Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Diese Forschung kann helfen, alle Fragen in ihnen biochem Zählung und Methodik Bereich wie eine Analyse der Entwicklungsrechte in Nematode zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Proteinfällung in Deruktion und Trinken und Homogenisierung der Würmer. Starten Sie dieses Experiment, indem Sie Den E.coli OP50-Stamm in 300 Millilitern LB-Brühe flüssiges Medium bei 37 Grad Celsius über Nacht anbauen.

Bewahren Sie erfolgreiche OP50 bei vier Grad Celsius auf. Pipette zwei Milliliter der kultivierten OP50 auf mindestens drei zuvor vorbereiteten NGM, oder Nematode Growth Media Agar Platten und von Hand wirbeln die Platte verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur über Nacht, um eine dünne Schicht OP50 zu schaffen.

Als nächstes verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um ein Stück Agar von einer Platte mit Würmern zu pflücken, um mindestens 100 Würmer zu jeder OP50 NGM Platte hinzuzufügen. Kultur mindestens drei Platten mit den Würmern bei 20 Grad Celsius, bis die Würmer Erwachsenenstadium erreichen, was unter stereoskopischem Mikroskop bestätigt wird. Suchen Sie gravid Hermaphrodite mit Eiern gefüllt mit einem stereoskopischen Mikroskop.

Nachdem Sie fünf Milliliter S-Puffer zu Platten hinzugefügt haben, verwenden Sie Pasteur Pipette, um die Würmer von allen drei Platten auf ein 15 Milliliter konisches Rohr zu übertragen. Waschen Sie die Würmer dreimal, indem Sie 15 Milliliter S-Puffer hinzufügen und dann bei 30 Sekunden bei Raumtemperatur 30 Mal G zentrifugieren. Wenn das Volumen des S-Puffers fünf Milliliter überschreitet, entfernen Sie den überschüssigen Puffer nach dem Zentrifugieren.

Für eine erfolgreiche Exonisierung und Masseneiisolierung lösen Sie die Würmer in 0,5 Milliliter alkalischer Hypo-Chloratlösung auf. Mischen Sie durch Invertieren und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten. Zentrifuge bei 1, 400 U/min für 30 Sekunden, um die Lösung zu entfernen.

Verwenden Sie 15 Milliliter S-Puffer, um das Eipellet zu waschen. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diese Wäsche mindestens dreimal. Nach der letzten Wäsche setzen wir das Pellet in fünf bis sechs Milliliter S-Puffer aus, ohne E.coli und bebrüten die Eier über Nacht bei 20 Grad Celsius, um sie zu schlüpfen und die H-Synchronkultur der L1-Bühnenlarven zu erreichen.

Pipette 10 Mikroliter S-Puffer mit L1-Würmern auf drei Deckschscheinen. Zählen Sie die Larven unter einem stereoskopischen Mikroskop und berechnen Sie den Durchschnitt, um die ungefähre Anzahl der L1-Bühnenlarven zu bestimmen. Schließlich übertragen Sie die L1-Bühnenlarven auf fünf NGM Agar-Platten mit OP50 und wachsen sie bei 20 Grad Celsius bis zum jungen Erwachsenenstadium, in dem die Selbstbefruchtung stattfindet und ein paar Eier gelegt werden.

Beobachten Sie die Würmer jeden Tag unter dem Mikroskop und sammeln Sie dann den jungen Erwachsenen oder fünf Tage alte Würmer. Um nur lebende Würmer auszuwählen, fügen Sie die in drei bis vier Milliliter S-Puffer aufgehängten Würmer zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu. Dann fügen Sie ein gleiches Volumen von eiskalten 60%Saccharose und mischen.

Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1,500 mal G bei vier Grad Celsius für 15 Sekunden. Verwenden Sie dann eine Pasteur Pipette, um die Würmer vorsichtig von der Wand des Rohres zu bewegen, und entfernen Sie dann die schwimmenden Würmer in ein frisches Rohr. Füllen Sie das Rohr mit S-Puffer, um die Würmer zu waschen, und Zentrifuge bei 1500 mal G bei vier Grad Celsius für 30 Sekunden.

