Name: Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Lernen Sie die Replica-Set-Methode zur Hochdurchsatz-Messung von Lebensdauer und Gesundheitspanne bei Caenorhabditis elegans. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige quantitative Analyse genetischer Einflüsse auf das Altern.

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Die Finanzierung dieser Arbeit beschrieben in diesem Manuskript von zur Verfügung gestellt wurde: die University of Rochester-Büro der Propst und der School of Medicine und Dentistry Dekanat über die Health Sciences Center für Computational Innovation (HSCCI); die Ellison Medical Foundation neue Wissenschaftler in alternden Fellowship (AG-NS-0681-10) hatte die Geldgeber keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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<li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR%2C+base+excision+repair%2C+FOXO%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die traditionelle und Replica setzen-Methoden erfordern die Synchronisation von chronologisch im Alter von Tieren. Wir sind eine Methode, die Tiere mit Hypochlorit Behandlung von trächtigen Erwachsene, wo nur die befruchteten Eier mit der trächtigen Erwachsene Behandlung überleben synchronisiert. Diese Embryonen schlüpfen in flüssige Suspension und Entwicklungsgeschichtlich im ersten Larvenstadium (L1) verhaften. Nach der Aussaat L1 Tiere auf Nahrung (z.B. E. Coli mit dem Ausdruck ihrer DsRNA zu einem g...

