynamischen Informationen von Konformationsänderungen Staaten (z.B. thermische Veränderungen) bieten, die möglicherweise schwer zu bestimmen, mit Cryo-EM.
Viele Schwierigkeiten müssen überwunden werden, um die EPR und Hirsch, einschließlich Mangel an Proteinfunktion, wenn Sie alle Cystein Rückstände (besonders reichlich in Säugetieren Kanälen), eiweißarme Ausbeute, Protein Instabilität während der Reinigung und nach Spin labeling entfernen umzusetzen , und Proteinaggregation in Spülmittel oder Liposomen. Hier haben wir Protokolle dieser kritischen Barrieren zu überwinden und haben informierten sich Rehe und EPR Spektren für ein Säugetier sensorischer Rezeptor ausgelegt. Hierbei ist es, Methoden zu beschreiben, denn der Ausdruck, Reinigung, Kennzeichnung und Wiederherstellung einer funktionellen minimal Cystein-weniger Ratte TRPV1 (eTRPV1) für spektroskopische Analysen zu konstruieren. Diese Methode eignet sich für diese Membranproteine, die halten ihre Funktion trotz der Entfernung von Cystein Rückstände oder Cystein bildet Disulfid-Bindungen enthalten. Diese Sammlung von Protokollen könnte für die spektroskopische Analyse von anderen Säugetieren Ionenkanälen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenese Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Rinderserum (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Amyloseharz</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin aus Sojabohnen</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus-Expressionssystem</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbentien&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten aus Borosilikatglas (3,5'') (Eizelleninjektion)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten aus Borosilikatglas (Oozytenaufnahmen)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (Dinatrium)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin Reagenz</td>, <td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr>, <tr><td>cellSens,</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr>, <tr><td>Kollagenase Typ 1</td>, <td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td>, <td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr>, <tr><td>D-(+)-Glukose</td>, <td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltose-Monohydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranosid)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Medium mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-PD-10-Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCR Cleanup</td><td>Kit Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfat</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillare (25 &; Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Glaskolben 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-Thio-B-Galactosid)</td><td></td><td>GoldBio.com I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe, Miller</td><td>Fisher BioReagenzien</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin-Hemisulfat</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher BioReagenzien</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonat</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Versiegelte Kapillare</td><td>VitroCom</td><td>Sonderbestellung</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM (Insektenzellmedium)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Zellen (SFM-angepasst)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Polarer Lipidextrakt aus Sojabohnen</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Erhöhung 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>GoldBio.com</td><td>Xenopus Eizellen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr> Hefe <tr><td> Extrakt</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack Chromatographiesäule</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Färbefreie Fertiggele</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Expressionsvektor</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Kompetente Zellen</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal Dichtstoff für Kapillarrohre</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Modell 3130XL Genetische Analysatoren</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung und wiederherstellung der trpv1 für spektroskopische analyse

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal Ionenkanäle transduzieren mehrere Reize unterschiedlicher Art in allosterische Änderungen; Diese dynamische Konformationen sind schwierig zu bestimmen und nach wie vor weitgehend unbekannt. Mit den jüngsten Fortschritten in einzelne Partikel Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Licht auf die strukturellen Merkmale der Agonist Bindungsstellen und Aktivierungsmechanismus mehrere Ionenkanäle ist das Bühnenbild für dynamische Tiefenanalyse der ihre Anspritzung Mechanismen mit spektroskopischen Methoden. Spektroskopische Techniken wie Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron-Resonanz (Hirsch) wurden vor allem auf das Studium der prokaryotischen Ionenkanäle beschränkt, die in großen Mengen gereinigt werden können. Die Voraussetzung für große Mengen von funktionalen und stabilen Membranproteinen hat das Studium der Säugetier-Ionenkanäle, die durch diese Ansätze behindert. EPR und Hirsch bieten viele Vorteile, einschließlich der Bestimmung der Struktur und dynamischen Veränderungen der mobilen Protein Regionen, wenn auch mit geringer Auflösung, der durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM zu schwierig sein könnte, und Überwachung, reversible Anspritzung Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Hier bieten wir Protokolle für den Erhalt der Milligramm funktionale Waschmittel solubilisiert Transienten Rezeptor potenzielle kation Unterfamilie V Kanalmitglied 1 (TRPV1), die EPR und Hirsche Spektroskopie bezeichnet werden kann.

