Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

Die Kulturanlage kann dazu beitragen, Schlüsselfragen der Larvenökologie, des Biofoulings und der Evolutionsbiologie zu beantworten. Genauer gesagt kann es in Studien über Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen während der Larvenansiedlung, die Entwicklung neuer Antifouling-Technologien sowie die Evolution und Funktion von Genen, die an der Osmoregulation beteiligt sind, eingesetzt werden. Der Hauptvorteil dieses Modellorganismus besteht darin, dass die Seepocke Balanus improvisus robust ist, sich das ganze Jahr über fortpflanzt und eine relativ kurze Generationszeit hat.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Kultivierung von Seepocken geben kann, kann sie auch auf die Kultivierung anderer Meeresorganismen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es eine große Anzahl von Details gibt, die für den Erfolg wichtig sind, wie z. B. die Versorgung mit gutem Meerwasser, eine robuste Produktion von hochwertigem Futter und eine ständige Betreuung der Reinigung und Fütterung der Kulturen. Martin Ogemark und Anna-Lisa Wrange, Techniker und Forscher, die mit Seepocken arbeiten, werden das Verfahren vorführen.

Richten Sie zunächst Rahmen ein, die mehrere transparente thermoplastische Platten aufnehmen können. Bohren Sie zwei Löcher in die oberen Ecken jeder Platte und befestigen Sie die Paneele mit Kabelbindern an den Rahmen. Um ausgewachsene Seepocken zu sammeln, setzen Sie die Paneele vertikal in einer Tiefe von ein bis drei Metern in ruhigen Gewässern aus.

Seepocken abgesetzt und auf einen Durchmesser von fünf Millimetern herangewachsen sind, bringen Sie die Platten ins Labor. Legen Sie dann die Platten senkrecht auf einen Ständer mit gefrästen Rillen in einer Polyethylen-Schale. Kleben Sie zunächst mit ungiftigem, wasserfestem Klebeband fünf Paneele zusammen, um einen Würfel zu erhalten, der oben offen ist.

Lege den Würfel in eine kleine Schale und fülle sie mit Meerwasser. Als nächstes fügst du etwa 200 Cypriden oben auf den Würfel hinzu. Füttern Sie die juvenilen Seepocken jeden zweiten Tag mit 100 Millilitern Skeletonema marinoi.

Nach zwei bis drei Wochen sollten die Paneele des Würfels etablierte Jungtiere enthalten, die einen Durchmesser von mindestens fünf Millimetern haben. Nehmen Sie den Würfel auseinander und schieben Sie die Paneele in Tabletts mit durchströmtem Meerwasser. Um Artemia-Nauplien zu ernten, schalten Sie zuerst die Belüftungspumpe aus und dunkeln Sie die Flasche ab, dann beleuchten Sie den unteren Teil der Flasche für 10 Minuten.

Die geschlüpften Artemia-Nauplien schwimmen dem Licht entgegen. Die nicht geschlüpften Zysten sinken nach unten, während die Zystenschalen nach oben schwimmen. Öffnen Sie die Klemme an der Unterseite und sammeln Sie die Zwischenfraktion als dichte Population der schwimmenden Artemia-Nauplien.

Um die Paneele mit ausgewachsenen Seepocken zu reinigen, besprühen Sie sie vorsichtig mit Süßwasser und entfernen Sie Verschmutzungen mit einer weichen Zahnbürste. Reinigen Sie die Schalen ohne Seepocken und die Röhren mit heißem Süßwasser. Legen Sie anschließend ein Sieb in die Polyethylenschale mit einer Überlauföffnung.

Sammeln Sie die Seepockenlarven, die sich über Nacht im Sieb ansiedeln. Füllen Sie dann einen Eimer mit 20 Litern gefiltertem Meerwasser und einem Liter einer Kieselalgen-Mikroalgenmischung, um eine Dichte von 50.000 Kieselalgen pro Milliliter zu erreichen. Übertragen Sie die zuvor gesammelten Seepocken-Nauplien in eine Kristallisationsschale und beleuchten Sie die Form von der Seite.

