Name: Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung und Wiederherstellung von TRPV1 für spektroskopische Analysen mittels EPR- und DEER-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung konformationeller Änderungen bei der Aktivierung von Ionenkanälen.

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Wir sind sehr dankbar, Dr. H. Mchaourab für den Zugriff auf die EPR und Hirsche Spektrometer und Dr. T. Rosenbaum für die Bereitstellung der Full-Length Cystein-weniger TRPV1 Plasmid.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Aktuelle Technologien für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Membranproteine machten es möglich, ausreichende Mengen an Protein für spektroskopische Untersuchungen14,15,16,42zu erhalten. Hier haben wir diese Technologien, um auszudrücken, zu reinigen, rekonstruieren und spektroskopische Analysen in TRPV1 angepasst.
Unter den kritischen Schritten in das Protokoll ...

Mit den jüngsten Fortschritten in der Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) wurden Säugetier-Ion Kanalstrukturen zu einem außergewöhnlichen Preis gewonnen. Insbesondere haben strukturelle Studien Polymodal Ionenkanäle, wie z. B. die Transienten Rezeptor potential Vanilloid 1 (TRPV1), weitere Verständnis für seine Aktivierung Mechanismen1,2,3, zur Verfügung gestellt 4 , 5. dynamischer Informationen über Ionenkanäle in einer Membran-Umgebung eingebettet ist jedoch erforderlich, ihre Polymodal gating und Medikament-Bindung Mechanismen zu verstehen.
Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron Resonanz (Hirsch) Spectroscopies haben einige der am meisten definitive mechanistische Modelle für Ionen-Kanäle6,7,8,9 , zur Verfügung gestellt , 10 , 11 , 12 , 13. diese Ansätze wurden hauptsächlich beschränkt sich auf die Prüfung der prokaryotischen und Archeal Ion Kanäle, liefern eine große Menge an Waschmittel-gereinigte Proteine als bei Bakterien überexprimiert. Mit der Entwicklung der Eukaryoten Membran Proteine Produktion in Insekt und Säugerzellen für funktionelle und strukturelle Charakterisierung14,15,16ist es jetzt möglich, biochemische zu erhalten Mengen von Waschmittel-gereinigte Proteine für spektroskopische Untersuchungen.
Die EPR und Hirsche Signale ergeben sich aus ein Paramagneticspin Etikett (SL) (d.h. Methanethiosulfonate), ein Single-Cystein Rückstand in das Protein. Die Spin-Etiketten Berichten drei Arten von Strukturinformationen: Bewegung, Erreichbarkeiten und Entfernungen. Diese Informationen ermöglichen es, festzustellen, ob Rückstände innerhalb des Proteins liegen oder der Membran oder wässrigen Umgebung in die Apo und Liganden-gebundenen Staaten13,17,18,19ausgesetzt sind. Im Rahmen einer hochauflösenden Struktur (wenn vorhanden) bieten die EPR und Hirsch-Daten eine Auflistung von Einschränkungen für die Ableitung von dynamischer Models in ihrer natürlichen Umgebung während der Überwachung reversible gating Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Darüber hinaus konnte flexibele Regionen, die möglicherweise schwierig zu bestimmen, durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM abgerufen werden, mithilfe dieser ökologischen Datensätze zum Sekundärstrukturen sowie Lage innerhalb der Protein-20zuweisen. Cryo-EM Strukturen erhalten in Lipid-Nanodiscs zur Verfügung gestellt, wertvolle Informationen über die Anspritzung von Ionen-Kanäle3,21,22,23,24, 25; Spektroskopische Methoden könnte jedoch dynamischen Informationen von Konformationsänderungen Staaten (z.B. thermische Veränderungen) bieten, die möglicherweise schwer zu bestimmen, mit Cryo-EM.
Viele Schwierigkeiten müssen überwunden werden, um die EPR und Hirsch, einschließlich Mangel an Proteinfunktion, wenn Sie alle Cystein Rückstände (besonders reichlich in Säugetieren Kanälen), eiweißarme Ausbeute, Protein Instabilität während der Reinigung und nach Spin labeling entfernen umzusetzen , und Proteinaggregation in Spülmittel oder Liposomen. Hier haben wir Protokolle dieser kritischen Barrieren zu überwinden und haben informierten sich Rehe und EPR Spektren für ein Säugetier sensorischer Rezeptor ausgelegt. Hierbei ist es, Methoden zu beschreiben, denn der Ausdruck, Reinigung, Kennzeichnung und Wiederherstellung einer funktionellen minimal Cystein-weniger Ratte TRPV1 (eTRPV1) für spektroskopische Analysen zu konstruieren. Diese Methode eignet sich für diese Membranproteine, die halten ihre Funktion trotz der Entfernung von Cystein Rückstände oder Cystein bildet Disulfid-Bindungen enthalten. Diese Sammlung von Protokollen könnte für die spektroskopische Analyse von anderen Säugetieren Ionenkanälen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenese Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Rinderserum (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Amyloseharz</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin aus Sojabohnen</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus-Expressionssystem</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbentien&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten aus Borosilikatglas (3,5'') (Eizelleninjektion)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten aus Borosilikatglas (Oozytenaufnahmen)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (Dinatrium)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin Reagenz</td>, <td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr>, <tr><td>cellSens,</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr>, <tr><td>Kollagenase Typ 1</td>, <td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td>, <td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr>, <tr><td>D-(+)-Glukose</td>, <td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltose-Monohydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranosid)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Medium mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-PD-10-Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCR Cleanup</td><td>Kit Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfat</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillare (25 &; Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Glaskolben 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-Thio-B-Galactosid)</td><td></td><td>GoldBio.com I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe, Miller</td><td>Fisher BioReagenzien</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin-Hemisulfat</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher BioReagenzien</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonat</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Versiegelte Kapillare</td><td>VitroCom</td><td>Sonderbestellung</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM (Insektenzellmedium)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Zellen (SFM-angepasst)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Polarer Lipidextrakt aus Sojabohnen</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Erhöhung 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>GoldBio.com</td><td>Xenopus Eizellen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr> Hefe <tr><td> Extrakt</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack Chromatographiesäule</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Färbefreie Fertiggele</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Expressionsvektor</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Kompetente Zellen</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal Dichtstoff für Kapillarrohre</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Modell 3130XL Genetische Analysatoren</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung und wiederherstellung der trpv1 für spektroskopische analyse