Die transformative technologischen Fortschritt in Richtung zum Verständnis der genetischen Grundlagen des Alterns gehörte die Entwicklung der Fütterung-basierte RNAi in C. Elegans1; vor den experimentellen Einsatz von RNAi waren viele Phänotypen des Alterns nicht genetisch steuerbar. Fütterung-basierte RNAi wird erreicht durch die Produktion von DsRNA in E. Coli , das entspricht einer endogenen C. Elegans mRNA: IPTG induziert bidirektionale Übertragung über einen Einsatz entweder C. Elegans cDNA oder eine Portion ein Öffnen Sie Leserahmen in ein Plasmid-2. Bei C. Elegans intakt nach einziehen E. Coli DsRNA produziert durch Bakterien aus dem Lumen in Darmzellen über die SID-2 transmembranen Protein3transportiert und dann durch den Rest des Tieres über SID-14verteilt. In jeder Zelle exogene DsRNA verarbeitet durch komplexe Dicer SiRNA, die interagieren mit einem Reife mRNA über komplementäre Basenpaarung zum Erstellen eines neuen SiRNA-mRNA Duplex. Diese Maisonette ist anerkannt von der RISC-komplex und gespalten, so erniedrigend die endogenen mRNA-5. So ändern Sie lediglich das Plasmid einfügen, kann man die Funktion der fast jedes Gen in das Genom von C. Elegans inaktivieren. Diese Entdeckung führte zu die Kreation von mehreren großen Fütterung-basierte RNAi Bibliotheken-Sammlungen von E. Coli Aktien umgewandelt, die kombiniert werden können, um die Reichweite von ca. 86 % erzielen bekannt C. Elegans Gene6, 7.
Seit der Weiterentwicklung der Fütterung-basierte RNAi führten umfassende Bildschirme in C. Elegans zur Entdeckung von mehr als 900 Gene, die Lebensdauer bei inaktiviert (ausweislich der RNAi-Phänotyp Verbände kuratiert in WormBase), zu ändern, die wir beziehen um als Gerogenes. Eine Rolle für die Mehrheit der Gerogenes Langlebigkeit Kontrolle durch Fütterung-basierte RNAi in wenigen bahnbrechenden Berichten entdeckt wurde (siehe Abbildung 1A und ergänzende Datei 1 für Details). In einigen Fällen wurden diese Gerogenes festgestellt, basierend auf der Messung der Rentabilität auf ein einzelnes oder wenige Zeitpunkte, die nicht quantifizierbaren Maß für die Veränderung der Lebensdauer RNAi-Behandlung zur Verfügung zu stellen. In anderen Fällen wurden diese Gene für Veränderungen der Lebensdauer sowie zusätzliche altersassoziierter Phänotypen quantitativ bewertet. Beispielsweise haben wir bisher 159 Gene, die für normale und erhöhte Lebensdauer von Tieren mit verringerten Insulin/IGF-1 Signalisierung waren notwendig, und Änderungen in Healthspan quantifiziert. Von diesen führen 103 gen inaktivierungen progeric Phänotyp, wie ein oder mehrere Zeichen der vorzeitigen Alterung8Verlust führte.
Während einige Gerogenes mit 100 oder mehr Studien (z. B. Daf-16, Daf-2, Sir-2.1) in Verbindung gebracht haben, haben mehr als 400 Gerogenes höchstens 10 Zitate (Abbildung 1 bund ergänzende Datei 2). So umfassende Fütterung-basierte RNAi-Bildschirme haben entdeckt und kursorisch gekennzeichnet Hunderte von vermeintlichen Gerogenes, bleiben wie diese Gene funktionieren auf Langlebigkeit Kontrolle, und die genetischen Zusammenhänge zwischen diesen Genprodukte schlecht studierte. Volle Längsschnittanalyse für altersassoziierter Phänotypen ist eine Voraussetzung für genetische Interaktionen zwischen Gerogenes (z.B. epistatic Interaktionen, Asynthetic Interaktionen, etc.) zu identifizieren. Tiefer Einblick in die genetischen Zusammenhänge zwischen Gerogenes, erfordert eine Hochdurchsatz-quantitative Methode, die auch die Vorteile der Fütterung-basierte RNAi nutzt.
Die häufigsten Surrogat-Maßnahme des Alterns ist Lebensdauer. Der traditionelle Ansatz zur Messung von C. Elegans Sterblichkeit verfolgt den Tod einzelner Tiere im Laufe der Zeit innerhalb einer kleinen Stichprobe. Eine relativ kleine Anzahl von Tieren werden im Laufe der Zeit verfolgt und in regelmäßigen Abständen sind sanft stieß mit einem Platindraht oder Wimpern mit Bewegung als Indikator der Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Diese Methode ist weit verbreitet, da es einfache, direkte Messungen die durchschnittliche und die maximale Lebensdauer bietet. Diese traditionelle Methode ist jedoch zeitaufwendig und relativ niedrigen Durchsatz, die begrenzt die Anzahl der Tiere und Bedingungen, die gleichzeitig in einer kontrollierten Weise gemessen werden können. Eine kürzlich durchgeführte Simulationsstudie festgestellt, dass viele C. Elegans Lebensdauer Studien keine genügend große Zahl von Tieren Assay, kleine Änderungen zwischen Bedingungen9zuverlässig erkennen zu können. Darüber hinaus beinhaltet diese traditionelle Methode Umgang mit immer wieder die gleichen Kohorte von Tieren im Laufe der Zeit, die wiederum kann einzuführen, Kontamination, und kann beschädigen oder zunehmend gefährdet, im Alter von Tieren zu töten.
Wir haben eine alternative "Replica Set" Methode zur Messung von C. Elegans Lebensdauer entwickelt. Zu diesem Zweck eine große Population von Alter synchronisiert, isogenen Tiere gliedern sich in eine Reihe von kleinen Populationen (oder Nachbauten). Genügend Replik Proben werden generiert, um jeden Zeitpunkt in das geplante Experiment zu decken. Jedem Zeitpunkt Beobachtung eines der Replikate ist für die Anzahl der lebenden Toten erzielte und zensierte Tiere, dann Tiere innerhalb dieser replizieren werden verworfen. So über die erwartete Lebensdauer der Bevölkerung als Ganzes, eine Reihe von unabhängigen Subpopulationen sind in regelmäßigen Abständen abgetastet (Abb. 2 b). Bei der Verwendung von Replikatsätzen gibt es kein wiederholtes drängen von Tieren und keine wiederholte Exposition gegenüber potentiellen Kontamination der Umwelt. Die Lebensfähigkeit beobachtet an der einmaligen Stelle ist völlig unabhängig von jeder anderen Beobachtung, das minimiert die Handhabung und erhöht den Durchsatz von mindestens eine Größenordnung. Dies hat uns erlaubt, Änderungen in Lebensdauer quantitate für Hunderte von RNAi gleichzeitig8,10 Klone.
Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Durchführung von C. Elegans Lebensdauer über die Replikatgruppe und traditionelle Methoden zur Bewertung von C. Elegans Langlebigkeit. Wir zeigen, dass ähnliche Ergebnisse, zwischen den Methoden erzielt werden. Wir haben entwickelten Software, bei der die grafische Auswertung der Daten, Lebensdauer durch beide Ansätze, die wir frei unter einer GPL V3 Lizenz (siehe Tabelle der Materialien) zur Verfügung. "WormLife" ist in R11geschrieben und enthält eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) für das Plotten von Daten, die in Mac OS und Linux getestet wurde. Zu guter Letzt wir vergleichen und kontrastieren die Grenzen der einzelnen Methoden und andere Überlegungen bei der Wahl zwischen Ansätze zur Messung der quantitativen Veränderungen in C. Elegans Lebensdauer zu markieren.

