Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Diese Methode nutzt das Prinzip des Hefe-2-Hybridsystems in beiden Populationen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, die Schlüsselfragen zu einer Vielzahl von molekularen und zellulären Prozessen beantworten. Diese Technik nutzt die Tiefensequenzierung, um die Wechselwirkungen eines Proteins mit einem anderen zu sehen. Da dieser Ansatz darauf ausgerichtet ist, parallele Vergleiche anzustellen, kann er Gruppen von Proteinen identifizieren, die mit einem Protein im Vergleich zu einem anderen interagieren oder unterschiedliche Bestätigungen desselben Proteins oder bei der Typisierung einer krankheitsverursachenden mutierten Version, um differentielle Interaktome aufzudecken.

Für dieses Verfahren wurde ein neues Hefe-2-Hybridköder-Plasmid pTEF-GBD konstruiert, wie im Textprotokoll beschrieben. Dieses Plasmid produziert Fusionsproteine der Gal4-DNA-Bindungsdomäne in einem TRP1-Zentromer-basierten Plasmid mit niedriger Kopie, das das Kanamycin-Resistenzgen trägt und auch die Klonierung von Köderfragmenten sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der Gal4-DNA-Bindungsdomäne ermöglicht. Dieses Köderplasmid wurde verwendet, um MATA-Hefe zu transformieren, und die Expression der Gal4-Köderfusionsproteine wurde durch Immunblotting mit Anti-MIC-Antikörpern verifiziert.

Darüber hinaus wurde eine neue Hefe-2-Hybrid-Bibliothek im stromlinienförmigen Beuteplasmidvektor PGAL4 AD erstellt. Die genomische DNA wurde durch Scheren fragmentiert, die Größe ausgewählt, mit Adaptern modifiziert und in PGAL4-AD eingefügt, um die Saxairtab-Hefe-2-Hybrid-Bibliothek zu erstellen. Um das Verfahren zur Erstellung von Hefepopulationen mit Köder- und Beutebibliotheken zu beginnen, inokulieren Sie drei Milliliterkulturen von jedem der MAT-Hefe-Transformanten, die die verschiedenen Trip-Transformanten tragen, die die Köderplasmide und CSM minus Trip-Medium enthalten.

Fügen Sie zwei separate Kulturen hinzu, die nur das Vektorplasmid enthalten, um als Verfahrenskontrollen zu dienen. Inkubieren Sie die Kulturen bei 30 Grad Celsius und 200 U/min für sechs Stunden. Dann jede Kultur in einem sterilen Erlenmeyerkolben zu einer 25-Milliliter-Kultur verdünnen und über Nacht inkubieren.

Tauen Sie ein gefrorenes Stück von MAT-alpha-Zellen auf, das die lu2-tragende Beutebibliothek enthält, bei Raumtemperatur. Es wird das gesamte aufgetaute Zellmaterial verwendet, um 125 Milliliter CSM minus lu minus met-Medium in einem sterilen Erlenmeyerkolben zu inokulieren. Lass die Kultur bei 30 Grad Celsius und 200 U/min über Nacht wachsen.

Am nächsten Tag, nachdem Sie bestätigt haben, dass die OD600 der Transformantenkulturen der Nachtmatte zwischen 1,0 und 1,5 liegen, übertragen Sie die Kulturen in konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie 21 OD 600-Äquivalente jeder Kultur bei 4.696 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Jedes Pellet der Mat-a-Zellen wird in 10 Millilitern sterilem Wasser resuspendiert, die Suspension in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 4.696 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie mit einer Pipette vorsichtig den Überstand, ohne die pelletierten Zellen zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet in vier Millilitern gepuffertem YPDA-Medium bei einem pH-Wert von 3,7.

Für jeweils 10 gewünschte Paarungsreaktionen werden 39 OD 600-Äquivalente des mattenalpha-Stammes pelletiert, die die Bibliotheksplasmide in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen enthalten. Resuspendieren Sie die matten Alpha-Zellen in 10 Millilitern sterilem Wasser und repelletieren Sie sie in einem neuen konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei 4.696 g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie mit einer Pipette vorsichtig den Überstand, ohne die pelletierten Zellen zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern gepuffertem YPDA-Medium bei pH 3,7.

Um jede Paarungsreaktion einzurichten, geben Sie Folgendes in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen: Ein Milliliter MAT-A-transformierte Zellen, ein Milliliter MAT-alpha-Bibliothek mit Zellen und ein Milliliter gepuffertes YPDA bei pH 3,7. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius unter sanfter, orbitaler Bewegung für 90 Minuten. Nach 90 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen bei 4.696 g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern von eins zu eins gepuffertem YPDA-YPD. Füllen Sie alle zwei Milliliter Zellen auf eine 100-Milliliter-YPD-Platte und inkubieren Sie sie etwa 20 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Um die Zellen zu ernten, pipettieren Sie zwei bis drei Milliliter CSM minus lu minus Auslösemedium auf jede YPD-Platte und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu entfernen.

