Name: Hochauflösende Vergleich der bakteriellen Konjugation Frequenzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Konjugationsfrequenzen von Bakterien mit hochauflösender Filtermating-Methode vergleichen. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Messungen des Plasmidtransfers zwischen Donor- und Rezipientenstämmen.

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Wir danken Dr. K. Kamachi des National Institute of Infectious Diseases (Japan) für die Bereitstellung von pBP136 und Prof. Dr. H. Nojiri an der University of Tokyo (Japan) für die Bereitstellung von pCAR1. Wir sind auch dankbar, Professor Dr. Molin Sølen der Technical University of Denmark für die Bereitstellung von pJBA28. Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (Grant-Nummern 15H 05618 und 15KK0278), MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

1. Vorbereitung eines Spenders mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP)- und Kanamycin Resistenz-Gen-Tags Plasmide
<ol><li>Einführung von Markergenen in der Ziel-Plasmid-pBP136 Hinweis: Ziel dieses Protokolls ist es, pBP136 zu generieren::Gfp. Die Bakterienstämme und Plasmide verwendet in dieser Studie sind in Tabelle 1aufgeführt.<ol>
<li>Kulturen von Escherichia coli DH10B beherbergen pBP13617 in 5 mL sterile Luria Brühe (LB) und E. Coli S17-1λPir18 pJBA2819 beherbergen wachsen [enthält eine Kanamycin (Km)-Resistenz-Gen und Gfp mut3 * gen mit seinen Promotor und Terminator in einem Mini-Tn-5] in 5 mL sterile LB mit 50 μg/mL Km bei 37 ° C über Nacht (O/N, 16 – 24 h) mit schütteln mit 200 Umdrehungen pro Minute (u/min).</li>
		<li>Ernten und waschen<ol>
<li>Ernten Sie 1 mL der jeweiligen Kultur zu, legen Sie sie in eine 2 mL Reaktionscup und Zentrifuge (10.000 × g, Raumtemperatur, 2 min). Dann den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
			<li>Zentrifuge wieder (10.000 × g, Raumtemperatur, 2 min), und in 500 μl steriler PBS aufzuwirbeln.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Filtern, Paarung<ol>
<li>Bereiten Sie sterile LB-Platten (mit 1,6 % Agar), und setzen Sie einen sterilen 0,22 μm Pore Größe Membranfilter auf. Mix 500 μL der E. Coli S17-1λPir beherbergen pJBA28 mit E. Coli DH10B beherbergen, pBP136 und Stelle die Mischung auf dem Filter auf der LB-Platte. Inkubieren Sie die Platte O/N bei 30 ° c Entfernen Sie den Filter von der LB-Platte, legen Sie sie in ein Plastikrohr steril 50 mL, und 1 mL sterile PBS. Hinweis: pJBA28 in Gegenwart von Π Protein kodiert, indem der Pir gen18, replizieren kann und von S17-1λPir auf DH10B übertragen werden können. pBP136 trägt keine Marker-gen17 und kann von DH10B auf S17-1λPirübertragen werden. Daher konnten wir S17-1λPir beherbergen pBP136 und pJBA28 von DH10B beherbergen pBP136 und die Mini-Tn-5 (umgesetzt in das Chromosom oder pBP136) in diesem Stadium nicht unterscheiden. Dann haben wir Mischungen von ihnen als Spender in den nachfolgenden Schritten (1.1.4.–1.1.5.).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wachsen eine O/N Kultur der oben genannten Paarung Mischung in sterilen LB mit 50 μg/mL Km bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min und eine Kultur der Pseudomonas Putida KT2440 [Km-Sensitive (Kms), Rifampicin-Sensitive (Rif-s), Gentamicin-empfindliche (GV-s) und Tetracyclin resistent (Tc-R)] in 12,5 μg/mL Tc bei 30 ° C mit Schütteln bei 200 u/min-haltigem Medium.</li>
		<li>Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden Sie sie (die Paarung Mischung und KT2440) für Filter (O/N, 30 ° C) wie in Schritt 1.1.3 Paarung.</li>
		<li>Bereiten Sie sterile LB-Platten mit 50 μg/mL Km und 12,5 μg/mL Tc (LB + Km + Tc Platten).</li>
		<li>Die resuspendierte Mischung auf die Membranfilter mit sterilen PBS verdünnen (101– 105-Falten), und dann Verbreitung jeder Verdünnung auf LB + Km + Tc Platten und inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 2 – 3-d.</li>