<table><tbody><tr><td>IPTG (Isopropyl beta-D-1-thigalactopyranosid)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>FuDR (5-Fluor-2'-desoxyuridin)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Kulturplatten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckige unbehandelte Single-Well-Platte, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L 96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>2mL 96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>Luftdurchlässige Plattendichtung</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>96-poliger Plattenreplikator</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>bakteriologischer Agar</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien - Ahringer</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>Siehe auch Kamath et. al., Nature 2003.</td></tr><tr><td>C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien- Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>Siehe auch Rual et. al., Genome Research 2004. Diese Bibliothek ist auch bei Dharmacon erhältlich.</td></tr><tr><td>WormLife - Software für die Überlebensanalyse von Replikaten</td><td>Samuelson Lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife L4440 Empty Vector Plasmid</td><td>Addgene</td><td>1654</td><td>https://www.addgene.org/1654/</td></tr> <tr><td>Wormbase</td><td></td><td></td><td>http://www.wormbase.org/&nbsp;</td></tr><tr><td>OASE</td><td></td><td></td><td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&nbsp;</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&nbsp;</td></tr></tbody></table>

die replica-set-methode: eine hochdurchsatz-ansatz zu quantitativ messen caenorhabditis elegans lebensdauer

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Die Replikatgruppe Methode ist ein Ansatz zur Messung quantitativ Lebensdauer oder das Überleben von Nematoden Caenorhabditis Elegans in einer Hochdurchsatz-Weise, so dass eine einzelne Forscher mehr Behandlungen oder Bedingungen über die gleiche Menge an den Bildschirm jederzeit ohne Verlust der Qualität der Daten. Die Methode erfordert eine gemeinsame Ausstattung in den meisten Labors arbeiten mit C. Elegans gefunden und ist somit einfach zu verabschieden. Der Ansatz konzentriert sich auf unabhängige Stichproben einer Grundgesamtheit an jedem Aussichtspunkt, anstatt eine einzelne Probe im Laufe der Zeit als mit herkömmlichen longitudinalen Methoden prüfen. Ritzen mit sich bringt, die Zugabe von Flüssigkeit in die Vertiefungen von Multi-well-Platte, die stimuliert C. Elegans zu bewegen und Quantifizierung Änderungen in Healthspan erleichtert. Andere wichtige Vorteile der Replica Set-Methode enthalten reduzierte Exposition von agarflächen in der Luft Schadstoffe (z.B. Schimmel oder Pilz), minimale Umgang mit Tieren und Robustheit auf sporadische MIS scoring (z. B. ein Tier als Tote gefordert, wenn es noch (lebendig). Um angemessen analysieren und Visualisieren von Daten aus einer Replikatgruppe Stil-Experiment, wurde auch eine benutzerdefinierte Software-Tool entwickelt. Aktuelle Funktionen der Software gehören Plotten von Survival-Kurven für sowohl Replikatsatz und traditionellen (Kaplan-Meier) Experimente, sowie statistische Analysen für Replikatsatz. Die Protokolle, die hier zur Verfügung gestellten beschreiben die traditionelle experimentellen Ansatz und Replica Set-Methode sowie einen Überblick über die entsprechenden Daten-Analyse.

Bei der Entwicklung einer neuen Methodik ist es unerlässlich, dass die neue Methode akzeptierte Ergebnisse von früheren Ansätzen rekapituliert und dem Standard innerhalb eines Feldes entspricht. Wir haben bisher empirisch gezeigt, dass die Replikatgruppe und traditionelle Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Lebensdauer ähnliche Ergebnisse20 produzieren. Wildtyp C. Elegans (N2) in der Regel bei 20 ° C gepflegt Leben zwischen 20 und 25 Tage, di...

