Name: Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Reinigung von TET2-Dioxygenase mittels Ionenaustauschchromatographie und die LC-MS/MS-basierte Aktivitätsanalyse für epigenetische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung normaler und klinischer TET2-Mutationen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Forschung wurde finanziert durch das US Department of Defense in Form eines Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastischer Anämie & MDS Foundation Grant, und UMRB Grant, M.M. Authors Danke Mohit Jaiswal und Subhradeep Bhar für erste Klonen von TET2 in pDEST14 Vektor.

1. Klonen und Reinigung des unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase
<ol><li>Klonen Sie menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) in den pDEST14-Ziel-Vektor mit der ortsspezifische Rekombination Technik wie zuvor beschrieben22. Hinweis: Frühere Studien haben gezeigt, dass die C-terminale TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) Domäne der minimalen katalytisch aktiven Domain21,23. Um die unmarkierten TET2 Dioxygenase Domäne mithilfe des pDONR221-Vektors auszudrücken, Flossen Shine-Dalgarno und Kozak-Sequenzen in der forward Primer während der PCR (Tabelle 1).</li>
	<li>Für bakterielle Transformation hinzufügen 1 µL des rekombinanten pDEST14 Expressionsvektor mit unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843), 100 µL chemisch kompetenten E. Coli BL21 (DE3) Zellen in einer 1,7 mL Tube. Halten Sie die Mischung auf dem Eis für mindestens 15 Minuten, gefolgt durch einen Hitzeschock bei 42 ° C für 30 s in einem Wasserbad.<ol>
<li>Sofort nach der Hitzeschock halten Sie die Zellen wieder auf Eis für mindestens 2 Minuten. Im Anschluss daran fügen Sie 250 µL super optimale Brühe mit Catabolite Repression (S.O.C Medien ein) in Zellen Inkubieren Sie die Bakterienzellen für 1 h bei 37 ° C in einen Shaker geben.</li>
		<li>Nach der Inkubation spin-down der Zellen durch Zentrifugieren der Röhre bei 9.000 x g für 1 min. verwerfen 70 % Überstand durch pipettieren und das Pellet in Links über Medien zu lösen.</li>
		<li>Die Zellsuspension auf eine Luria Brühe (LB) Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin zu verbreiten. Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie und in 10 mL LB-Ampicillin Medien in ein 50 mL-Tube zu impfen. Über Nacht inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Shaker. Im Anschluss daran verwenden Sie 100 µL der Kultur aus der 50 mL Tube 100 mL LB Ampicillin Medien zu impfen. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker mit 180 u/min und verwenden Sie es als Primärkultur. Verwenden Sie am nächsten Tag 6 mL Primärkultur impfen 15 Flaschen, jede mit 600 mL LB Ampicillin-Medien. Jetzt, inkubieren Sie 15 Flaschen bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker mit 180 u/min. Hinweis: Führen Sie für die Überprüfung der transformierten Klone, DNA-Sequenzierung oder Einschränkung Verdauung mit isolierter Plasmid DNA.</li>