		<li>Wählen Sie Kolonien von den Platten, wachsen Sie eine O/N Kultur in sterilen LB mit Km und Tc sowie P. resinovorans CA10dm4RG (Riff und GV-R)6 in sterilen LB mit Rif (25 μg/mL) und Gm (30 μg/mL) bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute. Hinweis: Wie beschrieben in die vorhergehende Note, die Kolonien auf der LB + Km + Tc Platten (ab 1.1.7.) kann KT2440 beherbergen pBP136 ein Mini-Tn5 und KT2440 mit einem Mini-Tn5, transportieren da pJBA28 direkt aus S17-1λPir übertragen werden könnte pBP136 und pJBA28, KT2440 beherbergen. Deshalb eine weitere Paarung mit p. Resinovorans CA10RG erforderlich ist, um die Ziel-pBP136 mit einem Mini-Tn-5 in den folgenden Schritten zu erhalten.</li>
		<li>Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden sie wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).</li>
		<li>Bereiten Sie sterile LB-Platten mit Rif, Gm und Km (LB, Rif, Km + GV-Platten).</li>
		<li>Die Mischung auf dem Filter Aufschwemmen und verdünnen Sie es dann 101– 105-Falten, auf LB, Rif, Km + Gm verteilen Platten und inkubieren Sie die Platten für 2 – 3-d bei 30 ° C.</li>
		<li>Wählen Sie die Kolonien und prüfen Sie, ob sie pBP136 durch PCR mit spezifischen Primer für das Plasmid beherbergen.</li>
	</ol></li>
	<li>Einführung eines selektiven Markergens in der Ziel-Plasmid-pCAR1 Hinweis: Das Ziel dieses Protokolls ist es, pCAR1 zu generieren::Gfp
	<ol>
<li>Wachsen eine O/N Kultur von p. Putida KT2440 beherbergen pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tc-R)20 bei 200 u/min und 30 ° C und E. Coli S17-1λPir18 beherbergen pJBA28 in 5 mL sterilem LB enthält 50 μg/mL Km bei 200 u/min und 37 ° C.</li>
		<li>Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden sie wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).</li>
		<li>Entfernen Sie den Filter von der LB-Platte, legen Sie sie in ein Plastikrohr steril 50 mL, und 1 mL sterile PBS.</li>
		<li>Die resuspendierte Mischung mit sterilen PBS verdünnen (101– 105-Falten), und verbreiten Sie die verdünnte Mischung auf sterile selektiven LB + Tc + Km Platten. Hinweis: pCAR1 repliziert nicht in E. Coli; so p. Putida KT2440 beherbergen pCAR1 mit einem Mini-Tn5 auf LB + Tc + Km wählbar Platten.</li>
		<li>Wählen Sie eine Kolonie von der Platte, und wachsen einer O/N Kultur in sterilen LB mit Km und Tc und eine Kultur der P. resinovorans CA10dm4RG in sterile LB mit Rif und Gm (200 u/min, 30 ° C).</li>
		<li>Nach dem Ernten und waschen wie in Schritt 1.1.2, verwenden Sie die Zellen wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).</li>
		<li>Aufschwemmen der Mischung auf dem Filter und dann verdünnen Sie es auf LB, Rif, Km + Gm Platten verteilt und die Platten für 2 – 3-d bei 30 ° c inkubieren</li>
		<li>Wählen Sie die Kolonien und prüfen Sie, ob sie pCAR1 durch PCR mit spezifischen Zündkapseln für das Plasmid beherbergen.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Übertragbarkeit der tagged-Plasmide bestätigen und die Spendern für die nächsten Schritte vorbereiten Hinweis: Das Ziel dieses Protokolls ist, bestätigen die Übertragbarkeit von den oben genannten konstruierten Plasmiden und die Spendern für die nächsten Schritte vorbereiten.<ol>
<li>Wachsen eine O/N Kultur von p. Resinovorans CA10dm4RG beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp in sterilen LB mit Km und eine Kultur der p. Putida SMDBS [Kms, Gms, RifR, TcR, LacI Q, in denen PA1/O4/O3-gfpmut3* drückt sich nicht wegen seiner chromosomalen LacIQ gen]21 in 3 mL LB mit Tc (200 u/min, 30 ° C).</li>
		<li>Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden sie wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).</li>
		<li>Setzen Sie den Filter in einem Plastikrohr steril 50 mL, und mit 1 mL sterile PBS aufzuwirbeln. Die resuspendierte Mischung mit sterilen PBS verdünnen (101– 105-Falten), verbreiten Sie die verdünnte Mischung auf sterile selektiven LB + Tc + Km Platten.</li>
