Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Hunderte von Genen wurden identifiziert, deren Funktion das Altern eines Organismus beeinflusst. Aber viele ihrer Beziehungen werden nur unzureichend verstanden. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage im Bereich des Alterns zu beantworten.

Nämlich, was sind die genetischen Wechselbeziehungen zwischen gerA-Genen? Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine Erhöhung des Durchsatzes, die Anzahl der genetischen Prädebatten, die gleichzeitig quantitativ gemessen werden können, wird um mindestens eine Größenordnung erhöht. Die mit diesem Verfahren gesammelten Lebensdauerdaten können mit der Software, die wir mit dieser Veröffentlichung zur Verfügung stellen, grafisch dargestellt und analysiert werden.

Diese Methode bietet nicht nur einen Einblick in die Lebenserwartung, sondern kann auch auf andere altersbedingte Phänotypen angewendet werden, wie z. B. Stressresistenz und Veränderungen im Gesundheitsplan. Erstellen Sie für dieses Verfahren einen neuen Stempel der RNAi-Subbibliothek. Zuerst aliquotiert jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 200 Mikrolitern LB mit Ampicillin unter Verwendung einer 12-Kanal-Pipette.

Sterilisieren Sie einen 96-Pin-Plattenreplikator, indem Sie die Pins nacheinander in 50 % Bleiche und anschließend in ultrareines Wasser tauchen. Tauchen Sie dann die Spitzen in Ethanol und flammen Sie die Spitzen vorsichtig ab. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Klebefolienabdeckung einer gefrorenen 96-Well-Glycerin-Platte, und schleifen Sie die Spitzen des sterilisierten Plattenreplikators vorsichtig, aber fest in die Vertiefungen der noch gefrorenen Glycerinbestände.

Beimpfen Sie dann die Kulturen und verschließen Sie die beimpfte Platte mit der durchlässigen Membran. Lassen Sie die Kulturen über Nacht auf der Tischplatte wachsen. Sterilisieren Sie am nächsten Tag den Plattenreplikator, entfernen Sie vorsichtig das Siegel aus der Übernachtkultur und tauchen Sie die Spitzen der Replikatorstifte ein.

Als nächstes inokulieren Sie eine rechteckige LB-Ampicillin- und Tetracyclin-Agarplatte mit den Stiften. Üben Sie gleichmäßigen Druck aus und verwenden Sie eine kleine, kreisende Bewegung, um die Bakterien zu übertragen, ohne dass die Flecken zu eng werden. Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Beladen Sie am nächsten Tag für jeweils 10 benötigte Nachbildungen jede Vertiefung einer tiefgewellten 96-Well-Platte mit 1,5 Millilitern LB mit Ampicillin. Beimpfen Sie anschließend die Vertiefungen mit den kultivierten Bakterien. Versiegeln Sie dann die Platte mit einer atmungsaktiven Membran und kultivieren Sie sie 20 Stunden lang unter Schütteln.

Kontrollvertiefungen sollten über die 96 Vertiefungen verstreut sein, so dass, wenn die 96-Well-Unterbibliotheksplatte in Gruppen von 24 unterteilt wird, jede Abteilung von 24 Vertiefungen eine der Kontrollen aufweist. Am nächsten Tag laden Sie 120 Mikroliter-Aliquots der Kultur mit einer Sechs-Well-Mehrkanalpipette mit einstellbarem Spitzenabstand auf die 24-Well-Platten. Anschließend werden die unbedeckten Platten in einer Laminar-Flow-Haube getrocknet, bis die gesamte Flüssigkeit aufgenommen wurde.

Lassen Sie sie nicht zu lange trocknen. Achten Sie darauf, dass Sie sich bei der Aliquotierung von Flüssigkulturen darauf konzentrieren, sicherzustellen, dass die richtige Bakterienkultur in die richtige Vertiefung in der 24-Well-Platte gegeben wird. Replikations-Set-Experimente beginnen mit dem Satz unabhängiger 24-Well-Replikationsplatten, die jeweils mit denselben Bakterien-RNAi-Klonen besiedelt sind.

Für Experimente zur Lebensdauer werden 15 bis 20 L1-Tiere in jede Plattenvertiefung gegeben und bis zum L4-Stadium heranwachsen gelassen. Bei L4 wird FUdR allen Wells über Replikate hinweg hinzugefügt. Später am selben Tag kann eine Replik-Platte aus dem Set genommen und als erster Zeitpunkt geritzt werden.

