Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Adipositas zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung der Schlüsselfaktoren und Mechanismen, die eine robuste adipogene Reaktion während des Umbaus des Fettgewebes verhindern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung von CD34+CD31+Endothelzellen aus menschlichem Fettgewebe ermöglicht, beginnend mit kleinen Gewebemengen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmal, als wir Zellen im menschlichen Fettgefäßsystem identifizieren wollten, die auf adipogene Stimulation reagieren.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Zellisolierung aufgrund des oft begrenzten Zugangs zu frischem menschlichem Fettgewebe schwierig zu praktizieren sind. Entnahme von humanem, omentalem und subkutanem Fettgewebe von menschlichen Probanden, die sich einer bariatrischen Operation unterziehen. Unmittelbar nach der Gewebeextraktion ist das humane omentale und subkutane Fettgewebe in getrennten Durchstechflaschen aufzubewahren, die Hanks gepufferte Salzlösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin-Streptomycin bei Raumtemperatur enthalten.

Sobald die Probe nach der Gewebeextraktion im Labor eintrifft, reinigen und entfernen Sie vorsichtig fibrotische und kauterisierte Abschnitte des Gewebes mit einer 70%igen Ethanol-Tupfer und einer Schere und Pinzette. Wiegen Sie das Fettgewebe und teilen Sie es in fünf Gramm Aliquote für die Kollagenase-Verdauung auf. Mit zwei Scheren fünf Gramm des Fettgewebes in fünf Millilitern einer Kollagenaselösung in einem Szintillationsfläschchen bei Raumtemperatur fein zerkleinern.

Fügen Sie dem gehackten Gewebe weitere 10 Milliliter Kollagenaselösung hinzu, um insgesamt 15 Milliliter zu erhalten. Die Proben werden eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad unter ständigem Schütteln verdaut. Gießen Sie die Proben nach dem Aufschluss in die 20-Milliliter-Spritze mit stumpfem Ende.

Filtern Sie die Probe durch ein 250-Mikron-Nylonnetz in das konische 50-Milliliter-Röhrchen, um Adipozyten und stromale Gefäßzellen von unverdautem Gewebe zu trennen. Waschen Sie das Szintillationsfläschchen mit 10 Millilitern KRBBS aus und gießen Sie die Wäsche durch den Filter, um die Restzellen zu sammeln, bevor Sie die gefilterten Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie dann eine 20-Milliliter-Spritze und eine Pipettiernadel mit 20 Gauge x sechs Zoll, um die stromale Gefäßfraktionsschicht zu entfernen und in ein sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Fügen Sie 10 Milliliter KRBBS hinzu und lassen Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Tisch ruhen. Bewahren Sie die stromalen Gefäßfraktionen aus beiden Depots für die weitere Verarbeitung auf Eis auf. Drehen Sie die stromalen Gefäßfraktionen fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 500 mal G.

Nehmen Sie die Proben aus der Zentrifuge und gießen Sie den Überstand vorsichtig ab, wobei Sie das Pellet mit den Zellen der stromalen Gefäßfraktion aufbewahren. Suspendieren Sie die Zellpellets vorsichtig wieder in fünf Millilitern PBS. Nachdem Sie die Proben erneut gedreht haben, entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen wieder in einem Milliliter PBS und zählen Sie die Zellen.

Pelletieren Sie die Proben ein drittes Mal und suspendieren Sie das Pellet erneut in 100 Mikrolitern CD34-Isolationspuffer. Fügen Sie 10 Mikroliter CD34-Cocktail hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann fünf Mikroliter magnetische Kügelchen hinzu und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie anschließend 2,5 Milliliter CD34-Isolationspuffer zu jeder Probe und legen Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in den Magneten. Drehen Sie den Magneten fünf Sekunden lang um, um den Isolationspuffer abzugießen. Nachdem Sie diesen Vorgang viermal wiederholt haben, entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten und fügen Sie zwei Milliliter CD34-Isolationspuffer hinzu.

Nach einer weiteren Zentrifugation werden die CD34+-Zellpellets in einem Milliliter CD34-Isolationspuffer wieder suspendiert und die Zellen gezählt. Pelletieren Sie die Zellen erneut und suspendieren Sie das Pellet wieder in 250 Mikrolitern Puffer B und 250 Mikrolitern Waschpuffer. Als nächstes werden die CD31-Kügelchen durch Vortexen des Röhrchens gründlich resuspendiert, dann 20 Mikroliter CD31-Kügelchen zum resuspendierten Zellpellet hinzugefügt und die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert

Vor der Zelltrennung fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer hinzu, um das Sieb auszugleichen. Tragen Sie dann die vorbereitete Mischung aus resuspendierten Zellen in CD31-Kügelchen auf das Sieb auf. Waschen Sie das Sieb mit fünf Millilitern Waschpuffer in kreisenden Bewegungen für ein Gesamtvolumen von 20 Millilitern.

