Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Natur von Proteininteraktomen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die gesamte bioinformatische Verarbeitung über eine einfach zu bedienende Schnittstelle gesteuert wird. Diese Software verwendet eine benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche, die Molekularbiologen, Zellbiologen und Biochemiker, die nicht über viel Erfahrung in der Bioinformatik verfügen, nutzen können, um ihre Analyse einfach durchzuführen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in der Verarbeitung von Sequenzdaten sind, Schwierigkeiten, da die Computerprogramme verwirrend und umständlich sind. Wir dachten, wenn wir die Informatik einfach machen würden, würde die ganze Technik viel zugänglicher und nützlicher werden. Der erste Schritt in diesem Verfahren besteht darin, das MAPster-Softwareprogramm herunterzuladen und zu installieren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Geben Sie anschließend die erforderlichen Dateien und Parameter über die Registerkarte Main ein. Wählen Sie die entsprechende paarweise Schaltfläche, um die Dateien für die DEEPN-Analyse einzugeben. Schalten Sie die Option Paarweise auf Aus, um sie im Einzelleseformat auszuführen.

Laden Sie Dateien in MAPster per Drag-and-Drop in das entsprechende Fenster. Wählen Sie aus den indizierten Genomen, die im Feld Genom aufgeführt sind, eine Referenz-DNA-Genomquelle aus, die der Quelle der Y2H-Beutebibliothekseinsätze entspricht. Da HISAT2 Multithreading unterstützt, geben Sie im Feld Threads die Anzahl der Computerprozesse an, die dem Mapping-Programm gewidmet werden sollen.

Geben Sie einen Namen für die Ausgabedatei an, ein kurzer, aber aussagekräftiger Name ohne Leerzeichen oder Sonderzeichen wird empfohlen, da dieser Dateiname während des gesamten DEEPN-Prozesses verwendet wird. Geben Sie mit der Schaltfläche Ausgabeverzeichnis öffnen einen Ordner an, in dem die zugeordneten Dateien ausgegeben werden sollen. Nachdem Sie die entsprechenden Dateien und Parameter ausgewählt haben, verwenden Sie die Schaltfläche Zur Warteschlange hinzufügen, um den Zuordnungsauftrag zur Auftragswarteschlange hinzuzufügen.

Nachdem alle Aufträge in die Auftragswarteschlange eingegeben wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Warteschlange ausführen. Beginnen Sie diese Analyse, indem Sie die DEEPN-Software öffnen. Wählen Sie im Hauptfenster die entsprechenden Informationen zur Beutebibliothek aus dem oberen Auswahlfeld aus.

Wählen Sie einen Ordner aus, in den sich die verarbeiteten Dateien legen können, indem Sie auf die Schaltfläche Arbeitsordner klicken und zum Ordnerverzeichnis navigieren. Sobald ein Arbeitsordner ausgewählt ist, erstellt DEEPN drei Unterordner mit den angegebenen Namen. Stellen Sie für eine erfolgreiche Analyse sicher, dass Sie die richtigen SAM-Dateien in den richtigen Ordnern ablegen und wissen, welche Dateien zugeordnete und nicht zugeordnete Lesevorgänge haben.

Wenn Sie SAM-Dateien verwenden, die sowohl zugeordnete als auch nicht zugeordnete Lesevorgänge enthalten, z. B. solche, die mit den Standardeinstellungen des MAPster-Programms erstellt wurden, legen Sie sie im Ordner sam_files ab. Starten Sie die Verarbeitung, indem Sie auf die Schaltfläche Genanzahl plus Junction Make klicken. Die Verarbeitungszeit hängt von der Größe und Anzahl der Sequenzdateien und der Verarbeitungsgeschwindigkeit des verwendeten Rechners ab.

Sobald DEEPN die Daten verarbeitet hat, wird ein vollständiger Satz von Ordnern erstellt. Der nächste Schritt besteht darin, die Analyse in Stat Maker durchzuführen. Öffnen Sie Stat_Maker, und klicken Sie auf die Schaltfläche Installation überprüfen.

Wenn Stat_Maker zum ersten Mal ausgeführt wird, werden R, JAGS und Bioconductor automatisch installiert, indem diese Ressourcen aus dem Internet abgerufen werden. Sobald R, JAGS und Bioconductor erkannt wurden, werden Stat_Maker aktiv und ermöglichen weitere Benutzereingaben. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ordner auswählen, um zu dem Arbeitsordner zu navigieren, den DEEPN verarbeitet hat.

Stat_Maker finden und listen die Dateien für die statistische Analyse automatisch in dem Fenster auf. Ziehen Sie die entsprechenden Dateien aus dem Dateilistenfenster oben in die Dateifenster unten für jeden Vektor- und Köderdatensatz und für jede Wachstumsbedingung, nicht ausgewählt und ausgewählt. Wichtig ist, dass Stat_Maker doppelte Datasets nur für einen leeren Vektor, zwei Stichproben von nicht ausgewählten Populationen und zwei Stichproben von ausgewählten Populationen erfordert.

Dies gibt eine Schätzung der Variabilität innerhalb des Experiments. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen. Abhängig von der Geschwindigkeit des Computers dauert die Berechnung zwischen fünf und 15 Minuten.