		<li>Wählen Sie die Kolonien und prüfen Sie, ob sie jeweils den Plasmiden durch PCR mit spezifischen Primern Hafen. Hinweis: Bestätigung über die Einfügeposition des Mini-Tn5 durch direkte Sequenzierung nach der Plasmid-Extraktion ist optional, zu bestätigen, dass die Einfügung die Übertragungsfunktion der Plasmide nicht beeinflusst.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Berechnung der Konjugation Frequenz durch die MPN-Methode
<ol><li>Bereiten Sie sterile LB + Km und LB + GV-Platten.</li>
	<li>Wachsen eine O/N Kultur von p. Putida SMDBS beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp in 3 mL steril mit Km und eine Kultur der p. Putida KT2440RGD LB (GmR, RifR) in 3 mL LB mit Gm (140 u/min, 30 ° C).</li>
	<li>Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, für Filter, die Paarung bei 30 ° C für 45 Minuten wie in Schritt 1.1.3 verwenden.</li>
	<li>Seriell Verdünnen der oben genannten Spender und Empfänger (101 – 107) Kultur und breitete es auf LB + Km (Spender) oder LB + Gm (Empfänger) Platten (jeweils in dreifacher Ausfertigung) um die Koloniebildenden Einheiten (KBE) zählen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 2 d.</li>
	<li>Die Mischung auf dem Filter in sterilen LB mit Km und Gm Aufschwemmen und seriell verdünnen (von 21 224– 107,2) mit einer 96-Well Zellplatte Kultur (in Vierfachbestimmungen).</li>
	<li>Gegebener Zeit (2 d bei 30 ° C) inkubieren Sie 96-Well-Platte.</li>
	<li>Die KBE des Spenders und des Empfängers auf den Platten (Schritt 2.4.) zählen Sie und die Anzahl der Vertiefungen, in denen die Transconjugants wachsen.</li>
	<li>Berechnen Sie die MPN und seine Abweichung mithilfe der MPN-Berechnungsprogramm von Jarvis Et al.entwickelt. 22, der an http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls zur Verfügung steht.<ol>
<li>Geben Sie den Namen des Experiments (z. B. "test"), das Datum des Experiments (z. B. 2018/4/9), die Anzahl der Versuchsreihen und die Max. lol Verdünnungen (geben Sie "24") in Zeile #7 des "Programms" Blatt der Excel-Datei ("MPN_ver5.xls").</li>
		<li>Geben Sie "2-1 (= 0,5) bis 2-24 (= 5.96 × 10-8)" in der Spalte 'Verdünnung Faktor d''0,01' Spalte 'Volumen in ml oder g w'und 4' in ' Nr. der Röhren-n' in den automatisch erzeugten Tabellen von input-Daten.</li>
		<li>Geben Sie die Anzahl der Vertiefungen, in denen die Transconjugants bei jeder Probenverdünnung (0 – 4) wachsen.</li>
		<li>Drücken Sie den rechten oberen "Ergebnisse berechnen"-Knopf, und rufen Sie dann die Ergebnisse (MPN/μl) und ihren 95 % Vertrauensbereich (unterer und oberer).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnen Sie die Konjugation Häufigkeit der Plasmide dividiert die Anzahl der Transconjugants (MPN/mL) durch die Zahl der Spender und Empfänger Zellen (KBE/mL).</li>
</ol>3. Vorbereitung zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation
<ol><li>Wachsen eine O/N Kultur von p. Putida SMDBS beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp in 3 mL steril mit Km und eine Kultur der p. Putida KT2440RGD LB (GmR, RifR) in 3 mL sterile LB mit Gm mit 300 mL Fläschchen (140 u/min, 30 ° C) als Precultures.</li>
	<li>200 μL der Vorkultur in 200 mL frische sterile LB, Km oder Gm in 500 mL Flaschen enthalten und bei 30 ° C mit Schütteln bei 140 u/min inkubieren.</li>
	<li>Messung die Trübung bei 600 nm (OD600) der Kultur unter Verwendung eines UV-VIS Spektralphotometer und Ort die Kultur, verdünnt in LB (101– 108-Falten Verdünnungen), auf eine LB-Platte mit Km oder GM Incubate diese LB-Platten bei 30 ° C für 1 – 2 d , und bestimmen die KBE.</li>
	<li>Plot der OD-600 -Werte und die KBE mit Wachstumszeit Wachstumskurven des Spenders und des Empfängers zu erzeugen.</li>
	<li>Wachsen Sie Kulturen des Spenders und des Empfängers Stamm auf Mid Log-Phase, anhand der Wachstumskurve.</li>
	<li>Nach dem Ernten und Waschen der Zellen, bereite 101– 103 KBE des Spenders in 10 μL LB und 105– 107 KBE des Empfängers in 100 μL LB.</li>