Um die Lebensdauer zu verbessern, wird Flüssigkeit in die Vertiefungen der Platte gegeben, um die Bewegung der Tiere zu induzieren. Tiere, die sich nicht zu bewegen beginnen, werden vorsichtig mit einem Wurmpickel angestoßen. Anschließend wird die Gesamtzahl der Tiere und die Anzahl der toten Tiere erfasst.

Die Platte aus der ersten Beobachtung wird dann verworfen. Zum nächsten Beobachtungszeitpunkt wird eine weitere Replikationsplatte aus dem Set entnommen und auf ähnliche Weise bewertet. Dies wird im festgelegten Wertungsintervall wiederholt.

Jedes Mal mit einer neuen Platte aus dem Replik-Set. Fahren Sie mit dem Einritzen eines Satzes Teller fort, bis keine Tiere mehr am Leben sind. Synchronisieren Sie zunächst eine Tierpopulation mit der gleichen bleichmittelbasierten Vorbereitungsmethode, die für den traditionellen Lebensdauer-Assay verwendet wird.

Anschließend säen Sie mit einer Pipette mit einstellbarem Sechs-Well-Abstand und einem Reagenzreservoir 15 bis 20 L1-Tiere in jede Vertiefung der vorbereiteten 24-Well-Platten aus. Mischen Sie während der Aussaat der Platten die L1-Tiere regelmäßig in Lösung, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Lassen Sie nun die Tiere zu L4 entwickeln. Der Zeitpunkt der L4-Entwicklung muss für dieses Protokoll bekannt sein.

Überwachen Sie regelmäßig die Entwicklung der Würmer. Wenn die Tiere L4 erreichen, geben Sie 24 Mikroliter 50x FUdR in jede Vertiefung und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Die Verwendung von L4-Tieren ist von entscheidender Bedeutung.

Wenn Hermaphroditen die Fortpflanzungsreife erreichen, bevor sie FUdR hinzufügen, überleben ihre Nachkommen und fressen die Nahrung. Umgekehrt führt eine zu frühe Zugabe von FUdR zu geplatzten Tieren. Verwenden Sie zu den gewünschten Zeitpunkten eine Replikationsplatte, um die Lebensfähigkeit zu bewerten.

Fluten Sie dazu den Brunnen mit M9-Lösung. Bevor Sie jeden Tag die Lebensfähigkeit bewerten, sollten Sie alle Vertiefungen untersuchen, die kein Futter enthalten, kontaminiert erscheinen oder Tiere mit morphologischen oder Entwicklungsfehlern aufweisen. Notieren Sie für jede Vertiefung die Gesamtzahl der Tiere pro Vertiefung und überprüfen Sie den Status der sich nicht bewegenden Würmer, indem Sie jeden Würmer vorsichtig mit einem Wurmpickel auf den Kopf berühren.

Nachdem du alle sich nicht bewegenden Toten auf einer Platte gezählt hast, wirf die Platte weg. Für dieses Verfahren wachsen transformiert e. Coli über Nacht in LB mit Ampicillin.

Am nächsten Tag konzentrieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 3.000 g für 15 bis 20 Minuten. Resuspendieren Sie die Bakterien in 1/10 des Ausgangsvolumens. Als nächstes aliquotieren Sie 200 Mikroliter der 10x Bakterien auf sechs Zentimeter große Platten.

Bereiten Sie drei oder vier Platten pro Prüfbedingung vor und fügen Sie zwei zusätzliche Platten für den Fall einer Kontamination hinzu. Trocknen Sie die Platten in einer Laminar-Flow-Charge, bis die gesamte Flüssigkeit absorbiert oder verdampft ist. Nach dem Trocknen lagern Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur in einer Plastikbox, um die Produktion doppelsträngiger RNA zu induzieren.

Lagern Sie die Platten dann bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius. Für die Tiere sammeln Sie trächtige, erwachsene Tiere in M9. Waschen Sie sie zweimal mit M9. Wiederholung des Drehs bei der Aspiration. Dann resuspendieren Sie C.elegans in vier Millilitern M9 und fügen Sie zwei Milliliter Hypochloritlösung hinzu.