	<li>Prüfen Sie die Dichte der Bakterienkultur, Messen Sie die OD600 mit einem Spektralphotometer. Nachdem die Kultur eine Dichte von 0,8 bei OD600erreicht, induzieren die Expression von TET2-Protein mit 300 µL 1 M (Endkonzentration von 0,5 mM in 600 mL) IPTG in jedem Kolben und weiteres Wachstum der Kultur für 16 h bei 17 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie nach 16 h die Bakterienkultur auf Zentrifuge Flaschen. Zentrifugieren Sie der Bakterienkultur mit dem Ausdruck TET2 Enzym bei 5.250 x g für 45 min. Einsatz der bakteriellen Pellets für TET2 Reinigung. Hinweis: Führen Sie alle verbleibenden Protein Reinigungsschritte auf dem Eis oder bei 4 ° C.</li>
	<li>Aufschwemmen der bakterielle Pellet in 100 mL 50 mM MES (2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure)-Puffer, pH 6 und 5 × 30 s bei Leistung 20 mit 60 s Kühlung Abständen beschallen.</li>
	<li>Spin lysate 5.250 x g für 45 min. sammeln den überstand enthält lösliche TET2 Enzym und durchlaufen 0,45-µm Filter vor dem Verladen auf einem FPLC-System. Hinweis: In diesen Experimenten wurde die TET2 Enzym sehr stabil, aber ggf. eine Protease Inhibitor cocktail mit 1 mM Benzamidine-HCl, 1 mM Phenylmethylsulphonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mM 1,10 -o- Phenanthroline zugesetzt werden, um die Zelle lysate Abbau von TET2 Enzym verhindert. Vermeiden Sie die Verwendung von EDTA oder EGTA in der Inhibitor cocktail, als diese die folgenden KATIONENAUSTAUSCH Chromatographie stören können.</li>
	<li>30 mL Pack von einem starken kationenaustauschermembran Harz in einem FPLC Spalte. Equilibrate der Spalte mit 10 bettvolumen von Waschpuffer (50 mM-MES-Puffer, pH 6) bei konstantem Volumenstrom von 0,3 mL/min mit einem FPLC-System.</li>
	<li>Laden Sie die geklärte lysate auf Pre äquilibriert Spalte und Waschen mit ∼10 bettvolumen von Waschpuffer bis der Durchfluss deutlich wird.</li>
	<li>TET2 eluieren mit einem 0-100 % Steigung aus den Waschpuffer auf den Puffer, Elution (50 mM-MES-Puffer, pH 6, 1 M NaCl) in 15 bettvolumen gefolgt von zu 100 % Elution Buffer für zwei bettvolumen Betrieb. Hinweis: Proben (100 µL) Zelle lysate, vor und nach der Spalte laden zusammen mit allen Fraktionen der Elution sammeln und analysieren auf 10 % Lösung von SDS-PAGE.</li>
	<li>Pool mit TET2 Protein Fraktionen, Einfrieren trocken, Auflösen von Enzym-Palette in 10 mL Wasser und speichern bei-80 ° C.</li>
</ol>2. 5mC Oxidation von TET2-Dioxygenase
<ol><li>Führen Sie alle Demethylierung Reaktionen in dreifacher Ausführung mit 3 µg des Substrats (25-Mer Doppel stranded DNA, Tabelle 2).<ol>
<li>Fügen Sie 100 µg des gereinigten TET2 Enzym in 50 µL der gesamten Reaktion Puffer mit 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-Oxoglutarate/α-Ketoglutarate), und 2 mM Ascorbat und Inkubation bei 37 ° C für 1 h21.</li>
		<li>TET2 katalysierte Oxidationsreaktionen mit 5 µL von 500 mM EDTA zu stillen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem abschrecken TET2 Reaktionen bereiten Sie Proben für LC-MS/MS-Analyse durch die Trennung der DNS von TET2 Reaktionsgemisch Oligo Reinigung Spalten verwenden vor.<ol>
<li>100 µL der Oligo Bindung Puffer zu 55 µL abgeschreckt Reaktion hinzufügen.</li>
		<li>Im Anschluss daran fügen Sie 400 µL 100 % Ethanol zu der Mischung hinzu. Übergeben Sie diese Mischung durch eine Oligo-Bindung-Spalte.</li>