	<li>Mischung 10 μL des Spenders und 100 μL der Empfänger Kulturen in unterschiedlicher Dichte in 96-Well-Platten (in dreifacher Ausfertigung). Z. B. Mischung 101 KBE des Spenders und 105 KBE des Empfängers und fügen sie alle 96 Wells und Mischung 101 KBE des Spenders und 106 KBE des Empfängers in einem anderen 96-Well-Platte, und so weiter.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 45 min, und fügen Sie hohe Konzentrationen von Antibiotika (100 μg/mL Km und 60 μg/mL Gm) in jede Vertiefung, Konjugation weiter zu hemmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C für 2 d.</li>
	<li>Die Anzahl der Bohrungen in denen Transconjugants wachsen.</li>
	<li>Wählen Sie die Empfänger Dichte, die eignet sich für die Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation anhand der oben genannten Daten (Transconjugants sollte bei mindestens 1 auch von einer 96-Well-Platte gefunden werden). Hinweis: Transconjugants wachsen in alle Wells, wenn die Dichte von Spender und Empfänger Zellen hoch sind und mehr als eine Konjugation in einen Brunnen tritt. Im Gegensatz dazu wird keine Transconjugants in jedem Brunnen gefunden werden, wenn die Zelldichte zu niedrig ist. Im folgenden Abschnitt wird eine einzelne Spender Zelle in einen Brunnen sortiert. Daher sollten die Empfänger Dichte maximal sein.</li>
</ol>4. Schätzung der Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation
<ol><li>Bereiten Sie 200 mL einer Mid Log-Phase Kultur des Spenders p. Putida SMDBS beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp und der Empfänger p. Putida KT2440RGD, wie in 3.6-3.7 beschrieben.</li>
	<li>Platz 106 KBE des Empfängers in 100 μL LB in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Richten Sie die FACS-System (Flow Cytometry und Zelle Sorter mit einem Roboterarm, 488 nm Argonlaser und eine Düse Öffnung 70 μm). Legen Sie auf forward Scatter (FSC), mit einem Schwellenwert von 1 % als Erwerb Auslöser. Stimmen der H-Gain und eine Verstärkung des FSC und Side Scatter (SSC) bei maximaler Empfindlichkeit, die falsche positive Signale, mit PBS als Negativkontrolle ausschließen kann. Festlegen der Art Tores basierend auf FSC und SSC und 0,5 Tropfen Sortiermodus für maximale Art Reinheit.</li>
	<li>Art einer einzigen Spender Zelle durch FACS auf eine LB-Platte (384 verschiedene Flecken), brüten die Platte bei 30 ° C für 2 d und dann zählen, wie viele Kolonien auf der Platte aus der sortierten Zellen angezeigt werden. Hinweis: Dieses Verfahren ist für die Validierung des eingestellten Tores. Wenn 384 Kolonien auf der Platte vorhanden sind, bedeutet dies, dass 100 % der sortierten Zellen Kolonien bilden kann. Die durchschnittliche Gültigkeit der Sortierung ist immer 90 – 95 %.</li>
	<li>Sortieren einer einzigen Spender Zelle durch FACS in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit dem Empfänger (4.2).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 45 min. bei 30 ° C, und fügen Sie hohe Konzentrationen von Antibiotika (100 μg/mL Km und 60 μg/mL Gm) in jede Vertiefung zur Verhinderung weiterer Konjugation.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C für 2 d.</li>
	<li>Die Anzahl der Brunnen in der Transconjugants als wuchs bestimmt durch Sichtkontrolle mit dem bloßen Auge.</li>
	<li>Berechnen Sie die Wahrscheinlichkeit eines Spenders initiierte Konjugation dividiert die Anzahl der Brunnen mit Transconjugants durch die Gesamtzahl der Brunnen, in denen der Spender sortiert wurde.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir Ihnen eine hochauflösende Protokoll zum Erkennen von Unterschieden in der Konjugation Frequenz unter verschiedenen Bedingungen, mit einer MPN-Methode zur Schätzung der Anzahl der Transconjugants. Ein wichtiger Schritt in dem Protokoll ist die Mischung von Spender und Empfänger nach der Paarung bis keine Transconjugants wachsen verdünnen. Ein weiterer Schritt ist die selektive flüssigen Medium zur Verhinderung weiterer Konjugation hohe Konzentrationen von Antibiotika hinzufügen. Diese Verfahren könne...

