Name: Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit dem Yeast 2-Hybrid-System und Deep Sequencing Protein-Protein-Interaktionen in Batch-Verfahren analysieren. Diese Methode ermöglicht parallele Vergleiche verschiedener Köderproteine zur Identifikation differenzieller Interaktome.

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Wir danken dem Mitarbeiter im Institut für Humangenetik für NGS Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung. Wir danken für ihre Expertise bei der Vorbereitung genomische Bibliothek Fragmente für die Y2H-Plasmid-Bibliothek hier Einat Snir. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health unterstützt: NIH R21 EB021870-01A1 und durch NSF Research Project Grant: 1517110.

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Die Autoren haben nichts preisgeben

Hier bieten wir Ihnen eine Anleitung für Y2H-Assays im Batch mit optimierten Methoden durchführen. Es gibt ein paar wichtige Schritte im Verfahren um sicherzustellen, dass die Bevölkerung von Hefe, die Auswahl unterstellt würde Vertreter der Start-Bibliothek ist, genug der Ausgangspunkt Hefe Bevölkerung dient zur Auswahl um Variabilität zu begrenzen zu unterziehen . Diese Benchmarks sind relativ leicht zu erreichen, neben der Anpassung der Methoden und Materialien für einen traditionellen Y2H-Assay, wodurch dieser Ansatz...