		<li>Waschen der gebundenen DNA mit 750 µL Waschpuffer und eluieren in 20 µL Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdauen die isolierte DNA mit 2 Einheiten der DNase I und 60 Einheiten der S1 Nuklease bei 37 ° C für 12 h, individuelle Nukleosid-Monophosphates zu produzieren.</li>
	<li>Fügen Sie nach Verdauung 2 Einheiten von Kalb Darm alkalische Phosphatase (CIAP) in den Proben und inkubieren Sie Ergänzung 12 h bei 37 ° C zu terminal Phosphatgruppen von Nukleosid-Monophosphates Nukleoside zu entfernen.</li>
	<li>Alle Nukleoside, speziell modifizierte Cytosines, unter Verwendung der unten beschriebenen LC-MS/MS-Methode zu quantifizieren.</li>
</ol>3. quantitative LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung
<ol><li>Bereiten Sie 100 µM-Stammlösung von allen geänderten Cytosin Nukleoside [5-Methyl-2 '-Deoxycytidine (5mdC), 5-Hydroxymethyl-2 '-Deoxycytidine (5hmdC), 5-Formyl-2 '-Deoxycytidine (5fdC) und 5-Carboxy-2 '-Deoxycytidine (5cadC)] und normale DNA Basen (Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) in HPLC-Grade Wasser für die Entwicklung der LC-MS/MS-Methode.</li>
	<li>Optimierung von Nukleosid-MS/MS Parameter durch Infusion Stammlösungen, einzeln nacheinander, im Massenspektrometer mit einer Durchflussrate von 10 µL/min in EMS scan-Modus. Nach Parametern optimieren: Declustering potenzielle (DP), potenzielle Eingang (EP) Kollision Zelle Eingang potenzielle (CEP), Kollision Energie (CE) und Kollision Zelle Ausfahrt potenzielle (CXP) für jede DNA-Nukleosid mit quantitative Optimierung automatisierte Funktion der Software.</li>
	<li>Quelle-MS/MS Parameter durch Injektion 10 µL der Stammlösung mit einem Farbverlauf mit 25 % Lösungsmittel B mit einer Durchflussrate von 0,3 mL/min wo Lösungsmittel A 10 mM Ammoniumacetat (pH 4,0) und Lösungsmittel B ist 20 % Acetonitril mit 10 mM Ammoniumacetat (pH 4,0) zu optimieren. Optimierung nach Parametern: Vorhang Gas (CUR): 10-50, Temperatur: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, Collisionally aktiviert Dissoziation (CAD): niedrig, Mittel, hoch, Ion Sprühen Spannung (IS): 4000-5500 für jede DNA-Nukleosid mit Handbuch quantitative Optimierungsfunktion der Software im FIA (Injektion Strömungsanalyse) Modus.</li>
	<li>Um alle acht DNA Nukleoside zu trennen, führen Flüssigchromatographie mit folgenden Farbverlauf: 0 % Lösungsmittel B (0-2 min), 0-20 % Lösungsmittel B (2-5 min), 20-60 % Lösungsmittel B (5-9 min), 60-0 % Lösungsmittel B (9-10 min) und dann mit Lösungsmittel A für 5 min bei einer Durchflussmenge von 0,3 equilibrate mL/min auf einer C18-Säule (Partikelgröße: 5 µm, Pore Größe: 120 Å).</li>
	<li>Mit der optimalen Parameter der MS/MS (Schritt 3.2 und 3.3) in Verbindung mit den oben genannten Flüssigkeitschromatographie Farbverlauf (Schritt 3.4), bestimmen die Antwort Linearität der Nachweisgrenze (LOD) und untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) mit einem zweifach serielle Verdünnung einer 100 µM standard Mischung enthält alle acht Nukleoside. Standardkurven für alle acht DNA Nukleoside zu zeichnen.</li>
	<li>Erkennung und Quantifizierung der alle Nukleoside, speziell modifizierte Cytosines in Schritt 2.4 mit der LC-MS/MS-Methode und Standardkurven produziert.</li>
</ol>