Hier beschreiben wir die Replikatgruppe Methode, Vorgehensweise quantitativ Messen C. Elegans Lebensdauer/überleben und Healthspan in hohem Durchsatz und robuste Art und Weise, so dass Screening von vielen Bedingungen ohne Einbußen bei der Qualität der Daten. Dieses Protokoll beschreibt die Strategie und bietet ein Software-Tool für die Analyse der Replikatgruppe Daten.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Hunderte von Genen wurden identifiziert, deren Funktion das Altern eines Organismus beeinflusst. Aber viele ihrer Beziehungen werden nur unzureichend verstanden. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage im Bereich des Alterns zu beantworten.Nämlich, was sind die genetischen Wechselbeziehungen zwischen gerA-Genen? Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine Erhöhung des Durchsatzes, die Anzahl der genetischen Prädebatten, die gleichzeitig quantitativ gemessen werden können, wird um mindestens eine Größenordnung erhöht. Die mit diesem Verfahren gesammelten Lebensdauerdaten können mit der Software, die wir mit dieser Veröffentlichung zur Verfügung stellen, grafisch dargestellt und analysiert werden.Diese Methode bietet nicht nur einen Einblick in die Lebenserwartung, sondern kann auch auf andere altersbedingte Phänotypen angewendet werden, wie z. B. Stressresistenz und Veränderungen im Gesundheitsplan. Erstellen Sie für dieses Verfahren einen neuen Stempel der RNAi-Subbibliothek. Zuerst aliquotiert jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 200 Mikrolitern LB mit Ampicillin unter Verwendung einer 12-Kanal-Pipette.Sterilisieren Sie einen 96-Pin-Plattenreplikator, indem Sie die Pins na

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Forschung

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Genetik

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der Lebensdauer von Nematoden auf festen Medien mit UV-getötet bakterielle Lebensmittel erhalten.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

In diesem Protokoll wird eine Methode zur...

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Dieses Video beschreibt eine traditionelle, plattenbasierte Methode zur Messung der Lebensdauer von C. elegans. Das Beispielprotokoll misst die Lebensdauer von Würmern, die mit RNAi behandelt wurden.

Lebensdaueranalyse: Messung der Langlebigkeit von C. elegans

Hier präsentieren wir Ihnen einen Rahmen für die breite Palette diätetische Einschränkung auf Genexpression und Lebensdauer zu beziehen. Wir beschreiben Protokolle für die breite Palette diätetische Einschränkung und quantitative Bildgebung der Genexpression unter diesem Paradigma. Wir skizzieren weitere numerische Analysen zu offenbaren zugrunde liegenden Informationen Bearbeitungsfunktionen der genetischen Schaltungen in Essen-sensing beteiligt.

Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans dienen als hervorragendes Modellsystem mit robusten und kostengünstigen Methoden zur Untersuchung von Gesundheit, Lebensdauer und Stressresistenz.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

Die Bildgebungsplattform "The Lifespan Machine" automatisiert die lebenslange Beobachtung großer Populationen. Wir zeigen die Schritte, die erforderlich sind, um Lebensdauer-, Stressresistenz-, Pathogenese- und Verhaltensalterungstests durchzuführen. Die Qualität und der Umfang der Daten ermöglichen es den Forschern, Interventionen beim Altern trotz des Vorhandenseins biologischer und umweltbedingter Variationen zu untersuchen.

Hochdurchsatz-Behavioralitäts- und Lifespan-Assays mit der Lifespan Machine

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Quantifizierung der Fütterungsrate von Caenorhabditis elegans , der auf der Messung der Clearance von Bakterien in Flüssigkulturen basiert.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Dieses Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges Verfahren zur Quantifizierung der embryonalen Lethalität bei Caenorhabditis elegans. Es ermöglicht eine einfache Erkennung embryonaler Anomalien in verschiedenen Populationen ohne spezielle Geräte oder Wurmpflücken-Expertise. Das Protokoll kann verwendet werden, um die Auswirkungen genetischer Mutationen, RNA-Interferenz-vermittelter Gen-Knockdowns und der Ernährung zu quantifizieren.

Quantifizierung der embryonalen Letalitätsrate bei Caenorhabditis elegans

Lernen Sie die Replica-Set-Methode zur Hochdurchsatz-Messung von Lebensdauer und Gesundheitspanne bei Caenorhabditis elegans. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige quantitative Analyse genetischer Einflüsse auf das Altern.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

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