Ein vollständiges Verständnis der biologischen Zellprozesse stützt sich auf die Suche nach der Protein-Interaktion-Netzwerke, die ihre molekularen Mechanismen zugrunde liegen. Ein Ansatz zur Protein-Interaktionen zu identifizieren ist die Hefe 2-Hybrid (Y2H) Assay, die Arbeiten durch einen funktionierenden Chimären Transkriptionsfaktor zusammenfügen, sobald zwei Protein Domänen von Interesse an einander1binden. Ein typische Y2H-Bildschirm erfolgt durch die Schaffung einer Bevölkerung von Hefe, die beide eine Bibliothek von Plasmiden Codierung interagierenden Proteine verschmolzen zu einem transcriptional Aktivator beherbergt (zB., "Beute" Schmelzverfahren Protein) und ein bestimmtes "Köder" Plasmid bestehend aus dem Protein von Interesse verschmolzen zu einem DNA-bindende Domäne (z.B. die Gal4 DNA-bindende Domäne, die an die Gal4-upstream aktivierende Sequenz bindet). Einer der Hauptvorteile des Y2H-Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und kostengünstig durchzuführen in einem typischen Labor für Routinearbeiten molekularen biologischen2 ausgestattet. Jedoch wenn traditionell durchgeführt, Proben ein Benutzer einzelne Kolonien, die bei der Auswahl für eine positive Y2H-Interaktion entstehen. Dies schränkt die Anzahl der Bibliothek "Beute"-Klone, die befragt werden können. Dieses Problem wird verstärkt, wenn die Fülle an eine bestimmte interagierenden Beute sehr hoch im Vergleich zu anderen, verringern die Chance Interaktion von niedrigen Fülle Beute Plasmide zu erkennen ist.
Eine Lösung für die Verwendung der Y2H-Prinzip in umfassende Abdeckung des Proteoms ist die Verwendung eines Matrix-formatierte Ansatzes, wobei ein Array mit bekannten individuelle Beute Plasmide Digital abgefragt werden kann. Ein solches Vorgehen erfordert jedoch eine Infrastruktur, die nicht ohne weiteres zugänglich oder kostengünstig an die einzelnen Ermittler ist, die bei der Festlegung der Interaktom einer kleinen Anzahl von Proteinen oder Domänen3interessiert sind. Darüber hinaus würde sehr komplexe Beute-Bibliotheken, die mehrere Fragmente von interagierenden Proteine kodieren können solche Matrix Arrays zu unpraktisch Größen vergrößern. Eine Alternative ist Assays mit komplexen Bibliotheken in Chargen und das Vorhandensein von interagierenden Klone mit massiv parallelen Hochdurchsatz-Sequenzierung4zu bewerten. Dies kann angewendet werden, um das Vorhandensein von Beute Plasmide assay, die in mehrere Kolonien mit einem typischen entstehen Y2H formatiert Ansatz in der Hefe Zellen Gehäuse interagierenden Pair von Fusionsproteinen dürfen auf einer Platte5,6wachsen. Diese allgemeine Idee kann akzentuiert werden, zur Steigerung der Abfrage der beiden mehrere Köder und Komponenten in der gleichen Zeit7,8zum Opfer.
Dennoch, viele Untersuchungen erfordern, dass ein einfacher noch mehr Aufwand auf nur wenige Protein "Köder" konzentriert und profitieren mehr von einer erschöpfenden und semi-quantitativen Abfrage einer einzigen komplexen Beute-Bibliothek. Wir haben entwickelt und validiert ein Konzept für die breit angelegte Protein Wechselwirkungsstudien mit einem Y2H-Prinzip in Batch Format4durchführen. Dies nutzt das Wachstumstempo von einem bestimmten Beute Plasmid als Proxy für die relative Stärke der Y2H Interaktion9. Tiefe Sequenzierung aller Plasmide innerhalb einer Population normales Wachstum ausgesetzt oder selektive Wachstumsbedingungen produziert eine vollständige Karte der Klone, die starke und schwache Y2H Interaktionen ergeben. Das Repertoire der interagierenden werden erhalten und direkt über mehrere Köder Plasmide verglichen. Die resultierende Workflow bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks) kann so zum differenziellen Interactomes aus den gleichen Beute Bibliotheken, Proteine, Vergleich zwischen ein Protein vs. anderen zu identifizieren identifizieren.
Hier zeigen wir DEEPN und Verbesserungen in die Labormethoden, die seine Verwendung zu erleichtern, die in Abbildung 1aufgeführt sind. Signifikante Verbesserungen umfassen:
Generation der Beute Hefe Bevölkerung. Eine der wichtigsten Voraussetzungen der DEEPN erzeugt Populationen von Hefe mit verschiedenen Köder Plasmide, die die gleiche Verteilung der Plasmid-Beute-Bibliotheken haben. Gleichwertige Grundlinie Populationen der Beute Plasmid Bibliothek sind essentiell für genaue Vergleiche zwischen den Interactomes von unterschiedlichen Ködern. Dies geschieht am besten, wenn ein Bibliothek-Plasmid sich bereits in einer Population von haploiden Hefe befindet und Umzug eines bestimmten Köder-Plasmid in dieser Population erreicht wird, indem die Paarung um einen diploiden zu produzieren. Hier bieten wir einen klaren Leitfaden wie man solche Populationen mit kommerziellen Bibliotheken in haploiden Hefe untergebracht. Obwohl wir Methoden, die eine hohe Anzahl von diploiden zu erzeugen gefunden, war die Paarung Gesamteffizienz des diese kommerzielle Bibliothek-haltigen Hefestämme gering. Daher haben wir eine neue Sorte, die Beute Bibliotheken aufnehmen kann, die weit mehr diploiden pro Paarung Reaktion ergibt.
New set Köder Plasmide. Viele aktuelle Plasmide, die "Köder" Schmelzverfahren Proteine enthalten des Proteins des Interesses und eine DNA-bindende Domäne Ausdrücken basieren auf 2µ, so dass sie ihre Kopienzahl verstärken. Diese Kopienzahl kann sehr variabel in der Bevölkerung und führen zu Schwankungen in der Y2H transcriptional Antwort. Dies könnte wiederum die Fähigkeit zu beurteilen, die Stärke einer bestimmten Protein Interaktion anhand der Antwort Wachstum von Zellen unter Auswahl verzerren. Dies kann teilweise Adresse sein, mit einem niedrigen Kopie Plasmid, von denen einige wie die im Handel erhältlichen pDEST3210zuvor beschrieben wurden. Wir konstruierten eine neue Köder-Plasmid (pTEF-GBD), das produziert Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionsproteine innerhalb einer TRP1 Zentromer-basierte niedrigen Kopie Plasmid trägt die Kanr-Resistenz-Gen, die auch ermöglicht, Klonen von Köder Fragmente sowohl stromaufwärts und unterhalb des Gal4 DNA-bindende Domäne.
Neue High-Density Y2H fragmentbibliothek. Wir ein neues Plasmid, Haus Y2H Beute Bibliotheken gebaut und benutzte es, um eine hochkomplexe Y2H-Bibliothek nach dem Zufallsprinzip geschert Bruchstücke von genomischer DNA aus Saccharomyces Cerevisiaegemacht zu bauen. Sequenzanalyse zeigte, dass diese Bibliothek mehr als 1 Million verschiedene Elemente, die weitaus komplexer als die zuvor beschriebenen Hefe genomische Y2H Plasmid Bibliotheken11. Mit dieser neuen Bibliothek konnten wir zeigen, dass der DEEPN-Workflow robust genug ist, um komplexe Bibliotheken mit vielen unterschiedlichen Plasmide in einer Art und Weise aufzunehmen, die zuverlässig und reproduzierbar ist.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td>Tiefensequenzierungsplattform</td></tr><tr><td>Monoklonale Anti-HA-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Primärer Antikörper zum Nachweis der Expression von HA in pGal4AD Konstrukte</td></tr><tr><td>Polyklonale Anti-Myc-Antikörper</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Primärer Antikörper zum Nachweis der Expression von MYC in pTEF-GBD Konstrukte</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350, Pulver</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Lachs Sperma DNA</td><td>Trevigen, Inc verkauft von Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>Träger-DNA für die Hefeumwandlung Abschnitt 3.2.1.