Bakterielle Konjugation von mobile genetische Elemente, konjugative Plasmide und integrative und konjugative Elemente (ICEs) ist wichtig für die horizontale Verbreitung der genetischen Information. Es kann fördern schnelle bakterielle Entwicklung und Anpassung und multidrug-Resistenz-Gene-1,-2zu übertragen. Die Konjugation Frequenz kann beeinflusst werden, durch Proteine codiert auf die konjugative Elemente für die Mobilisierung der DNA (MOB) und Paarung Paarbildung (MPF), einschließlich Geschlecht Pili, die laut MOB und MPF Typ3,4eingestuft sind, 5. Es kann auch durch die Spender und Empfänger Paar6 und die Wachstumsbedingungen der Zellen7,8,9,10,11,12 (beeinflusst werden Wachstumsrate, Zelldichte, feste Oberfläche oder flüssigen Medium, Temperatur, Nährstoffverfügbarkeit und die Anwesenheit von kationen). Um zu verstehen wie die konjugative Elemente unter Bakterien verbreiten, ist es notwendig, Konjugation Frequenz im Detail zu vergleichen.
Die Konjugation Frequenz zwischen Spender und Empfänger-Paare nach der Paarung werden in der Regel mit konventionellen Methoden wie folgt geschätzt. (i) zuerst werden die Zahlen von Spender und Empfänger Kolonien gezählt. (Ii) dann werden die Empfänger Kolonien, die die konjugative Elemente erhalten (= Transconjugants) gezählt; (Iii) und schließlich die Konjugation Frequenz errechnet sich durch Division der Koloniebildenden Einheiten (KBE) von der Transconjugants von denen der Spender oder Empfänger13. Wenn Sie diese Methode verwenden, ist der Hintergrund jedoch durch zusätzliche Konjugation Ereignisse, die auch, auf die selektive Platten verwendet auftreten können, um Transconjugants zu erhalten, wenn die Zelldichte hoch10ist hoch. Daher ist es schwer zu erkennen, kleine Unterschiede in der Häufigkeit (unter 10-divisibel Unterschied). Wir hat vor kurzem eine wahrscheinlichste Anzahl (MPN) Methode mit flüssigen Medium mit einer höheren Konzentration von Antibiotika. Diese Methode reduziert den Hintergrund durch die Hemmung weitere Konjugation in selektiven Medium; So konnte die Konjugation Frequenz mit höherer Auflösung geschätzt werden.
Konjugation kann in drei Schritte unterteilt werden: (1) Befestigung der Spender-Empfänger koppeln (2) die Einleitung der konjugative Übertragung und (3) Dissoziation der paar14. Während der Schritte (1) und (3) gibt es physikalische Interaktion zwischen Spender und Empfänger Zellen; So können Zelldichte und die Umweltbedingungen diese Schritte beeinflussen, obwohl die Merkmale des Sex-Pili auch wichtig sind. Schritt (2) ist wahrscheinlich durch den Ausdruck von mehreren Genen in Konjugation als Reaktion auf äußere Veränderungen, geregelt, die durch verschiedene Merkmale von Plasmid, Spender und Empfänger betroffen sein könnten. Obwohl die physische Anlage oder Ablösung der Spender-Empfänger-Paare mathematisch kann eine Schätzung der Zellen als Partikel verwenden simuliert werden, sollte die Häufigkeit der Schritt (2) experimentell gemessen werden. Es gab ein paar Berichte über direkte Beobachtungen wie oft Geber initiieren können Konjugation [Schritt (2)] mit Fluoreszenz-Mikroskopie15,16; Diese Methoden sind jedoch nicht Hochdurchsatz-da eine große Anzahl von Zellen überwacht werden muss. Daher entwickelten wir eine neue Methode zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Schritt (2) mittels Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS). Unsere Methode kann auf alle Plasmid, ohne Identifizierung der wesentlichen Gene für Konjugation angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>IsoFlow</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8599600</td><td>Mantellösung</td></tr><tr><td>Fluorsphären (10 &mu; m)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>6605359</td><td>Beads für die Einrichtung des FACS-Inkubators</td></tr><tr><td></td><td>Yamato Scientific Co. Ltd</td><td>211197-IC802</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS-Spektralphotometer UV-1800</td><td>SIMADZU Corporation</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>NIPPON Genetics Co, Ltd</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Petrischale</td><td>AXEL</td><td>1-9668-01</td><td>zur Validierung der Sortierung</td></tr><tr><td>Membranfilter</td><td>ADVANTEC</td><td>C045A025A</td><td>für Filter-Gegenpipetten</td></tr><tr><td></td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000</td><td>0,5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L, 100-1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Pippetes</td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP</td><td>0,5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Wako</td><td>185-01003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Wako</td><td>077-02974</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Wako</td><td>115-00342</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>AXEL</td><td>3-1491-51</td><td>JPND90-15</td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td>Fukaekasei</td><td>131-815C</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Einweg-Spinnerkolben</td><td>Corning</td><td>CLS3578</td><td></td></tr></tbody></table>

