Name: Co-Immunopräzipitation Assay mit endogenen nuklearen Proteinen aus Zellen kultiviert unter hypoxischen Bedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Co-Immunopräzipitation endogener nuklearer Proteine aus HEK293A-Zellen unter hypoxischen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nativer Protein-Protein-Interaktionen.

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Wir danken Prof. Assoc. Sin Tiong Ong für die Nutzung der Hypoxie-Workstation. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die folgenden: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 und MOE2015-T2-2-087 (, Y.A), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Gründungshilfe M4230003 (um Sokolov), der schwedischen Forschungsrat der Erling Persson Familienstiftung, die Novo Nordisk Stiftung, die Stichting af Jochnick Foundation, die schwedische Diabetes Association, Scandia-Versicherungs-Gesellschaft, der Diabetes-Forschung und Wellness, Liegeplatz von Kantzow Stiftung, die Strategische Forschungsprogramm bei Diabetes am Karolinska Institutet, der ERC ERC-2013-AdG-338936-Betalmage, und Knut und Alice Wallenberg Foundation.

In diesem Protokoll Abschnitt, die menschliche embryonale Nieren 293A verwendet (HEK293A) Zelle s erfolgt nach den Richtlinien der Humanforschung Ethikkommission in Nanyang Technological University, Singapore.
1. Induktion von Hypoxie in HEK293A Zellen
<ol><li>Bereiten Sie vier 10 cm Gerichte und Samen 3 – 5 x 106 HEK293A Zellen pro Schale in 10 mL Dulbeccos geändert Adlers Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, 100 U/mL Penicillin und 100 mg / mL Streptomycin. Kultur der Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator. Hinweis: Zelle Aussaat sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) durchgeführt werden. Die Oberflächen aller Materialien in der BSC platziert werden sollte mit 70 % Ethanol abgerieben werden.</li>
	<li>24 h nach der Aussaat, wenn die Zellen 80 – 90 % Konfluenz erreicht haben setzen zwei Gerichte in der Hypoxie-Subchamber in den Inkubator Glovebox (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 % O2 und 5 % CO2 bei 37 ° C und halten Sie die anderen beiden Gerichte auf normoxiezustand (21 % O 2, 5 % CO2 bei 37 ° C) für 4 Std. verwenden Sie eine Reihe von Inklusieve und hypoxische Zellen zu bewerten die Hypoxie-Behandlung von western-Blot und die andere Gruppe von Zellen für die co-Immunopräzipitation Experimente zu nutzen. Hinweis: Der Sauerstoffgehalt ist einstellbar auf 0 – 5 % und die Dauer der Behandlung Hypoxie kann variiert werden, je nach Zelltyp und Ziel zu studieren.</li>
</ol>(2) die ganze Zelle und nukleare Extraktion
Hinweis: Informationen finden Sie unter Tabelle 1 auf Puffer, die in diesem Protokoll verwendeten.
<ol><li>
Die normoxiezustand Kontrollzellen zu ernten.
	<ol>
<li>Entfernen Sie die Kultur-Medien durch Absaugen und spülen Sie die Zellen mit 10 mL DPBS (PH 7,0 – 7,2) mit einer 10 mL-Pipette. Hinweis: Berühren Sie nicht die Zelle monomolekularen Film mit der Pipette. Während des Waschens pipette vorsichtig die DPBS die Mauer der Zellplatte Kultur um Zellverlust zu vermeiden.</li>
		<li>5 mL Pipette eiskalte DPBS in die Platte und die Zellen von der Oberfläche der Platte in eiskaltem PBS mit einer Zelle Spachtel zu kratzen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in 15 mL konische Röhrchen und halten Sie auf dem Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ernten Sie die Zellen unter hypoxischen Bedingungen kultiviert.