</td></tr><tr><td>Kanamycin-Monosulfat-Forschungsprodukte</td><td>International</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>zur Herstellung von DNA-Agarose-Gelen</td></tr><tr><td>Natriumchlorid-Forschungsprodukte</td><td>International</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat-Dihydrat</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Natriumsalz</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextraktpulver</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Hefestickstoffbasis (Ammoniumsulfat) ohne Aminosäuren</td><td>Forschung Produkte International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td> CSM-Trp-Met Bio 101, <td></td></tr><tr><td></td><td>Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>zur Herstellung von Medienplatten in Abschnitt 1</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4 Triazol</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff-Forschungsprodukte</td><td>International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Schnelle Assemblierungsmethode zur Klonierung von Plasmiden in Abschnitt 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Wird zur Amplifikation von Produkten für die Gibson-Assemblierung in Abschnitt 2.3 sowie zur Probenvorbereitung für die DEEPN-Tiefensequenzierung in Abschnitt 6.2.1</td></tr><tr><td>verwendet Ethidiumbromid</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Wird für die Aufreinigung von PCR-Produkten in Abschnitt 6.2.3</td></tr><tr><td>verwendet Qiaquick DNA-Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Wird für die Aufreinigung von verdautem pTEF-GBD in Abschnitt 2.1</td></tr><tr><td>verwendet KAPA Hyper Prep Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>Vorbereitungskit für die Tiefensequenzierung</td></tr><tr><td>Codon-Optimierung</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Codon-Optimierung</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>DNA-Fragmente, die für die Klonierung in Abschnitt 2.2</td></tr><tr><td>verwendet werden Strings</td> Thermofisher-DNA-Fragmente<td></td><td></td><td>, die für die Klonierung in Abschnitt 2.2 verwendet werden</td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>Wird zur Aufbereitung von DNA-Mengen in Abschnitt 2.3 verwendet</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>Hochleistungs-Ultraschallgerät in Sektion 7</td></tr><tr><td>Oligonucelotid 5' - CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Integrated DNA Technologies oder Thermofisher</td><td></td><td>für die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 5'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidbildung</td></tr><tr><td>Oligo-Nucelotid 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies oder Thermofisher</td><td></td><td>für die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 5'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidbildung</td></tr><tr><td>Oligo-Nucelotid 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies oder Thermofisher</td><td></td><td>für die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 3'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidbildung</td></tr><tr><td>Oligonucelotid 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3"</td><td>Integrierte DNA-Technologien oder Thermofisher</td><td></td><td>für die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 3'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidaufbau-Oligonukleotid-Oligonukleotid-5</td></tr><tr><td>'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies oder Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGAL4AD</td></tr><tr><td>Oligonucelotid 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3"</td><td>Integrated DNA Technologies oder Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGAL4AD</td></tr><tr><td>Oligonucelotid 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3"</td><td>Integrated DNA Technologies oder Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGADT7-Oligonucelotid</td></tr><tr><td>5' - TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>Integrated DNA Technologies oder Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA-Hefestamm</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries und ein Wirtsstamm, der für die hocheffiziente Zwei-Hybrid-Selektion in Hefe entwickelt wurde. GENETIK 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain expression</td></tr><tr><td>plasmid pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-activation domain expression plasmid</td></tr><tr><td>100 mm Petrischalen</td><td>Kord-Vallmark verkauft von VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 mL PYREX Erlenmeyerkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PYREX Erlenmeyerkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Erlenmeyerkolben</td><td>Fisher</td><td>Scientific S63274</td><td></td></tr><tr><td>2.000 mL PYREX Erlenmeyerkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm Einweg-Kulturröhrchen</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serologische Pipette</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serologische Pipette</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Serologische Pipette</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Griffin Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Aufbewahrungsflasche für wiederverwendbare Medien</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL Messzylinder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Molekulare Geräte</td><td></td><td>zur Messung der optischen Dichte von Zellen</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Spektralphotometer zur Quantifizierung der DNA-Menge</td></tr><tr><td>Electronic UV Transilluminator</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>zur Visualisierung der DNA in einem Ethidiumbromid-Agarose-Gel</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher</td><td>Scientific F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 &Mikro; L Pipettenspitzen mit niedriger Retention</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; LLow Retentionspipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L XL Pipettenspitzen mit niedriger Retention</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>Küvettenschaber</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Holzapplikatoren</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrozentrifuge 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>Mikrozentrifuge</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>Tischzentrifuge</td></tr><tr><td>Amersham ECL Kaninchen IgG, HRP-linked whole Ab (vom Esel)</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>NA934-1ML</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Amersham ECL Maus IgG, HRP-linked whole Ab (von Schafen)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>ECL-Nachweislösung</td></tr><tr><td>Isotemp Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Inkubator</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Schüttelinkubator</td></tr><tr><td>Isotemp Digitalgesteuertes Wasserbad Modell 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Wasserbad</td></tr><tr><td>Y2H Maus cDNA-Bibliothek in Y187 (Pfannengewebe)</td><td>Clontech</td> 630482 <td>kommerziell erhältliche cDNA-Bibliothek</td><td></td></tr><tr><td>Y2H Maus cDNA-Bibliothek in Y187 (Mausgehirn)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>kommerziell erhältliche cDNA-Bibliothek</td></tr><tr><td>pGADT7 AD Vektor</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>kommerziell erhältlicher AD-Vektor mit vielen cDNA-Bibliotheken</td></tr>: <tr><td>pGBKT7 DNA-BD-Vektor</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>kommerziell erhältlicher DNA-BD-Vektor</td></tr><tr><td>Biolase DNA-Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>DNA-Polymerase für Abschnitt 2.4</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60 PCR-Gerät</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure 0,5 mL PCR-Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