hochauflösende vergleich der bakteriellen konjugation frequenzen

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bakterielle Konjugation ist ein wichtiger Schritt in die horizontale Übertragung von Antibiotikaresistenz-Genen über ein konjugative DNA-Element. Eingehende Vergleiche der Konjugation Frequenz unter verschiedenen Bedingungen müssen verstehen, wie das konjugative Element in der Natur verbreitet. Jedoch eignen sich herkömmliche Methoden zum Vergleichen von Konjugation Frequenz nicht für eingehende Vergleiche wegen der hohen Hintergrund durch das Auftreten von zusätzlichen Konjugation Ereignissen auf der selektiven Platte verursacht. Durch Einführung einer wahrscheinlichste Anzahl (MPN) Methode und eine höhere Konzentration von Antibiotika zur Verhinderung weiterer Konjugation in selektiven flüssigen Medium haben wir erfolgreich den Hintergrund reduziert. Darüber hinaus entwickelten wir ein Protokoll für die Schätzung der Wahrscheinlichkeit wie oft Spender Zellen initiieren Konjugation durch einzelne Spenderzellen in Empfänger-Pools durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) sortieren. Im flüssigen Medium unterschiedlich rühren konnte mit zwei Plasmide, pBP136 und pCAR1, die Unterschiede in der Konjugation Frequenz in Pseudomonas Putida Zellen nachgewiesen werden. Die Frequenzen der Konjugation Einweihung waren höher für pBP136 als für pCAR1. Mit diesen Ergebnissen können wir besser verstehen, die Konjugation Features in diese zwei Plasmide.

Vergleich der Konjugation Frequenz durch die MPN-Methode
In unserem vorherigen Bericht verglichen wir die Konjugation Frequenzen von pBP136::GLP und pCAR1::Gfp in dreifach verdünnte LB (1/3 LB) flüssigen Medium mit mitreißenden unterschiedlich nach einer 45 min. Paarung mit 125 mL Spinner Fläschchen10. Wir verglichen die Konjugation Frequenzen von pBP136::GLP und pCAR1::Gfp</em...

Mit dem Ziel, die Verhaltensweisen der verschiedenen bakteriellen konjugative DNA-Elemente unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen, beschreiben wir ein Protokoll für die Unterschiede in der Konjugation Frequenz mit hoher Auflösung, einzuschätzen, wie effizient das Spender-Bakterium Konjugation initiiert.