Sammeln Sie dann mit einer Pipette die Nauplien, die dem Licht entgegenschwimmen, und geben Sie sie in eine andere Schale. Gib die Nauplien zum Zählen in ein Becherglas mit einem Liter gefiltertem Meerwasser. Geben Sie als Nächstes einen Liter Nauplien in den zuvor vorbereiteten Eimer.

Nach drei Tagen verwenden Sie ein 90-Mikrometer-Sieb, um die Seepocken-Nauplien zu sammeln, reinigen Sie dann den Eimer, füllen Sie ihn mit gefiltertem Meerwasser und fügen Sie neues Kieselalgenfutter und die Seepocken-Nauplien hinzu. Nach zwei bis drei weiteren Tagen der Inkubation verwenden Sie ein 320-Mikrometer-Sieb auf einem 160-Mikrometer-Sieb, um die nicht geschmolzenen Seepocken-Nauplien von den Cypriden zu trennen. Nachdem Sie vier Vier-Liter-Flaschen für die Mikroalgenkultur aufgestellt haben, stellen Sie die Flaschen in Licht mit einer Intensität von 50 bis 100 Mikromol pro Quadratmeter.

Ernten Sie die Kulturen, wenn sie dicht genug sind, um zur Fütterung verwendet zu werden. Wählen Sie zunächst große Individuen aus und halten Sie die Nahrung zwei Tage lang zurück, bevor Sie sie sezieren. Reinigen Sie dann die Seepockenschale mit einer Zahnbürste und spülen Sie sie mit Wasser ab, um die Kontamination durch andere in der Umwelt vorhandene Arten zu minimieren.

Legen Sie eine einzelne Seepocke zum Sezieren auf eine ebene Fläche und führen Sie dann die Spitze einer Pinzette zwischen die Tergal- und Scutalplatte ein. Fassen Sie eine Platte und ziehen Sie vorsichtig daran, um sie zu entfernen. Fassen Sie dann mit einer Pinzette die Zirren und ziehen Sie die Seepocke gerade heraus.

Zum Schluss legen Sie die präparierten Seepocken zur Fixierung direkt in 96%iges Ethanol oder RNA-stabilisierende Lösung. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können in einer Woche bis zu vier Chargen von Seepocken-Nauplius-Larven hergestellt werden. Maximal besteht jede Charge aus dem Kultivierungssystem aus ca. 12.000 Nauplien, was bedeutet, dass bis zu 50.000 Nauplien pro Woche kultiviert werden können.

Innerhalb einer Woche entwickeln sich 70 bis 90 % der gesammelten Nauplien zu Cypriden, was etwa 30.000 Cypriden pro Woche ergibt. Durchschnittlich wurden 500 Nanogramm hochwertiger RNA aus nur 20 einzelnen Cypriden gewonnen, unabhängig vom Siedlungsstadium. In Seepocken zerfällt 28S rRNA beim Erhitzen.

Die Homogenisierung durch keramische Kügelchen verleiht der RNA höchste Integrität und ist damit die bevorzugte Methode für den Umgang mit Seepocken- und Arthropodengewebe. Mittels qPCR-Analyse wurde ein zweifacher Anstieg für die langen Varianten der NAK1-mRNA und einen niedrigen Salzgehalt im Vergleich zur kurzen NAK beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Langform unter Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt vorherrscht.

Eine mehrwöchige Schulung ist erforderlich, um die verschiedenen Schritte der Seepockenkultur zu beherrschen. Bei diesem Verfahren ist es besonders wichtig, die Kontamination in allen Schritten des Kultivierungsablaufs zu minimieren. Nach ihrer Entwicklung hat diese Kultivierungstechnik maßgeblich dazu beigetragen, die Ökologie, Physiologie und Molekularbiologie der Seepocken besser zu verstehen.

Es ist auch ein wichtiger Eckpfeiler, um die Seepocke Balanus improvisus zu einem potenten marinen Modellsystem zu machen.