Funktionelle Charakterisierung des minimalen Cystein-weniger TRPV1 konstruieren (eTRPV1) und Single-Cystein Mutanten
Der erste Schritt zur spektroskopischen Untersuchungen ist Ingenieur und Cystein-weniger Protein Konstrukte (Abbildung 2A), die sind funktionell und biochemische Mengen an Proteinen zu charakterisieren. eTRPV1 ist funktional wie von Ca2 + Bildgebung und TEVC (<strong class="xf...

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Hier im Labor glauben wir, dass die Verwendung eines spektroskopischen Ansatzes dazu beitragen kann, Schlüsselfragen in der Familie der transienten Rezeptorpotential-Ionenkanäle zu beantworten. Zum Beispiel die Bestimmung der dynamischen Informationsänderungen, die mit der polymodalen Aktivierung verbunden sind. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es Milligramm reinen und funktionsfähigen verbleibenden Ionenkanals für die Elektronen-Paramagnetresonanz und die Doppelelektronen-Elektronenresonanz-Epitroskopie ermöglicht.Diese Methode kann Aufschluss über die Konformationsänderungen geben, die mit dem thermischen und lichtunabhängigen Gating von 3B1 kompatibel sind. Es kann auch auf andere Auslösekanäle angewendet werden, wie z. B. 3B2. Beginnen Sie dieses Verfahren mit Design-Mutagenese-Primern mit Online-Tools.Bereiten Sie die PCR-Reaktion wie im Textprotokoll beschrieben vor und schleudern Sie die Mischung. Legen Sie die Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie die PCR-Mutagenese mit den im Textprotokoll aufgeführten PCR-Parametern durch. Geben Sie dann zwei Mikroliter DPN1-Enzym zur Reaktion hinzu und mischen Sie.Inkubieren Sie die Reaktionen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie als Nächstes die Transformation durch, indem Sie 75 Mikroliter aufgetaute E.Coli-kompetente Zellen und 10 Mikroliter DPN1-behandeltes PCR-Gemisch in ein vorgekühltes steriles 14-Milliliter-Röhrchen geben. Nach vorsichtigem Mischen die Reaktion 30 Minuten lang auf Eis inkubieren.Halten Sie das Röhrchen 45 Sekunden lang auf 42 Grad Celsius und legen Sie es dann sofort zwei Minuten lang auf Eis. Die Mischung auf eine LB-Agarplatte, die Carbenicillin enthält, aufbringen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Ernte einzelner Völker und der Vorbereitung über Nacht, wie im Textprotokoll beschrieben, werden die Kulturen über Nacht bei 8000 mal G für 10 Minuten heruntergeschleudert.Extrahieren Sie dann die DNA gemäß den Anweisungen der im Handel erhältlichen Mini-Präparationskits. Um das rekombinante Bacmid zu erzeugen, transformieren Sie 100 Mikroliter DH10bac E.Coli-kompetente Zellen mit 7,5 Nanogramm des rekombinanten Donorvektors. Die Vektoren enthalten das funktionelle minimale Cystein-freie Ratten-TRPV1, abgekürzt eTRPV1 und/oder einzelne Cystein-Mutanten.Nach der Aussaat und Inkubation von Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, wählen Sie weiße Kolonien mit einem Durchmesser von zwei Millimetern aus, da den blauen Kolonien das interessierende Insert fehlt. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um zu überprüfen, ob weiße Kolonien keine blauen Flecken enthalten. Ernten Sie mindestens drei Einzelvölker und geben Sie sie in ein 14-Milliliter-Sterilröhrchen mit vier Millilitern zugesetztem LB-Medium.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius bei 250 U/min. Nehmen Sie 1,5 Milliliter der Übernachtkulturen und isolieren Sie rekombinante Bacmid-DNA. Um das rekombinante Baculovirus zu erzeugen, werden eine Million SF9-Zellen in zwei Millimeter Insektenzellmedium getaucht.Lassen Sie die Zellen mindestens 45 Minuten lang anheften. Nachdem Sie einmal mit einem Milliliter frischem Medium gewaschen haben, entfernen Sie das Waschmedium und geben Sie die DNA-Transfektionsreagenzmischung in die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 27 Grad Celsius ohne Rühren.Nach der Inkubation die Transfektionsmischung entfernen und durch zwei Milliliter Insektenzellmedien ersetzen, die 0,5 % fötales Rinderserum enthalten. Inkubieren Sie die Zellen dann fünf Tage lang bei 27 Grad Celsius. Übertragen Sie das Zellkulturmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Isolieren Sie die erste Passage des Virusbestands, indem Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 8000 Mal G