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal Ionenkanäle transduzieren mehrere Reize unterschiedlicher Art in allosterische Änderungen; Diese dynamische Konformationen sind schwierig zu bestimmen und nach wie vor weitgehend unbekannt. Mit den jüngsten Fortschritten in einzelne Partikel Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Licht auf die strukturellen Merkmale der Agonist Bindungsstellen und Aktivierungsmechanismus mehrere Ionenkanäle ist das Bühnenbild für dynamische Tiefenanalyse der ihre Anspritzung Mechanismen mit spektroskopischen Methoden. Spektroskopische Techniken wie Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron-Resonanz (Hirsch) wurden vor allem auf das Studium der prokaryotischen Ionenkanäle beschränkt, die in großen Mengen gereinigt werden können. Die Voraussetzung für große Mengen von funktionalen und stabilen Membranproteinen hat das Studium der Säugetier-Ionenkanäle, die durch diese Ansätze behindert. EPR und Hirsch bieten viele Vorteile, einschließlich der Bestimmung der Struktur und dynamischen Veränderungen der mobilen Protein Regionen, wenn auch mit geringer Auflösung, der durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM zu schwierig sein könnte, und Überwachung, reversible Anspritzung Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Hier bieten wir Protokolle für den Erhalt der Milligramm funktionale Waschmittel solubilisiert Transienten Rezeptor potenzielle kation Unterfamilie V Kanalmitglied 1 (TRPV1), die EPR und Hirsche Spektroskopie bezeichnet werden kann.

Funktionelle Charakterisierung des minimalen Cystein-weniger TRPV1 konstruieren (eTRPV1) und Single-Cystein Mutanten
Der erste Schritt zur spektroskopischen Untersuchungen ist Ingenieur und Cystein-weniger Protein Konstrukte (Abbildung 2A), die sind funktionell und biochemische Mengen an Proteinen zu charakterisieren. eTRPV1 ist funktional wie von Ca2 + Bildgebung und TEVC (<strong class="xf...

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Hier im Labor glauben wir, dass die Verwendung eines spektroskopischen Ansatzes dazu beitragen kann, Schlüsselfragen in der Familie der transienten Rezeptorpotential-Ionenkanäle zu beantworten. Zum Beispiel die Bestimmung der dynamischen Informationsänderungen, die mit der polymodalen Aktivierung verbunden sind. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es Milligramm reinen und funktionsfähigen verbleibenden Ionenkanals für die Elektronen-Paramagnetresonanz und die Doppelelektronen-Elektronenresonanz-Epitroskopie ermöglicht.Diese Methode kann Aufschluss über die Konformationsänderungen geben, die mit dem thermischen und lichtunabhängigen Gating von 3B1 kompatibel sind. Es kann auch auf andere Auslösekanäle angewendet werden, wie z. B. 3B2. Beginnen Sie dieses Verfahren mit Design-Mutagenese-Primern mit Online-Tools.Bereiten Sie die PCR-Reaktion wie im Textprotokoll beschrieben vor und schleudern Sie die Mischung. Legen Sie die Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie die PCR-Mutagenese mit den im Textprotokoll aufgeführten PCR-Parametern durch. Geben Sie dann zwei Mikroliter DPN1-Enzym zur Reaktion hinzu und mischen Sie.Inkubieren Sie die Reaktionen 30 Minuten lang

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca 2 +-Aequorin Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.

Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

Schlüsselschritte der Proteinfunktion, insbesondere Änderungen der Stützknochenkonformation und Protonentransferreaktionen, finden oft auf der Zeitskala von Mikrosekunden bis Millisekunden statt. Diese dynamischen Prozesse können mit der zeitaufgelösten Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie untersucht werden, insbesondere für Proteine, deren Funktion durch Licht ausgelöst wird.

Protonen-Transfer und Protein-Zustände Dynamics in Lichtempfindliche Proteine, die durch zeitaufgelöste Step-Scan Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Dieses Manuskript beschreibt, wie (Einzelmoleküle) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Assays durchgeführt werden, um die Bindungsdynamik zwischen T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) und antigenen, peptidbeladenen MHC-Molekülen zu messen, wie sie in der immunologischen Synapse einer T-Zelle in Kontakt mit einer funktionalisierten planar gestützten Lipiddoppelschicht auftreten.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Erfahren Sie die Reinigung und Wiederherstellung von TRPV1 für spektroskopische Analysen mittels EPR- und DEER-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung konformationeller Änderungen bei der Aktivierung von Ionenkanälen.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

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