Eine Flexible Low-Cost-Hydrokultur-System für die Bewertung der Pflanze Antworten auf kleine Moleküle unter sterilen Bedingungen

Ein einfaches, vielseitiges und kostengünstiges In-vitro-Hydrokultursystem wurde erfolgreich optimiert und ermöglicht Experimente in großem Maßstab unter sterilen Bedingungen. Dieses System erleichtert die Anwendung von Chemikalien in Lösung und ihre effiziente Absorption durch die Wurzeln für molekulare, biochemische und physiologische Studien. Wir haben gezeigt, dass dieses System sehr effizient ist, um homogene Sämlinge während der anfänglichen Entwicklung zu erhalten und Wurzeln und Triebe mit Arabidopsis thaliana-Samen zu trennen.

Die folgenden Punkte sind notwendig, um das Hydrokultursystem aufzubauen und die Pflanzen unter sterilen, kontrollierten Bedingungen zu kultivieren: 7% Ethanol, 10% Bleichlösung, Polysorbat 20, MS-Medium einschließlich Vitamine. MES-Monohydrat, Agar, Kaliumhydroxid.

Laminar-Flow-Haube, Heizplatte, Wachstumskammer. Einweg-Plastikboxen, sterile Petrischalen aus Glas, Klebeband, sterile 200- und 300-Mikroliter-Pipettenspitzen, Scheren, 300-Mikroliter-Mehrkanalpipetten, 200-Mikroliter-Pipette, Skalpellklinge, Pinzette und 200-Mikroliter-Pipettenspitzenracks. Es ist entscheidend, dass die Pipettenspitze flach einen Bereich hat, der mit dem festen Medium gefüllt werden kann.

Sterilisieren Sie die Pipettenspitzengestelle ohne Abdeckungen, die als Mini-Tanks im Autoklaven bei 121 Grad für 20 Minuten verwendet werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, wurden alle zuvor genannten Materialien im Autoklaven sterilisiert. Wenn dies nicht möglich war, wie im Fall der Einweg-Kunststoffboxen, wurden die Materialien mit 7 % Ethanol gereinigt, bevor sie in die Laminar-Flow-Haube gelangten.

Wenn die Haube es zulässt, kann das UV-Licht vor dem Aufbau des Hydrokultursystems 10 Minuten lang eingeschaltet werden. Versiegeln Sie die Oberseite der Pipettenspitze flach mit dem Klebeband. Wenn möglich, lassen Sie sie 10 Minuten unter UV-Licht.

Geben Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 108 Mikroliter geschmolzenes festes Medium in jede Vertiefung. Wenn Sie viele Tanks vorbereiten, verwenden Sie eine Heizplatte, um zu verhindern, dass sich das MS-Medium verfestigt. Lassen Sie das Medium etwa 30 Minuten lang vollständig festigen.

Während der Erstarrungsphase kann UV-Licht eingeschaltet werden. Füllen Sie die Tip-Box vollständig mit flüssigem Nährmedium. Gewährleisten Sie die enge Kompaktheit zwischen festen und flüssigen Medien.

Entfernen Sie die Klebebänder von der Oberseite der Pipettenspitze flach und legen Sie sie vorsichtig auf das Rack. Das Hydrokultursystem ist nun bereit, die sterilisierten Samen aufzunehmen. Die hier beschriebene Sterilisation mit flüssiger Bleiche ist eine praktische Methode zur Sterilisation von Saatgut.

Geben Sie zunächst 500 Arabidopsis-Samen in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen. Verwenden Sie so viele Mikroröhrchen wie nötig, entsprechend der Anzahl der für das Experiment benötigten Pflanzen. Waschen Sie die Samen zwei Minuten lang mit 7%igem Ethanol unter Rühren.

Entfernen Sie vorsichtig das Ethanol. Fügen Sie einen ml 10%ige Bleichlösung hinzu, die zwei Mikroliter Polysorbat 20 Waschmittel enthält. Fünf Minuten lang rühren.

Entferne die Lösung vorsichtig. Zum Schluss spülen Sie die Samen mit sterilisiertem destilliertem Wasser ab, bis alle Bleichmittelrückstände vollständig entfernt sind, etwa fünfmal. Dieses Protokoll ist für Arabidopsis machbar, kann aber auch für andere Pflanzenarten verwendet werden.

Zu diesem Zweck sollte das Sterilisationsverfahren entsprechend den Anforderungen der Spezies modifiziert werden. Nach der Oberflächensterilisation wurden die Samen in steriles destilliertes Wasser getaucht und fünf Tage lang bei vier Grad im Dunkeln geschichtet, um die Keimung zu synchronisieren. Schneiden Sie das Ende der 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit Hilfe eines sterilen Skalpells leicht ab.

Pipettieren Sie die Arabidopsis-Samen flach in das feste Kulturmedium auf der Oberseite der Pipettenspitze. Achten Sie darauf, dass sich das Medium nicht von der Fläche löst, da die Samen sonst Schatten spenden und die Sämlinge nicht richtig wachsen. Lagern Sie so viele Mini-Tanks wie möglich in einer Einweg-Plastikbox, um eine hohe Luftfeuchtigkeit und die Umgebung frei von Mikroorganismen zu halten.

Verschließen Sie die Einweg-Plastikbox mit Klebeband. Die hydroponischen Systeme sind nun bereit für den Eintritt in die Wachstumskammer. Dieses hydroponische System wurde ursprünglich entwickelt, um die Verabreichung von Chemikalien an Pflanzen zu erleichtern, wie z. B. isotopenmarkierte Verbindungen, die im Allgemeinen sehr teuer sind, wenn sie in groß angelegten Experimenten angewendet werden.