	<ol>
<li>Pre-equilibrate des DPBS hypoxischen Bedingungen durch die Platzierung eines ungedeckten 100 mL Experiment Reagenz Glasflasche gefüllt mit DPBS in der Hypoxie-Subchamber (1 % O2 und 5 % CO2 bei 37 ° C) für 24 h im voraus.</li>
		<li>Ca. 1 h vor der Ernte der Zellen Hypoxie behandelt, legen Sie eine Eisbox mit Eis in der Prozesskammer das Handschuhfach, die 1 % O2 und 5 % CO2equilibriert worden. Übertragen Sie die Flasche mit Pre äquilibriert hypoxischen DPBS aus der Hypoxie-Subchamber in der Prozesskammer und auf Eis legen.</li>
		<li>4 h nach der Behandlung der Hypoxie, übertragen die Zellen von Hypoxie-Subchamber auf die Prozesskammer, die vorab äquilibriert, 1 % O2 und 5 % CO2wurde.</li>
		<li>Entfernen Sie die Nährmedien durch Absaugen und spülen Sie die Zellen, einmal mit 10 mL eiskaltes Pre äquilibriert hypoxischen DPBS mit 10 mL pipette.</li>
		<li>Fügen Sie 5 mL eiskaltes Pre äquilibriert DPBS mit 5 mL pipette und verdrängen die Zellen durch kratzen mit einem Schaber Zelle hinzu.</li>
		<li>Kippen Sie der Zellplatte Kultur und sammeln Sie die freistehenden Zellen mit einer 10 mL-Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in DPBS in 15 mL konische Röhrchen und halten Sie auf dem Eis.</li>
		<li>Öffnen Sie die Tür zwischen den Verarbeitungs- und Puffer Kammern der Glovebox, die beide Pre äquilibriert, 1 % O2 und 5 % CO2gewesen sein. Übertragen Sie die 15 mL konische Röhrchen auf Eis mit Hypoxie behandelt Zellen aus der Verarbeitung-Kammer, die Sperrkammer. Öffnen Sie die Tür der Pufferkammer und entfernen Sie die Zellen vollständig aus dem Handschuhfach.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet-sowohl die Inklusieve Zellen von 2.1 und die hypoxischen Zellen von 2.2 durch Zentrifugation bei 1.000 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>
Bereiten Sie die ganze Zelle Extrakten.
	<ol>
<li>Die Zelle Pellets in 500 µL eiskalte Radio Immunopräzipitation (RIPA) Lyse testpuffer mit 50 mM Trisaminomethane-Hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM Natriumchlorid (NaCl), 1 % Tergitol-Typ NP-40 (NP-40), 0,5 % Natrium Deoxycholate, aufschwemmen und 0,1 % Natrium Dodecyl Sulfat (SDS), ergänzt mit 1 x cocktail Protease-Hemmer (siehe Tabelle der Materialien) durch die Zelle Pellets nach oben und unten mehrmals pipettieren.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zelle Lysates in neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie für 30 min mit gelegentlichen Vortexen auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zelle Lysates 13.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Der Überstand, aliquoten 50 µL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und speichern bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die nukleare Extrakte mit einer nuklearen Extraktion kit (siehe Tabelle der Materialien).
	<ol>
<li>Sanft Aufschwemmen der Zelle Pellets in 500 µL Lyse Puffer NL mit 1 x cocktail-Proteasehemmer und 0,1 M Dithiothreitol (DTT) ergänzt durch die Zelle Pellets nach oben und unten mehrmals pipettieren.</li>
		<li>25 µL der Reinigungslösung NP hinzu kommen die Zellsuspension und Wirbel für 10 s mit maximaler Geschwindigkeit.</li>
		<li>Zentrifuge bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Den überstand (zytoplasmatischen Auszüge), aliquoten 50 µL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, erheben und speichern bei-80 ° C.</li>
		<li>Aufschwemmen der Pellet mit Zellkerne in 500 µL Lyse Puffer NL ergänzt mit 1 x cocktail-Proteasehemmer und 0,1 M DTT durch Vortexen für 5 s mit maximaler Geschwindigkeit.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C, und speichern Sie die nukleare Pellet.</li>
		<li>Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 50 µL Extraktion Puffer NX1 mit 1 x Proteaseinhibitor cocktail durch pipettieren die Kugel nach oben und unten mehrmals ergänzt.</li>
		<li>Inkubation für 30 min auf Eis, Vortexen für 10 s alle 5 min. bei maximaler Geschwindigkeit.</li>
		<li>Zentrifuge bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entsalzen Sie die nukleare Extrakte.