Die Ergebnisse der Stat_Maker Ausgabe werden in einem neuen Unterordner innerhalb des Hauptarbeitsordners mit der Bezeichnung Stat_Maker Ergebnisse abgelegt. Überprüfen Sie die Ergebnisse. Um die Daten zu jedem potenziellen Kandidaten zu überprüfen, öffnen Sie die DEEPN-Software, wählen Sie die entsprechenden Informationen zur Beutebibliothek aus und wählen Sie dann den richtigen Arbeitsordner mithilfe des Arbeitsordners aus.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Blast Query, um ein neues Fenster zu laden. Geben Sie im oberen Textfeld den Gennamen oder die GenBank NM-Nummer ein, um das gewünschte Gen auszuwählen. Der Genname entspricht dem Namen, der in der Stat Maker-Ausgabedatei aufgeführt ist.

Geben Sie Enter oder Return ein, wodurch der Abruf des interessierenden Gens initiiert wird. Wählen Sie in den Menüs "Datensatz auswählen" aus, welche Datensätze für die Analyse verwendet werden sollen. In der Regel gehören dazu nur die Vektor- und Köderproben, die unter nicht-selektiven Bedingungen gezüchtet wurden, sowie die Köderprobe, die unter Selektionsbedingungen gezüchtet wurde.

Anfangs kann das Laden der Daten und des Gennamens mit dem Blast Query-Programm eine Weile dauern, aber sobald der Datensatz geladen ist, geht es viel schneller. Blast_Query zeigt die Fusionspunkte entlang der interessierenden Sequenz an und gibt an, wie häufig die einzelnen Fusionspunkte vorhanden sind. Dies kann sowohl in einem Tabellenformat über die Registerkarte Ergebnisse als auch in einem grafischen Format über die Registerkarte Diagramm angezeigt werden.

Um diese Ergebnisse in eine CSV-Datei zu exportieren, klicken Sie oben rechts auf die Schaltfläche CSV speichern. Klicken Sie im Fenster VERTIEFEN auf die Schaltfläche Lesetiefe unter Daten analysieren. Sobald das Fenster Lesetiefe geöffnet ist, geben Sie die NM-Zahl in das obere Textfeld ein.

Verwenden Sie das Pulldown-Menü, um den relevanten Datensatz auszuwählen, der das angereicherte Gen von Interesse enthält. Verwenden Sie die Tabelle auf der linken Seite und die Grafikanzeige auf der rechten Seite, um zu bestimmen, wie viele Lesevorgänge in den Daten gefunden wurden, die dem interessierenden Gen entsprechen. Das Stat Maker-Programm erstellt eine Excel-Datei, die die relevanten Informationen zusammenfasst, die zur Identifizierung von interagierenden Proteinen erforderlich sind.

Ebenfalls gezeigt wird die entsprechende Analyse, ob die Plasmide, die dem Beutekandidaten entsprechen, den richtigen offenen Leserahmen enthalten. Die Blast-Abfrage wertet jedes Gen aus und ordnet die verschiedenen Positionen entsprechend ihrer Häufigkeit im Datensatz, quantifiziert durch die ppm der Gesamtzahl der in der Datenbank gefundenen Verbindungen. In diesem Beispiel ist die am häufigsten vorkommende Position, die sich in ORF und In Frame befindet, Position 867, was darauf hinweist, dass das Nukleotid 867 der GenBank NCBI-Referenzsequenz NM_019648 der Anfang des Beutefragments ist.

Diese Grafik zeigt eine hypothetische Sequenz und wie das Fünf-Primzahl-Oligo so gestaltet wird, dass es den korrekten Rahmen und Fusionspunkt zwischen der Gal4-Aktivierungsdomäne und der interessierenden Beutesequenz erfasst. Dieses Fenster "Lesetiefe" zeigt an, wie viele Sequenzen in den Daten gefunden wurden, die den Nukleotidpositionen der interessierenden Sequenz entsprechen. Einmal gemeistert, kann die Datenverarbeitung in 10 bis 20 Stunden erfolgen, die meiste Zeit unbeaufsichtigt.

DEEPN-Screenings und die entsprechende informatische Analyse werden Forschern in einer Vielzahl von Bereichen den Weg ebnen, um Interaktionsnetzwerke mit ihrem interessierenden Protein zu erforschen. Das MAPster-Programm wurde entwickelt, um das Mapping von Sequenzdateien aus DEEPN-Experimenten zu erleichtern. Es bietet auch eine benutzerfreundliche Methode zum Zuordnen von Sequenzdateien zu Referenz-DNA für eine Vielzahl von Anwendungen, wie z. B. RNA-Seq oder ChIP-Seq.

Obwohl die DEEPN-Software speziell für die Verarbeitung von Chargen-Hefe-Zwei-Hybrid-Daten entwickelt wurde, kann sie auch zur Verarbeitung von RNA-Seq-Daten verwendet werden. Das Stat Maker-Programm sagt nicht nur voraus, welche Gene eine authentische Hefe-Zwei-Hybrid-Interaktion ergeben, sondern sammelt auch eine Reihe anderer Parameter, wie z. B. Leserahmeninformationen, so dass die Forscher ihre Kandidatentreffer schnell filtern können. Sobald die interagierenden Proteine identifiziert sind, ist es wichtig, die Wechselwirkungen mit Standard-Hefe-Zwei-Hybrid-Assays, biochemischen Pull-Down-Assays oder verwandten Methoden zu validieren.