Hochauflösende Vergleich der bakteriellen Konjugation Frequenzen

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie oft Plasmid-DNA auf verschiedene Bakterien verteilt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir durch die Reduzierung des Hintergrunds kleine Unterschiede in der Konjugationsfrequenz mit einer hohen Auflösung erkennen können. Demonstriert wird das Verfahren kosuke Yanagiya, ein Student aus meinem Labor.Um die Konjugationshäufigkeit nach wahrscheinlichster Zahl zu berechnen, filtern Sie einen Milliliter aus einer Übernacht-Spenderkultur mit einem Milliliter aus einer Übernacht-Empfängerkultur für 45 Minuten bei 30 Grad Celsius, wie gerade gezeigt. Während die Co-Kultur inkubiert, verdünnen Sie seriell die ursprünglichen Spender- und Empfängerkulturen für die Beschichtung in Dreifacharbeit auf Spender Luria Brühe, oder LB, plus Kanamycin, oder Empfänger LB plus Gentamycin-Platten für eine zweitägige Kultur bei 30 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, resuspendieren Sie die Kultur auf dem Filter in sterilem LB enthält Kanamycin und Gentamycin für serielle Verdünnung in einer 96-Well-Zellkulturplatte in Quadruplikat.Zählen Sie nach zwei Tagen bei 30 Grad Celsius manuell die koloniebildenden Einheiten oder KBE auf die Spender- und Empfängeragarplatten und die Anzahl der Brunnen, in denen die Transkonjuganten durch Lichtmikroskopie wachsen. Um die wahrscheinlichste Zahl und deren Abweichung zu berechnen, öffnen Sie das MPN-Berechnungsprogramm. Geben Sie den Namen und das Datum des Experiments, die Anzahl der Testreihen und die maximale Anzahl von Verdünnungen in Zeile sieben des Programmblatts der Tabellenkalkulationsdatei ein.Geben Sie in den automatisch erstellten Eingabedatentabellen die Formel in der Spalte Verdünnungsfaktor D, 0,01 im Volumen in Milliliter oder GW-Spalte und vier in der Spalte Anzahl der Rohre N ein. Geben Sie die Anzahl der Brunnen ein, in denen die Transkonjuganten bei jeder Probenverdünnung gewachsen sind, und klicken Sie auf Berechnungsergebnisse, um die Ergebnisse als wahrscheinlichste Anzahl pro Milliliter und die oberen und unteren 95%-Vertrauensgrenzen zu erhalten. Dividieren Sie dann die Anzahl der Transkonjuganten durch die Anzahl der Spender- und Empfängerkolonien, die Einheiten pro Milliliter bilden, um die Konjugationshäufigkeit der Plasmide zu berechnen.In diesem repräsentativen Experiment erhöhte sich die Konjugationshäufigkeit beider Plasmide bei höheren Rührraten mit einem maximalen Unterschied in der Konjugationshäufigkeit zwischen Null und 400 U/min für Kulturen, die in das pBP136:gfp-Plasmid eingeführt wurden, und zwischen null und 200 U/min für Kulturen, die in das pCAR1:gfp-Plasmid eingeführt wurden. Um die Dichte der Empfängerzellen zu bestimmen, die erforderlich sind, um die Wahrscheinlichkeit der Konjugation zu vergleichen, wurden Paarungstests mit unterschiedlichen Spender- und Empfängerdichten durchgeführt. In diesem repräsentativen Experiment wurden pBP136:gfp Transkonjugants in 100% der Brunnen nachgewiesen, die ein mal 10 bis die dritte KBE des Spenders und ein mal 10 bis fünfmal 10 bis die siebte KBE des Empfängers und solche mit einem mal 10 bis der zweiten KBE des Spenders und ein mal 10 bis 10 bis zur siebten KBE des Empfängers enthielten. , was darauf hinweist, dass die Zelldichte zu hoch war.Die Paarung von Assays mit 10 KBE des Spenders und 10 bis zum sechsten oder 10. bis zur fünften KBE des Empfängers führte jedoch zu einer verringerten Anzahl transkonjuganter positiver Brunnen. So wurde vorhergesagt, dass 10 bis die fünfte KBE des Empfängers für die Paarung mit einer einzigen Spenderzelle erforderlich sein sollte. Die Paarungs-Assays mit pCAR1:gfp bei unterschiedlichen Dichten von Spender- und Empfängerstämmen zeigten ähnliche Befunde, obwohl die Prozentsätze der transkonjuganten positiven Brunnen insgesamt viel niedriger waren als die von pBP136:gfp.Unter der Annahme, dass spender- und Empfängerzellen sich ähnlich anheften können, war die Wahrscheinlichkeit einer Konjugationsinitiation für den pCAR1-Spender geringer als für den pBP136-Spender. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde geschätzt, dass 10 bis die siebte KBE des Empfängers für eine einzelne Spenderzelle erforderlich war, die nach FACS sortiert wurde. Nach Zählung der Anzahl der transkonjuganten positiven Brunnen wurde der Prozentsatz der transkonjuganten positiven Brunnen für pBP136:gfp als größer als der für pCAR1:gfp bestimmt, was einen mehr als 36-fachen Unterschied in der Wahrscheinlichkeit einer von einem Spender initiierten Konjugation zwischen diesen beiden Plasmiden aufzeigte.Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die bakteriellen Mischungen immer sorgfältig zu verdünnen.