eine hefe 2-hybrid bildschirm im batch proteininteraktionen vergleichen

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening für Protein-Protein-Interaktionen mit der Hefe-2-Hybrid-Assay ist seit langem ein wirksames Instrument, aber seine Verwendung wurde weitgehend auf die Entdeckung der hohen Affinität Interaktoren, die in der Bibliothek der interagierenden Kandidaten hochangereichertes sind begrenzt. In einem traditionellen Format kann Hefe 2-Hybrid Assay zu viele Kolonien zu analysieren, wenn bei niedrigen Stringenz durchgeführt ergeben, wo geringe Affinität Interaktoren gefunden werden könnte. Darüber hinaus kann nicht ohne eine umfassende und vollständige Befragung derselben Bibliothek gegen verschiedene Köder Plasmide, eine vergleichende Analyse erreicht werden. Obwohl einige dieser Probleme behoben werden kann, angeordneten Beute Bibliotheken verwenden, können die Kosten und die erforderliche Infrastruktur für solche Bildschirme betreiben unerschwinglich sein. Als Alternative haben wir die Hefe 2-Hybrid Assay um gleichzeitig entdecken Sie Dutzende von Transienten angepasst und statische Protein-Interaktionen in einem einzigen Bildschirm mit Hilfe einer Strategie bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks), die enthält Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und Berechnung, mit der die Entwicklung einer Population von Plasmiden folgen, die Interaktionspartnern zu kodieren. Hier beschreiben wir maßgeschneiderte Reagenzien und Protokolle, die einen DEEPN Bildschirm einfach und kostengünstig ausgeführt werden können.

Die Y2H-Assay ist weit verbreitet für die Suche nach Protein: Protein-Interaktionen und mehrere Anpassungen und Systeme entwickelt worden. Zum größten Teil sind die gleichen Überlegungen, die helfen, Erfolg mit diesen früheren Ansätzen für DEEPN wichtig. Beispiele für wichtige Benchmarks: Ausdruck der DNA-bindende Domäne Fusionsproteine, gewährleisten einem niedrigen Hintergrund der unechten seine + Wachstum in der diploiden, enthält den Köder mit einer leeren Beute Plasmid, eine hohe Eff...