Befestigen Sie den Konnektor an einem sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen und schließen Sie die Schleuse. Nachdem Sie das Sieb an den Anschluss angeschlossen haben, fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer entlang der Wand des Siebs hinzu und fügen Sie dann einen Milliliter aktivierten Puffer D entlang der Wand des Siebs hinzu. Schwenken Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter Waschpuffer hinzu und trennen Sie die Zellen von den Kügelchen, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Öffnen Sie die Schleuse und lassen Sie die abgelösten Zellen in das konische 50-Milliliter-Röhrchen fließen. Waschen Sie das Sieb 10 Mal mit jeweils einem Milliliter Waschpuffer

Entsorgen Sie den Konnektor und das Sieb und zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 300 mal G bei 4 Grad Celsius. Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Millilitern des vollständigen EGM2-Mediums für die Kultur. Züchten Sie die Zellen in mit Sechs-Well-Gewebekulturen behandelten Platten mit vollständigem EGM2-Medium in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Tauschen Sie das Medium alle drei bis vier Tage aus, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Anschließend säen Sie etwa 100 bis 200 Tausend Zellen in Sechs-Well-Platten aus, wobei Sie sicherstellen, dass für jedes Depot doppelte Wells vorhanden sind, und kultivieren Sie sie zwei Tage lang in vollständigen EGM2-Medien. Nach zwei Tagen saugen Sie alle Wachstumsmedien ab.

Ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter DMEM/F-12-Medium mit 5 % FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin-Streptomycin für die Kontrollzellen. Ersetzen Sie für die Behandlungszellen das Medium durch zwei Milliliter Adipogenese-Medien. Inkubieren Sie die Zellen 13 Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator und tauschen Sie die entsprechenden Medien alle drei bis vier Tage aus.

Es werden repräsentative Ergebnisse gezeigt, die die typische endotheliale Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie der CD34+CD31+-Zellen nach zwei Passagen in Kultur zeigen. Ebenfalls demonstriert wurde die Fähigkeit von Zellen, Tubuli zu bilden, wenn sie wie erwartet in Matrigel kultiviert werden. Die gleichmäßige Aufnahme von fluoreszenzmarkiertem acetyliertem LDL zeigt das Vorhandensein einer homogenen Zellpopulation mit endothelialer Identität.

Hier ist die Öl-Rot-O-Färbung von neutralen Lipidtröpfchen in CD34+CD31+-Zellen nach 13-tägiger adipogener Induktion. Repräsentative Reaktionen von Zellen aus omentalen und subkutanen Depots von drei verschiedenen menschlichen Probanden werden gezeigt, um die große Variabilität in der Reaktion auf adipogene Induktion zwischen Fettdepots desselben Spenders und zwischen Spendern zu veranschaulichen. Dieses Bild zeigt die fluoreszierende intrazelluläre Lipidfärbung in CD34+C31+-Zellen nach adipogener Induktion für 13 Tage.

Das Bild zeigt Zellen mit unilokulären Lipiden, multilokulären Lipiden und ohne Lipidansammlung. Die Real-Time-PCR zeigt die Expression des Pan-Adipozyten-Markers Adiponektin und der braun-beigen Marker CIDEA und UCP-1. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Zellen, die einer adipogenen Induktion folgen, molekulare Marker exprimieren, die mit einem gemischten weißbeigen Adipozyten-Phänotyp übereinstimmen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, frisches menschliches Fettgewebe zu verwenden, das entnommen und nicht länger als zwei Stunden gelagert wurde. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Durchflusszytometrie, Immunhistochemie und RT-PCR durchgeführt werden, um spezifische Untergruppen ansprechender Zellen zu identifizieren, und die Expression reifer Adipozytenmarker, die zur Identifizierung eines beigen braunen Adipozyten-Phänotyps verwendet werden können.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Fettleibigkeit, um die Rolle von Fettgewebe, Gefäßzellen und Adipogenese beim Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie CD34+31+-Zellen isoliert, kultiviert und expandiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. Vorschriften zur biologischen Sicherheit.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Adipositas-assoziierten Komorbiditäten, wie z. B. Insulinresistenz, da sie die adipogene Reaktion von Zellen auf einen möglichen therapeutischen Eingriff identifiziert.