drehen. Den Überstand in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen und sofort bei vier Grad Celsius lagern. Von der zweiten Generation des Virusstocks pipettieren Sie eine 25-Milliliter-Suspensionskultur von Insektenzellmedien zu einer Million SF9-Zellen pro Milliliter, die 2 % FBS enthalten, in einen 125-Milliliter-Kolben.Geben Sie 25 Mikroliter des P1-Virus in die 25-Milliliter-Kultur. Inkubieren Sie die Kultur dann 72 Stunden lang bei 27 Grad Celsius. Um den P2-Virusstamm zu ernten, geben Sie die Kultur in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 8000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Füllen Sie den Überstand in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen um und lagern Sie ihn sofort bei vier Grad Celsius. Geben Sie einen Milliliter P2-Virusfond in die Ein-Liter-Kultur und inkubieren Sie sie 72 Stunden lang bei 27 Grad Celsius. Ernten Sie die Ein-Liter-Suspensionskultur für Insektenzellen, indem Sie sie 20 Minuten lang bei 4500 g bei vier Grad Celsius drehen.Wiegen Sie das Küvettenpellet. Es wird erwartet, dass es etwa sechs bis neun Gramm sein werden. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 25 Millilitern eiskaltem Puffer A in Gegenwart von Proteaseinhibitoren.Die Zellklumpen werden zu einer homogenen Suspension zerlegt und 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius gedreht. Brechen Sie die Zellen mit einem manuellen oder einem Hochdruck-Homogenisator auf. Nach der Entfernung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 8000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius sammelt man den Überstand und zentrifugiert erneut bei 100.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Membranpellet in einem Gesamtvolumen von 20 Millilitern eiskaltem Puffer B, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, suspendiert. Aliquotieren Sie 20 Milliliter Membransuspension auf 50 Milliliter Röhrchen. Um die Proteinreinigung durchzuführen, fügen Sie drei Milliliter DDM pro Röhrchen hinzu.Drehen Sie die Röhren zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Probe 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 100.000 Mal G zentrifugiert haben, sammeln Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter sauberes, feuchtes Amyloseharz hinzu. Drehen Sie die Mischung zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.Laden Sie dann das Protein-Amylose-Gemisch in Schwerkraftflusschromatographie-Säulen. Waschen Sie das proteingebundene Amyloseharz mit dem 10-fachen Bettvolumen des eiskalten Puffers C, gefolgt von 10 Bettvolumina des eiskalten Puffers D.Elute eTRPV1 Protein mit 0,5 Milliliterfraktionen bis zu fünf Millilitern eiskaltem entgastem Puffer D, ergänzt mit 20 Millimolar Maltose. Führen Sie die Waschungen und die Elution bei vier Grad Celsius durch.Mit einer Zentrifugalfiltereinheit mit einem Cutoff-Fassungsvermögen von 100 Kilodalton können die eTRPV1-haltigen Fraktionen für die Markierung auf zwei bis 2,5 Milligramm pro Milliliter konzentriert werden. Fügen Sie als Nächstes dem konzentrierten Protein einen zehnfachen molaren Überschuss an MTSSL-Spin-Markierung aus einer 100 millimolaren Stammlösung in DMSO hinzu. Wiederholen Sie dies zweimal alle 30 Minuten.Bewahren Sie die Reaktion eine Stunde und 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur auf, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius. Laden Sie dann die Spin-Markierung auf eTRPV1 auf eine Größenausschlusschromatographiesäule, die in Puffer E äquilibriert ist und von einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystem gesteuert wird. Sammeln Sie die Fraktionen, die eTRPV1-Tetramer enthalten.Trocknen Sie 10 Milligramm Asolectin mit einem Rotationsverdampfer eine Stunde lang unter Vakuum bei 40 Grad Celsius. Um Asolektin-Liposomen herzustellen, fügen Sie einen Milliliter Puffer F hinzu und beschallen Sie die Mischung 15 Minuten lang oder bis die Probe homogen ist. Destabilisieren Sie die Liposomen, indem Sie DDM bis zu einer Endkonzentration von zwei Millimolaren hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.Nachdem Sie die Mischung auf die DDM-kritische Myzelkonzentration eingestellt haben, wie im Textprotokoll beschrieben, verdoppeln Sie das Volumen der Protein-Liposomen-Mischung mit Puffer F. Entfernen Sie das Detergens, indem Sie nacheinander drei Aliquots von unpolaren Polystyrol-Absorptionskügelchen in einstündigen Abständen unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur hinzufügen. Laden Sie die Mischung auf einen Säulenfilter, um die Kügelchen zu entfernen, und übertragen Sie die Proteoliposomenmischung in ein Ultrazentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 100.000 mal G bei vier Grad Celsius.Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 30 Mikrolitern Puffer F resuspendiert, und dann spektroskopische Messungen und Analysen durchgeführt. Der erste Kontrollpunkt ist die funktionelle Analyse von Single-Cystein-Mutanten, bevor Expressions- und Aufreinigungsprotokolle durchgeführt werden. In dieser Arbeit wurden hek293-Zellen, die Wildtyp-TRPV1, eTRPV1 exprimieren, und Mutanten mittels Floreszenz-Calcium-Bildgebung auf Capsaicin-evozierte Reaktionen analysiert.Der zweite Kontrollpunkt ist die biochemische Charakterisierung von spin-markierten Einzelcystein-Mutanten durch Größenausschlusschromatographie, bevor mit der Rekonstitution und spektroskopischen Analyse fortgefahren wird. Der dritte Kontrollpunkt ist die funktionelle Charakterisierung von rekonstituierten, spinmarkierten Single-Cystein-Mutanten vor der spektroskopischen Analyse. Die Stromspannungsverhältnisse, die durch zwei Elektroden-Spannungsklemmen aus Xenopus-Eizellen bestimmt wurden, die mit Proteoliposomen mikroinjiziert wurden, die Spin mit der Bezeichnung A702C enthielten, wurden mit pH5 herausgefordert und durch Capsazepin blockiert.Schließlich ist es möglich, die Mobilitäten von spin-markierten eTRPV1-Mutanten zu ermitteln, die durch kontinuierliche Welle EPR bestimmt werden. Die ersten Derivatspektren werden für spin-markierte Cystein-Mutanten in DDM-Lösung gezeigt und in Asolektin-Liposomen rekonstituiert. Die Entfernungen und Mobilitäten von spinmarkierten eTRPV1-Mutanten in Detergenzien wurden ebenfalls von DEER bestimmt.Das Hirschecho und die Entfernungsverteilung der spinmarkierten Mutante E651C sind dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Ionenkanal von Säugetieren für die spektroskopische Analyse exprimiert, verschönert und rekonstituiert. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten aufgrund der mangelnden Proteinfunktion bei der Entfernung von Cysteinresten, der geringen Proteinausbeute und der Proteininstabilität entweder bei der Reinigung und nach der Spin-Markierung sowie der Proteinaggregation in Detergenzien oder Liposomen.Nach ihrer Entwicklung werden diese Protokolle es ermöglichen, Entfernungs- und dynamische Änderungen zu erhalten, um mechanistische Modelle für das polymodale TRPV1-Gating zu erforschen.

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca 2 +-Aequorin Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.

Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

Schlüsselschritte der Proteinfunktion, insbesondere Änderungen der Stützknochenkonformation und Protonentransferreaktionen, finden oft auf der Zeitskala von Mikrosekunden bis Millisekunden statt. Diese dynamischen Prozesse können mit der zeitaufgelösten Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie untersucht werden, insbesondere für Proteine, deren Funktion durch Licht ausgelöst wird.

Protonen-Transfer und Protein-Zustände Dynamics in Lichtempfindliche Proteine, die durch zeitaufgelöste Step-Scan Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Dieses Manuskript beschreibt, wie (Einzelmoleküle) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Assays durchgeführt werden, um die Bindungsdynamik zwischen T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) und antigenen, peptidbeladenen MHC-Molekülen zu messen, wie sie in der immunologischen Synapse einer T-Zelle in Kontakt mit einer funktionalisierten planar gestützten Lipiddoppelschicht auftreten.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Erfahren Sie die Reinigung und Wiederherstellung von TRPV1 für spektroskopische Analysen mittels EPR- und DEER-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung konformationeller Änderungen bei der Aktivierung von Ionenkanälen.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

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