Pipettieren Sie die gelösten Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Platte vier- bis fünfmal mit zwei bis drei Millilitern CSM minus lu minus Auslösemedium, indem Sie das Medium mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette nach oben pipettieren und vorsichtig über die Oberfläche der YPD-Platte ausstoßen. Die Zellen werden bei 4.696 g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugiert.

Der Überstand wird aus jedem konischen Röhrchen verworfen und die Zellen in 40 Millilitern CSM minus Lu minus Auslösemedium durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Um die Anzahl der gebildeten diploiden Zellen zu schätzen, verdünnen Sie vier Mikroliter des diploiden Gemisches in 200 Mikroliter bzw. 2.000 Mikroliter CSM minus lu minus Auslösemedium. 200 Mikroliter jeder Verdünnung werden auf eine CSM minus lu minus Auslöseplatte aufgebracht, um eine volle Verdünnung von eins bis 10.000 und eins bis 100.000 des geernteten Diploides darzustellen.

Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 36 bis 40 Stunden. Der Rest von je 40 Millilitern Zellresuspension wird sofort verwendet, um 500 Milliliter CSM minus lu minus Auslösemedium in einem Einliter-Erlenmeyerkolben zu impfen. Messen Sie den OD 600 jeder Kultur.

Inkubieren Sie diese Kolben bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 180 U/min, bis sie die Sättigung erreichen, was in der Regel 36 bis 40 Stunden dauert. Überwachen Sie das Zellwachstum nach 24 und 36 Stunden, indem Sie den OD 600 messen. Bevor Sie mit dem Verfahren fortfahren, bestätigen Sie die Paarungseffizienz der beiden Hefestämme.

Eine Mindestanzahl von 200 Kolonien auf der Verdünnungsplatte von ein bis 10.000 ist erforderlich. Sobald die Kulturen die Sättigung erreicht haben, wird mit einer Pipette ein 20-Milliliter-Alloquad aus jeder Kultur entnommen und zwei Liter-Erlenmeyerkolben inokuliert. Ein Kolben mit 750 Millilitern CSM minus lu minus Auslösemedium und ein zweiter Kolben mit 750 Millilitern CSM minus lu minus Auslöser minus seinem Medium.

Mit dem niedrigsten Gehalt von drei Aminosäuren 124 Triasol, das den Hintergrund eliminiert, wurde zuvor bestimmt, wie im Textprotokoll beschrieben. Die neuen Kulturen durch Schwenken gut vermischen. Nach der Messung des anfänglichen OD 600 inkubieren Sie die Kulturen bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bei 180 U/min bis zur Sättigung, die typischerweise innerhalb von 24 Stunden für die nicht selektierte CSM minus lu minus trip-Kultur eintritt, aber über 70 Stunden für Kulturen dauern kann, die auf Hefe-2-Hybrid-Wechselwirkungen selektiert sind.

Sobald die Kulturen die Sättigung erreicht haben, entnehmen Sie 11 Milliliter jeder Kultur mit der Pipette und sedimentieren Sie die Zellen mit einer fünfminütigen Drehung bei 4.696 g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und fahren Sie mit der DNA-Extraktion fort, wie im nächsten Abschnitt gezeigt. Um mit der DNA-Extraktion zu beginnen, verwenden Sie eine Pipette, um jedes zuvor vorbereitete Zellpellet in 500 Mikrolitern starkem TE-Puffer zu resuspendieren.

In ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und 10 Mikroliter Zimolay-Brühe in jedes Röhrchen geben. In einem Abzug drei Mikroliter Beta-Marketol-Ethanol in jedes Röhrchen geben und gut mischen. Inkubieren Sie im 37 Grad Celsius heißen Inkubator für 24 bis 36 Stunden.

Als nächstes extrahieren Sie die Proben zweimal mit 500 Mikrolitern Fenolchloroform isolaymalem Alkohol, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie sieben Mikroliter viermolares Natriumchlorid und 900 Mikroliter eiskaltes, 100%iges Ethanol hinzu und mischen Sie es durch Inversion. Sedimentieren Sie die DNA, indem Sie sie in einer Mikrozentrifuge bei 21, 130 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur drehen.

Entsorgen Sie den Überstand durch Pipettieren und waschen Sie jedes Pellet dreimal mit 900 Mikrolitern 70%igem Ethanol. Sedimentieren Sie die DNA, indem Sie zwei Minuten lang bei 21, 130 g zentrifugieren. Nachdem Sie das restliche Ethanol entfernt haben, trocknen Sie die Pellets sieben Minuten lang bei 42 Grad Celsius.