Als Proof of Concept verwendeten wir den ATP-kompetitiven Inhibitor AZD8055, der spezifisch auf die ATP-Bindungsstelle der Ziel-Rapamycin-Proteinkinase abzielt. Die TOR-Kinase ist ein wichtiger Regulator, der Nährstoffsensorik und Energiesignalisierung integriert, um die Zellproliferation und das Zellwachstum zu fördern. Um die primären Reaktionen der durch AZD vermittelten TOR-Hemmung zu bewerten, wurden Samen von Arabidopsis hydroponisch bis zum gewünschten Entwicklungsstadium unter einer 12-stündigen Photoperiode gezüchtet.

Frisches Medium, das zwei mikromolare AZD oder 0,05 % DMSO als Kontrolle enthielt, wurde am Ende der Nacht in den Hydrokulturtanks ausgetauscht. Die Setzlinge wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Behandlung geerntet, in Wurzeln und Triebe getrennt, in flüssigem Stickstoff eingefroren, zu einem feinen Pulver gemahlen und bis zur Verwendung bei minus 80 Grad gelagert. Das Phosphorylierungsmuster der ribosomalen Protein-S6-Kinase, RPS6, ist eines der bekannten Ziele des TOR-Signalwegs.

Die Immunoblottierung zeigt die Menge an gesamtem und phosphoryliertem RPS6 in den Wurzeln (Grafik A) und den Sprossen, Grafik B. Die Repression der Phosphorylierung in Gegenwart von ADZ855 erfolgte bereits 30 Minuten nach der medikamentösen Behandlung sowohl in den Wurzeln als auch in den Sprossen, was zeigt, dass ADZ unter den verwendeten experimentellen Bedingungen auch als potenter TOR-Inhibitor erwiesen hat, der seine Kinaseaktivität schnell unterdrückt. Transgene Arabidopsislinien mit verminderter Expression des TOR-Gens oder von Komponenten des TOR-Komplexes weisen einen deutlichen Stärkeüberschuss-Phänotyp auf. Die qualitative Analyse von Stärke mit der Lugolschen Lösung zeigt das erwartete Muster der Stärkeakkumulation und des Stärkeabbaus während des Zyklus.

Sämlinge, die keine Anwendung von MSO oder AZD855 erhielten, zeigten am Ende der Nacht keine größere Akkumulation von Stärke in ihren Blättern, und die Stärkeakkumulation in Kontrollpflanzen, dem MSO, stimmte mit der Literatur überein. Darüber hinaus wiesen Pflanzen, die mit AZD behandelt wurden, am Ende der Nacht im Vergleich zu den Kontrollsämlingen eine größere Menge an verbleibender Stärke auf. Diese Ergebnisse deuten auf die Nützlichkeit des vorgeschlagenen hydroponischen Systems beim Anbau von Sämlingen hin, die physiologische Bedingungen nachahmen.

Stärke sammelt sich tagsüber in den Blättern an und wird über Nacht wieder mobilisiert, um die Stoffwechselaktivitäten aufrechtzuerhalten. Unter normalen Bedingungen bleibt am Ende des Tages nur ein kleiner Teil der Stärke, zwischen 5 und 10 % der Gesamtmenge nach Ende des Tages, übrig. Diese Ergebnisse werden getestet, dass der Phänotyp der Stärke, der unter TOR-Repression beobachtet wird, während des gesamten Zyklus auftritt.

Hydroponisch angebaute Pflanzen wurden mit Sämlingen verglichen, die Gartenbausubstrat unter sehr ähnlichen klimatischen Bedingungen in Bezug auf das Expressionsniveau der Abscisinsäure mit dem responsiven Elementbindungsfaktor drei, dem ABF3-Gen, wachsen, wie in Abbildung 5-A gezeigt. Die Expression von ABF3 korreliert direkt mit dem internen ABA-Spiegel, einer Klasse von Hormonen, die aufgrund ihrer Rolle bei multiplen abiotischen Stressreaktionen weithin als Marker bekannt sind. Obwohl hydroponisch angebaute Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen, die in Erde angebaut wurden, einen signifikanten Anstieg der ABF3-Expression aufwiesen, wurden die Expressionsniveaus von Asparaginsynthetase und ASN1 durch die in Abbildung 5-B gezeigten MSO- oder AZD-Behandlungen nicht beeinflusst.

Die Expression der Trehalosephosphat-Synthase fünf, TPS5, plus signifikanter Anstieg nach acht Stunden TOR-Repression. ASN1 und TPS5 reagieren auf niedrige bzw. hohe Zuckerwerte, was darauf hindeutet, dass diese Pflanzen nicht mit genetischem Stress konfrontiert waren. Mit diesem System ist es uns gelungen, die Anwendung kleiner Moleküle in Pflanzen zu evaluieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses hydroponische System viele Vorteile bietet, da es sehr schnell und einfach zu montieren ist und niedrige Kosten hat, da die Hauptkomponenten billig sind und in großem Umfang wiederverwendet werden können. Darüber hinaus ist dieses System vielseitig und ermöglicht die Untersuchung intakter Sämlinge oder Unterschiede entlang der Pflanzenentwicklung, und es ist hochgradig skalierbar, so dass eine große Anzahl von Pflanzen auf sehr kleinem Raum angebaut werden kann.