<ol><li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+landscapes%3A+provocative+insights+from+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905(2013).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26030523">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li>
<li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21030644">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li>
<li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li>
<li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li>
<li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron%28II%29%2Falpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li>
<li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins%2C+but+indicates+no+definite+prognostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li>
<li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-Eleven-Translocation+2+%28TET2%29+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li>
<li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+expression%2C+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+expression+and+purification%22%5BJournal%5D)">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li>
<li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li>
<li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2001/cc/b101039p#!divAbstract">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li>
<li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li>
<li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28813683">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen zu erklären.

Mutationen im TET2-gen sind einige der am häufigsten gefundenen genetischen Veränderungen bei Patienten mit unterschiedlichen hämatopoetischen Malignome. Bis heute hunderte von verschiedenen TET2 Mutationen, darunter Unsinn, Frame-Shift und Missense-Mutationen wurden in Patienten12identifiziert. Patienten mit TET2 Mutationen zeigen niedrige Konzentrationen von genomischen 5hmC im Knochenmark, im Vergleich zu denen mit wt-TET214. Mutierte TET2 Knock-in Expe...

Die C5-Position von Cytosin-Basen innerhalb von CpG dinucleotid ist die vorherrschende Methylierung-Website (5mCpG) in Säugetier-Genome1. Eine Reihe neuerer Studien haben darüber hinaus umfangreiche C5 Cytosin Methylierung (5mC) in nicht-CpG Websites entdeckt (5mCpH, wo H = A, T, oder C)2,3. 5mC Änderung dient als transkriptioneller Schalldämpfer bei endogenen Retrotransposons und Gen Promotoren3,4,5. DNA-Methylierung bei 5mC spielt auch eine wichtige Rolle im x-Chromosom Inaktivierung, gen Prägung, nukleare Neuprogrammierung und gewebespezifische Gen Ausdruck5,6,7. Methylierung von Cytosin an der C5-Position erfolgt durch DNA-Methyltransferasen und Mutationen in diesen Enzymen verursachen erhebliche Entwicklungsschäden8. Die Entfernung von 5mC Marken werden von TET1-3 5mC oxidasen9,10initiiert. Diese Dioxygenases TET-Familie wandeln 5mC in 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-FU) und 5-Carboxylcytosine (5caC) durch sequentielle Oxidation Schritte11,12,13. Schließlich ersetzt Thymin-DNA-Glycosylase 5fC oder 5caC zu unveränderten Cytosin mit base Excision Repair Weg11.
Das menschliche Gen TET2 wurde als ein häufig mutierte Gen in vielfältigen hämatopoetischen Malignome einschließlich myelodysplastischen Syndromen (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative Neoplasmen (identifiziert. MDS-MPN), und akute myeloische Leukämie (AML) aus MDS und MDS-MPN16. Die Höhe der 5hmC Änderung im Knochenmark DNA sind niedriger bei Patienten mit TET2 Mutationen im Vergleich zu denen mit Wildtyp (wt)-TET214. Eine Anzahl von Gruppen entwickelten TET2-Knockout-Maus-Modellen um ihre Rolle bei der normalen Hämatopoese und myeloischer Transformation17,18,19,20zu erhellen. Diese Mäuse mit Mutationen im TET2-gen wurden zunächst normal und lebensfähig, aber vielfältige hämatopoetischen Malignome manifestiert, als sie im Alter von ihrem frühen Tod verursacht. Diese Studien zeigten die wichtige Rolle der wt-TET2 in normaler Hämatopoetischer Differenzierung. Diese Maus-Modellen, die heterozygot Hämatopoetischen Stammzellen (TET2+ / HSCs) und homozygot TET2- / - hatte HSCs einen Wettbewerbsvorteil gegenüber homozygot wt-TET2 HSCs in repopulating hämatopoetische Linien als beide TET2+ /- und TET2- / - Hsz entwickelt vielfältige hämatopoetischen Malignome17,18. Diese Studien zeigen, dass Haploinsufficiency von TET2 Dioxygenase verändert die Entwicklung von Hsz und hämatopoetische Tumoren führt.
Ähnlich wie Mäuse mit Mutationen im TET2-gen, die meisten Leukämie-Patienten manifestieren Haploinsufficiency TET2 Dioxygenase Aktivität. Diese meist heterozygoten somatischen Mutationen sind Frame-Shift und Unsinn Mutationen, die verstreut im ganzen TET2 gen Körper während Missense-Mutationen, die meisten sind gruppiert in der Dioxygenase Domäne12. Bisher ist wenig Charakterisierung des wt und Mutant-TET2 in der Literatur vor allem aufgrund von Schwierigkeiten mit der Produktion von TET2-Dioxygenase und seine Assay21beschrieben. Hier berichten wir über einer einfachen einstufigen Läuterung der native TET2 Dioxygenase mit Ionenaustausch-Chromatographie. Darüber hinaus wurde eine quantitative LC-MS/MS-Assay optimiert und verwendet, um die enzymatische Aktivität von native TET2 Dioxygenase messen.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Carbosynth</td><td>FH31182</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633&</td><td></td></tr><tr><td>alpha;-Ketoglutarsäure (2-Oxoglutarsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean und Konzentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 Nuklease</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>CIAP (alkalische Phosphatase im Kälberdarm)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Carbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure-Monohydrat]</td><td>Carbosynth</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SP Sepharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxy-5-methylcytidin</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxy-5-hydroxymethyalcytidin</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxycytidin-5-carbonsäure, Natriumsalz</td><td>Berry & Ampere; Associates</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-Formyl-2'-Desoxycytidin</td><td>Berry & Gesellschafter</td><td>PY 7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxycytidin</td><td>Beere & Associates</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxyadenosin</td><td>Carbosynth</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxyguanosin</td><td>Carbosynth</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxythymidin</td><td>VWR Life Science</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>Gateway-Technologie</td><td>Thermo Fisher</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Allegra X-15R Zentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator 550</td><td>Fisher Scientific</td><td>XL2020</td><td></td></tr>&<tr><td>Auml; KTA FPLC-System</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 4.5 Gefriertrocknungssystem</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Zymo Oligo-Aufreinigungskolonnen&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 Säule</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Q-Trap Massenspektrometer</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>Shimadzu HPLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK16/20 FPLC-Säule</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente reinigung und lc-ms/ms-basierten assay-entwicklung für zehn-elf translokation-2 5-methylcytosine dioxygenase