Entfernen Sie den Puffer und wiederholen Sie die Wäsche zwei weitere Male. Nach dem dritten Waschen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, stellen Sie sicher, keine Würmer zu entfernen, und verwenden Sie eine 1.000 Mikroliter Pipettenspitze, um das nasse Volumen der gewaschenen Würmer zu messen. Für die Proteinfällung verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um die gewaschenen Würmer zu einem gleichen Volumen von eiskalten 10% Trichloressigsäure in einem homogenisator auf Eis gelegten Homogenisator hinzuzufügen.

Homogenisieren Sie mit 40 Hüben Passel mit Rotation, bis zu 1, 300 RPM. Verwenden Sie einen Ultraschallhomogenisator mit 20% Zollzyklus, um das Homogenat zu beschallen. Verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um das Homogenat auf 1,5 Milliliter Rohr auf Eis gelegt zu übertragen.

Nach der Übertragung des Homogenats auf ein Mikrozentrifugenrohr zentrifugieren Sie bei 8.000 Zeit G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um es zu klären. Den Überstand in ein frisches Rohr geben und vier Molkaliumchlorid hinzufügen und 20 Minuten auf Eis brüten, um ihn zu neutralisieren. Dann zentrifugieren Sie es bei 8 000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Rohr und lagern Sie bei 80 Grad Celsius, bis er für weitere Tests benötigt wird. Um die Laktatkonzentration zu messen, verwenden Sie ein kolorimetrisches Assay-Kit, um doppelte Analysen für die Testproben durchzuführen. Fügen Sie 10 Mikroliter der Testproben zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu, und fügen Sie dann laktat-Assay-Puffer zu jeder Probe hinzu, um das Volumen auf 15 Mikroliter einzustellen.

100 Millimolar L+Laktat Standard mit Laktat-Assay-Puffer auf einen Millimolar verdünnen. Dann, in eine Reihe von Brunnen, fügen Sie Null, zwei, vier, sechs, acht und 10 Mikroliter von verdünnten L + Laktat Standard. Fügen Sie 50 Mikroliter Reaktionsmischung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, die für mindestens 30 Minuten vor Licht geschützt ist, damit sich die Farbe entwickelt.

Schließlich verwenden Sie einen Mikroplattenleser, um die Absorption jedes Brunnens bei 570 Nanometern zu messen. Subtrahieren Sie die Absorption des Hintergrundsteuerungsmixes von der Absorption des Reaktionsmixes. Zeichnen Sie dann die Laktat-Standardkurve auf, und berechnen Sie die Laktatkonzentrationen aus der Kurve, indem Sie jede Konzentration mit 2,25 multiplizieren.

Verwenden Sie ein kolorimetrisches Assay-Kit, um die Pyruvatkonzentration in den Testproben zu messen und Duplexuntersuchungen durchzuführen. Fügen Sie 10 Mikroliter der Testproben zu verschiedenen Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu und fügen Sie jeder Probe 90 Mikroliter Arbeitsreagenz hinzu. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur bedeckt.

Legen Sie dann die Platte in den Mikroplattenleser, um die Saugfähigkeit jedes Brunnens bei 570 Nanometern zu messen. Zeichnen Sie die Pyruvat-Standardkurve und berechnen Sie die Pyruvatkonzentrationen aus der Standardkurve, indem Sie jede Konzentration mit 2,25 multiplizieren. Und schließlich, um die Proteinkonzentration in den Testproben zu messen, verwenden Sie ein kolorimetrisches Assay-Kit, wie im Textprotokoll beschrieben.

Nach der Proteinfällung können farbmetrische Assays zur quantitativen Bestimmung von Laktat- und Pyruvatkonzentrationen verwendet werden. Dieses Experiment zeigt die Genauigkeit von kolorimetrischen Assays im Gegensatz zu früheren Berichten in C.Elegans. Darüber hinaus sind diese Assays ausreichend empfindlich, um Laktat- und Pyruvatkonzentrationen auch in kleinen Proben in kurzer Zeit zu messen.

Um Laktat und Pyruvat in C.elegans genau zu erkennen, ist es wichtig, proteinfällend während der Homogenisierung der Würmer durchzuführen. Die Menge an Laktat und Pyruvat ist höher, wenn Proben während der Homogenisierung proteinvergefällt werden, verglichen mit intakter zytosolischer Fraktion oder nach der Homogenisierung, wenn überhaupt kein Laktat oder Pyruvat nachgewiesen wurde.