Batch-Verarbeitung von Hefe-2-Hybrid-Bildschirme ermöglicht direkten Vergleich der Interaktion profile mehrere Köder Proteine mit einem hoch komplexen Satz von Fusionsproteinen Beute. Hier beschreiben wir verfeinerten Methoden, neue Reagenzien und ihre Verwendung für solche Bildschirme zu implementieren.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Diese Methode nutzt das Prinzip des Hefe-2-Hybridsystems in beiden Populationen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, die Schlüsselfragen zu einer Vielzahl von molekularen und zellulären Prozessen beantworten. Diese Technik nutzt die Tiefensequenzierung, um die Wechselwirkungen eines Proteins mit einem anderen zu sehen. Da dieser Ansatz darauf ausgerichtet ist, parallele Vergleiche anzustellen, kann er Gruppen von Proteinen identifizieren, die mit einem Protein im Vergleich zu einem anderen interagieren oder unterschiedliche Bestätigungen desselben Proteins oder bei der Typisierung einer krankheitsverursachenden mutierten Version, um differentielle Interaktome aufzudecken.Für dieses Verfahren wurde ein neues Hefe-2-Hybridköder-Plasmid pTEF-GBD konstruiert, wie im Textprotokoll beschrieben. Dieses Plasmid produziert Fusionsproteine der Gal4-DNA-Bindungsdomäne in einem TRP1-Zentromer-basierten Plasmid mit niedriger Kopie, das das Kanamycin-Resistenzgen trägt und auch die Klonierung von Köderfragmenten sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der Gal4-DNA-Bindungsdomäne ermöglicht. Dieses Köderplasmid wurde verwendet, um MATA-Hefe zu transformieren, und die Express

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

MYTHOS ermöglicht den empfindlichen Nachweis von transienten und stabilen Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Es wurde erfolgreich angewendet, um exogene und Hefe integrale Membranproteine ​​zu studieren, um ihre Interaktionspartner in einem hohen Durchsatz Weise zu identifizieren.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Dieses Video zeigt den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zum Nachweis spezifischer Protein-Selbstinteraktionen. In diesem Assay wird das Protein von Interesse an zwei Domänen eines Transkriptionsfaktors gebunden, der für das β-Galactosidase-Enzym kodiert. Wenn die beiden Proteine interagieren, bewirkt dies, dass Transkription und Translation das Enzym bilden, das dann mit einem biochemischen Assay nachgewiesen wird.

Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zur Bestimmung der Protein-Selbstassoziation in Hefezellen

In diesem Video demonstrieren wir den modifizierten Hefe-Ein-Hybrid-Assay, der mehrere Proteine nachweist, die mit der Ziel-DNA interagieren. Die transformierten Hefezellen enthalten die Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts des Reportergens. Zusätzlich exprimieren sie Transkriptionsfaktor-Proteine. Wenn die Proteine Komplexe bilden und an die Ziel-DNA binden, wird das Reportergen exprimiert und kann enzymatisch nachgewiesen werden.

Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Verwendung von Protein-Mikroarrays enthält fast die gesamte S. cerevisiae Proteom ist für schnelle unvoreingenommene Abfragetausende von Protein-Protein-Wechselwirkungen in parallel sondiert. Dieses Verfahren kann für die Protein-Kleinmolekül, posttranslationale Modifikation und andere Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

Proteine interagieren miteinander und diese Wechselwirkungen bestimmen zu einem großen Teil ihre Funktionen. Protein-Interaktionspartner können bei hohem Durchsatz in vivo mit einem Hefe-Fitness-Assay identifiziert werden, der auf dem Dihydrofolat-Reduktase-Protein-Fragment-Komplementationsassay (DHFR-PCA) basiert.

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Der hier beschriebene modifizierte Hefe-Ein-Hybrid-Assay ist eine Erweiterung des klassischen Hefe-Ein-Hybrid- (Y1H) -Assays, um die heteromere Protein-Komplex-DNA-Wechselwirkung in einem heterologen System für jede funktionelle Genomforschung zu untersuchen und zu validieren.

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Tiefe Sequenzierung der Hefe Bevölkerung ausgewählt für positive Hefe 2-Hybrid Interaktionen potenziell liefert eine Fülle von Informationen über interagierenden Partner Proteine. Hier beschreiben wir den Betrieb von bestimmten Bioinformatik und aktualisierte Individualsoftware Sequenzdaten von solchen Bildschirmen zu analysieren.

Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

Die Wechselwirkungen von Biomolekülen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, sind die molekulare Grundlage biologischer Funktionen. Wenn interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten, denen die relevante Interaktion spezifisch fehlt, isoliert werden können, werden sie wesentlich dazu beitragen, die Funktion(en) dieser Interaktion zu verstehen. Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten vor.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Erfahren Sie, wie Sie mit dem Yeast 2-Hybrid-System und Deep Sequencing Protein-Protein-Interaktionen in Batch-Verfahren analysieren. Diese Methode ermöglicht parallele Vergleiche verschiedener Köderproteine zur Identifikation differenzieller Interaktome.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

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