high-resolution-comparison-of-bacterial-conjugation-frequencies

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Eine schnelle und effiziente Methode, um Fremd-DNA von Interesse in vorgefertigte Akzeptor Stämme, sogenannte Landing-Pad-Stämme, die Integration beschrieben wird. Das Verfahren erlaubt eine ortsspezifische Integration eines DNA-Kassette in die gentechnisch Landeplatz Ort einer gegebenen Dehnung, durch Konjugation und Expression des ΦC31 Integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Quelle: Erdogan, F., et al., Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Übertragung eines F-Plasmids von Spender- auf Empfänger-E. coli-Zellen unter Verwendung eines Rettungsplasmids und der Selektion von Transkonjuganten durch duale Antibiotikaresistenz. Der Prozess umfasst das Mischen von Bakterienkulturen, die Inkubation ohne Schütteln, das Unterbrechen von...

F Plasmidtransfer und duale Antibiotikaauswahl in E. coli

Quelle: Chetrit, D., et al. Anwendung von Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronen-Tomographie zur Auflösung raumzeitlicher Merkmale des Sekretionssystems Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert die Herstellung und Bildgebung fluoreszierend markierter pathogener Bakterien. Agarose-Pads werden zunächst vorbereitet und in einem klebrigen Rahmen positioniert. Eine Suspension von genetisch veränderten Bakterien, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren,...

Probenvorbereitung und Bildgebung fluoreszenzmarkierter Bakterien

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein Gen von Interesse auszuschalten, das an der Plasmidkonjugation beteiligt ist, und anschließend die Auswirkungen seiner Abwesenheit mit Hilfe von Paarungsassays zu analysieren. Die Funktion des Gens wird mit Hilfe von Deletions- oder Punktmutationen auf eine bestimmte Region seiner Sequenz weiter untersucht.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

Wir beschreiben hier drei verschiedene Protokolle für die in vitro Untersuchung der Konjugation, Transduktion, Transformation und natürliche in Staphylococcus aureus.

Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Präsentiert hier ist eine einfache Methode zum Erstellen einer High-Density Transposon Einfügung Bibliothek in Escherichia coli oder Shigella Flexneri mit bakteriellen Konjugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Sammlung von Hunderten von Tausenden von einzigartigen Mutanten in Bakterien durch die zufällige genomische Einfügung ein Transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Diese Arbeit stellt eine Mikroskopiemethode vor, die eine Live-Bildgebung einer einzelnen Zelle von Escherichia coli zur Analyse und Quantifizierung des stochastischen Verhaltens synthetischer Genkreise ermöglicht.

Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Verwendung der Einzelzellfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung der bakteriellen Konkurrenz in der Kokultur.

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

Die Konjugation vermittelt den horizontalen Gentransfer, indem sie Plasmid-DNA über zwei verschiedene Zellen mobilisiert und so die Verbreitung nützlicher Gene erleichtert. Diese Arbeit beschreibt eine weit verbreitete Methode zur effizienten Detektion des konjugativen Plasmidtransfers, die auf der Verwendung von Differentialmarkern im konjugativen Plasmid, Spender und Empfänger basiert, um die Transkonjugation zu erkennen.

Nachweis eines horizontalen Gentransfers, der durch natürliche konjugative Plasmide in E. coli vermittelt wird

Erfahren Sie, wie Sie Konjugationsfrequenzen von Bakterien mit hochauflösender Filtermating-Methode vergleichen. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Messungen des Plasmidtransfers zwischen Donor- und Rezipientenstämmen.

Hochauflösende Vergleich der bakteriellen Konjugation Frequenzen

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