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Die epigenetische Transkription Verordnung vermittelt durch 5-Methylcytosine (5mC) hat in eukaryotischen Entwicklung eine entscheidende Rolle gespielt. Demethylierung dieser epigenetischen Markierungen geschieht durch sequentielle Oxidation durch zehn-elf Translokation Dioxygenases (TET1-3), gefolgt von Thymin-DNA-Glycosylase-abhängige base Excision Repair. Inaktivierung des Gens TET2 aufgrund von genetischen Mutationen oder durch andere epigenetischen Mechanismen ist verbunden mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten, vor allem hämatopoetischen Malignome. Hier beschreiben wir eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des enzymatisch aktive unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase mit KATIONENAUSTAUSCH-Chromatographie. Weiter bieten wir einen flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Ansatz, der trennen und die vier normale DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5-Methyl, 5-Hydroxymethyl, 5-Formyl und 5-Carboxylgruppen) zu quantifizieren. Dieser Test kann verwendet werden, um die Aktivität der Wildtyp und Mutanten TET2 Dioxygenases zu bewerten.

Dynamisierung der 5mC in der DNA durch Dioxygenases TET-Familie spielt eine wichtige Rolle in epigenetische transkriptionelle Verordnungen. TET2 Dioxygenase ist häufig in diversen hämatopoetischen Tumoren12mutiert. Um die Rolle des Enzyms TET2 in der normalen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen, haben wir seine minimale katalytisch aktiven Domain ohne jede Affinität-Tag in pDEST14 Vector22geklont. Die unmarkierten TET2 Dioxygenase entst...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Epigenetik und TET2 vermittelt 5-Methylcytosin-Demethylierung Feld eine solche Analyse der Aktivität der normalen und klinischen TET2-Mutationen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass natives TET2 in einem einzigen Schritt gereinigt werden kann, und seine Aktivität kann in Bezug auf die Bildung aller drei Produkte analysiert werden. Mehrere Absolventen werden das Verfahren demonstrieren.Die Proteinreinigung wird von Chayan Bhattacharya, dem TET2-Assay von Aninda Sundary Dey und der LC-MS/MS-Analyse von Navid Ayon durchgeführt. Für die bakterielle Transformation fügen Sie einen Mikroliter rekombinanten pDEST 14 Zielexpressionsvektor, der nicht markierte menschliche TET2-Dioxygenase enthält, 100 Mikroliter chemisch kompetenter E.coli BL21 DE3-Zellen in einer 1,7-Milliliter-Röhre hinzu. Nach einer Inkubation auf Eis für mindestens 15 Minuten, Hitze schockieren die Mischung bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden in einem Wasserbad.Unmittelbar nach einem Hitzeschock die Zellen für mindestens zwei Minuten wieder auf Eis legen. Fügen Sie danach 250 Mikroliter superoptimale Brühe mit Katabolitenrepression in die Zellen ein.

efficient-purification-lc-msms-based-assay-development-for-ten-eleven

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound...

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) kann mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA) enzymatisch freien diatomischen Sauerstoff aus einem wässrigen System entfernen. Dieses Protokoll beschreibt die Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsanalyse dieses Sauerstoff-Aufräumenzyms.

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine LC-MS-basierte Sequenzierungsmethode, die als direkte Methode zur Sequenzierung kurzer RNA (&lt;35 nt pro Lauf) ohne cDNA-Zwischenprodukt und als allgemeine Methode zur Sequenzierung verschiedener Nukleotidmodifikationen in einer einzigen Studie mit Einzelbasenpräzision verwendet werden kann.

2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Ein Protokoll für den sensitiven und quantitativen Nachweis der Topoisomerase 1-Aktivität unter Verwendung des Rolling-Circle-Enhanced Enzymaktivitätsnachweis-Assays wird beschrieben. Die Methode ermöglicht den Nachweis der Topoisomerase 1-Aktivität aus gereinigten Komponenten oder Zell-/Gewebeextrakten. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen in allen Bereichen, in denen enzymatische Aktivität nachgewiesen wird.

Einfache und schnelle Rolling Circle Amplification-basierte Detektion der Topoisomerase 1-Aktivität in rohen biologischen Proben

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Erfahren Sie die effiziente Reinigung von TET2-Dioxygenase mittels Ionenaustauschchromatographie und die LC-MS/MS-basierte Aktivitätsanalyse für epigenetische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung normaler und klinischer TET2-Mutationen.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Weitere Videos entdecken