Resuspendieren Sie jedes Pellet in 120 Mikrolitern 0,1x starkem TE in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 90 Minuten. Pipettieren Sie 60 Mikroliter der extrahierten DNA in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 120 Mikroliter starken TE und 3,5 Mikroliter RN ace A-Brühe hinzu, schlagen Sie zum Mischen und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie sieben Mikroliter fünfmolares Ammoniumacitat und 900 Mikroliter eiskaltes, 100%iges Ethanol in jedes Röhrchen. Mischen Sie die DNA durch Inversion und sedimentieren Sie, wie zuvor gezeigt. Resuspendieren Sie die mit RNace-A behandelte DNA in 55 Mikrolitern 0,1x starker TE in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 90 Minuten.

Quantifizieren Sie die DNA durch Absorption bei 260 Nanometern. Der nächste Schritt besteht darin, die PCR an den CDNA-Insertionen durchzuführen. Führen Sie zwei 50-Mikroliter-PCR-Reaktionen pro DNA-Probe durch.

Zu jeder Reaktion fügen Sie Wasser, fünf Mikrogramm DNA-Probe, 25 Picamole von jedem Vorwärts- und Rückwärtsprimer hinzu, der dem Plasmid der Beutebibliothek entspricht, und 25 Mikroliter 2x PCR-Mastermix mit hoher Wiedergabetreue. Verstärken Sie die Reaktionen mit diesem Programm. Eine 30-sekündige Denaturierung bei 98 Grad Celsius, 25 Zyklen D-Natrin bei 98 Grad Celsius für 10 Sekunden, Anealing bei 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und Verlängerungszeiten von drei Minuten bei 72 Grad Celsius, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei 72 Grad Celsius.

Analysieren Sie jede PCR-Reaktion durch 1%DNA-Agrose-Chill-Elektrophorese mit einem Athidiumbrom-haltigen Gel und visualisieren Sie das Gel durch UV-Transillumination. Proben ohne Selektion zeigen einen generalisierten DNA-Abstrich, aber bei Selektion können einzelne Banden unterschieden werden. Kombinieren Sie doppelte PCR-Proben und reinigen Sie sie mit einem Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Quantifizieren Sie die DNA durch Absorption bei 260 Nanometern auf einem Spektralphotometer. Führen Sie anschließend eine Tiefensequenzierung durch, gefolgt von einer bioinformatischen Verarbeitung und Verifizierung, wie im Textprotokoll beschrieben. Die neue zufällig fragmentierte Hefe-2-Hybrid-Bibliothek wurde in dem demonstrierten Verfahren verwendet und die durch PCR amplifizierten Plasmidinserts wurden durch DEEP-Sequenzierung und bioinformatisches Processing mit der DEEPN-Software analysiert und mit einer zuvor veröffentlichten Bibliothek verglichen.

Dieses Diagramm zeigt die Rangfolge der Schilfrohre pro Gen in den Bibliotheken geteilt durch die Zungen pro Gen, die durch die Sequenzierung des Hefegenoms gefunden wurden. Dieses Histogramm zeigt die Anzahl der eindeutigen Plasmide pro Gen, das für ein Fragment kodiert, das sich sowohl in der proteinkodierenden Region als auch im richtigen translationalen Leserahmen befindet. Es wird ein Vergleich der Anzahl der verschiedenen Plasmide in jeder Bibliothek, die für Hefegene kodieren, und des Anteils, der sich im korrekten translationalen Leserahmen befindet oder nicht oder rückwärts eingefügt wird, gezeigt.

Insgesamt enthält die neue Bibliothek viel mehr verschiedene Plasmide. Diese Methoden stellen sicher, dass die Bibliothek reproduzierbar auf Zellen übertragen werden kann, die verschiedene Köderproteine enthalten, und dass das Auswahlverfahren reproduzierbare Sätze von Genen liefern kann, die angereichert werden, und sie als spezifische Kandidaten-interagierende Proteine unterscheiden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Der größte Teil dieser Arbeit besteht darin, Zellkulturen zu inkubieren, und die eigentliche praktische Zeit beträgt nur wenige Stunden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Populationen aus einer großen Anzahl einzelner diploider Zellen zu erstellen, damit die Bibliothek reproduzierbar auf Zellen übertragen werden kann, die die verschiedenen Köderproteine enthalten. Es ist auch wichtig, die Verdünnungsbedingungen und die Wachstumsrate der Zellen für diejenigen Populationen genau zu beobachten, die einer Selektion unter positiven Hefe-2-Hybridbedingungen unterzogen werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren werden computergestützte Methoden, die in der begleiteten Arbeit erläutert werden, die interagierenden Proteine identifizieren und einen Weg zur Validierung dieser Wechselwirkungen mit einem traditionellen Hefe-2-Hybrid-Assay oder anderen biochemischen Methoden aufzeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine sehr gute Vorstellung davon haben, wie Sie reproduzierbar diploide Hefepopulationen erzeugen können, die die Beuteplasmidbibliothek enthalten, und sie in Chargen züchten, um sie für positive Hefe-2-Hybrid-Wechselwirkungen auszuwählen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln während des DNA-Aufreinigungsprotokolls gefährlich sein kann und im Abzug mit Handschuhen und einem Laborkittel durchgeführt werden sollte.