Wirbeln Sie nun sofort die Würmer drei Minuten lang mit periodischem, kräftigem Schütteln ein. Suchen Sie dann unter einem Präpariermikroskop nach einer Wolke von Eiern. Wenn die Wolke nicht zu sehen ist, wirbeln Sie die Würmer weitere 10 bis 20 Sekunden lang ein.

Als nächstes die Eier wie zuvor zweimal schnell mit M9 waschen. Und die gewaschenen Eier in drei Millilitern M9 resuspendieren. Übertragen Sie dann die Eier in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie es bei 20 Grad Celsius unter sanfter Drehung und lassen Sie die Embryonen über Nacht schlüpfen. Bestimmen Sie am nächsten Tag die Dichte der vorbereiteten L1-Lösung, indem Sie die durchschnittliche Anzahl von L1s pro Mikroliter in drei 10-Mikroliter-Tropfen berechnen.

Beladen Sie die vorbereiteten Bakterien-Saatplatten mit jeweils 50 L1-Tieren. Stellen Sie die Platten in einen 20-Grad-Celsuis-Inkubator, bis sich die Embryonen zum L4-Stadium entwickeln. Die normale Entwicklung von L1 zu L4 dauert etwa 40 Stunden.

Um die Produktion von Nachkommen zu verhindern, fügen Sie dann 160 Mikroliter 50x FUdR zu jeder Platte hinzu. Entfernen Sie dann die Männchen, da die Lebensdauer normalerweise nur bei Hermaphroditen gemessen wird. Wenn Sie fertig sind, packen Sie die Platten wieder in den 20-Grad-Celsuis-Inkubator.

Bis alle Würmer tot sind, bewerten Sie täglich ihre Lebensfähigkeit. Berühren Sie dazu jeden unbeweglichen Nematoden am Kopf vorsichtig mit einem Platindraht oder einer Wimper. Nicht reaktive Tiere sind tot und müssen von der Platte genommen werden.

Achten Sie auf Anomalien während dieser Routine. Repliken und traditionelle Methoden zur Bestimmung der Lebensdauer von C.elegans führen zu ähnlichen Ergebnissen bei N2-Wildtyp-Tieren. Zum Beispiel verkürzte der fütterungsbasierte RNAi-Knockdown von mml-1 oder mxl-2 die normale Lebensdauer signifikant.

Dies wurde sowohl mit einem herkömmlichen Lebensdauer-Assay als auch mit dem Replica-Set-Assay gemessen. Auch eine verlängerte Lebensdauer kann nachgewiesen werden. Hier zu sehen, verlängerte RNAi für mdl-1 oder mxl-1 die Lebensdauer von C.Elegans signifikant, wenn sie mit beiden Methoden gemessen wurde.

Mit der Replikatsatzmethode ist es möglich, gleichzeitig Änderungen der Lebensdauer über mehr als 100 Bedingungen zu quantifizieren, was mit einem traditionelleren Ansatz nicht sinnvoll wäre. Zum Beispiel identifizierte ein genomweites fütterungsbasiertes RNAi-Screening 159 Gene, die für die verlängerte Lebensdauer notwendig sind, die durch die Abnahme der insulinähnlichen Daf-2-Signalübertragung verliehen wird. Die Beziehung zwischen insulinähnlichen Signalen und diesen Genen wurde durch Messung der Gesundheitsspanne der Tiere weiter beschrieben.

Die Gesundheit wurde durch das Schlagen von c. Elegans angezeigt, wenn es in Lösung suspendiert war. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie fütterungsbasierte RNAi zur Messung der Lebensdauer von C.Elegans verwenden können.

RNAi ist jedoch vielseitig und kann für viele verschiedene Phänotypen eingesetzt werden. Einmal gemeistert, ermöglicht die Replica-Set-Methode die Bewertung der Lebensdauer von über 100 RNAi-Klonen pro Tag, wenn sie richtig durchgeführt wird. Frühe und späte Zeitpunkte können schnell erzielt werden.

Alle Tiere in einem Brunnen sind entweder lebendig und bewegen sich oder tot. Die Punktevergabe dauert am längsten, wenn die Tiere zu sterben beginnen. Staffeln Sie die Einrichtung unabhängiger Studien in diesem Sinne.