	<ol>
<li>Sammeln des Überstands Schritt 2.5.9 und Transfer in die Mini-Dialyse-Geräte mit einem maximalen Volumen von 100 µL pro Einheit.</li>
		<li>Verschließe die Mini Dialysegeräten und legen Sie sie in eine Schwimmhilfe.</li>
		<li>Legen Sie die Schwimmhilfe in einen Becher mit 500 mL vorgekühlt Dialyse-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 % Glycerin, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 0,2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 0,2 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mM DVB-t) und 30 min bei 4 ° C unter schonenden rühren inkubieren. Achtung: PMSF ist gefährlich. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit Haut oder Inhalation.</li>
		<li>Die Proben aus der Ecke von der Mini-Dialysegeräten zu sammeln und übertragen in neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C, aliquoten 25 µL jeder überstand zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und bei-80 ° c Lagern</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bewertung der Hypoxie Behandlung durch Erkennung der Proteinexpression und subzelluläre Lokalisation der HIF-1α
<ol><li>Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins die ganze Zelle oder eines nuklearen/zytoplasmatischen Extrakte mit Mikrotestplatte Assay eine Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay Kit nach Herstellerangaben Anweisungen18.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zelle Lysates in 1 X Laemmli Probenpuffer mit 5 % 2-Mercaptoethanol und bei 95 ° C für 5 min kochen. Achtung: Berühren Sie nicht die Oberfläche der Heizblock, da dies zu Verbrennungen führen kann.</li>
	<li>
Trennen Sie die Proteine durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE).
	<ol>
<li>Laden Sie gleiche Mengen von Protein (25 µg) in jede Vertiefung eine SDS-PAGE Fertigteile gradient Gele (4 – 20 %), zusammen mit 3 µL des Markers Molekulargewicht.</li>
		<li>Führen Sie das Gel im laufenden Puffer mit 2,5 mM Tris, 19,2 mM Glycin, 0,01 % SDS, PH8.3 für 30 min bei 200 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf die Nitrozellulose-Membran.
	<ol>
<li>Montieren Sie das Transfer-Sandwich (Filterpapier-Gel-Membran-Filterpapier) mit dem Gel auf der Anodenseite und die Membran an der Kathodenseite der Kassette.</li>
		<li>Legen Sie die Kassette in den Transfer-Tank mit Transfer-Puffer mit 2,5 mM Trisaminomethane (Tris), 19,2 mM Glycin und 20 % Methanol gefüllt. Achtung: Methanol ist brennbar und sollte innerhalb der brennbaren Flüssigkeit Schrank gelagert werden.</li>
		<li>Führen Sie den Transfer für 1 h bei 100 V in den kalten Raum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blockieren Sie den Blot in 10 mL blockierende Puffer mit 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1 Tween 20 und 5 % fettfreie Milch für 1 h bei Raumtemperatur in einen Shaker geben.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Fleck mit Anti-HIF-1α Antikörper (Verdünnung 1: 500) in den gleichen blockierenden Puffer über Nacht bei 4 ° c</li>
	<li>Waschen Sie den Fleck 3 Mal für 5 min jeweils mit 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Fleck mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper (1/1.000 Verdünnung) in 10 mL TBS-T mit 5 % fettfreie Trockenmilch für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie den Fleck 3 Mal für 5 min jeweils mit 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Mix 500 µL jeder verbesserte Chemilumescent (ECL) Reagenz A und B in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Wirbel kurz.</li>
	<li>ECL-Substrat auf den Fleck auftragen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>
Die Chemolumineszenz Signale mit einem kostenlos – Coupled Gerät (CCD) Kamera-basierten imaging-System zu erfassen.
	<ol>
<li>Abtropfen lassen Sie überschüssige ECL Substrat durch berühren den Rand der Membran mit einem Papiertuch und die Membran in ein Blatt Beschützer.</li>
		<li>Legen Sie die Membran auf Probenteller des CCD Kamerabasierte imaging-System.</li>
		<li>Bildverarbeitungs-Software zu starten (siehe Tabelle der Materialien) und die Aufnahmen mit den folgenden Einstellungen: Datei → neue Protokoll → Einkanal → Protokolleinstellungen → Gel Imaging (Anwendung: Chemi; Imaging-Bereich: Bio-Rad bereit Gel; Imaging Belichtung: Die Software wird automatisch optimieren die Belichtungszeit für intensive Bands) → Run Protokoll Hinweis: Die Belichtungszeit kann manuell eingestellt werden, um die optimale Bilder zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunopräzipitation und Erkennung der Immunoprecipitated Proteine
<ol><li>Waschen 50 µL Protein A/G-Sepharose-Kügelchen in 500 µL des TBS-Puffers in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Perlen in 100 µL der TBS-Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL der Maus monoklonalen Anti-ARNT Antikörper (1,4 mg/mL) oder Maus-Immunglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL), die durch Neuaufbau 0,7 mg Maus IgG in 500 µL TBS Puffer vorbereitet wurde.</li>
	<li>Legen Sie die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, enthält die Perlen in ein Rohr-Rotator und inkubieren Sie für 2 h bei 10 u/min in den kalten Raum. Hinweis: Behandeln Sie die Rohre vorsichtig zu und halten Sie die Suspension mit den Perlen an der Unterseite des Rohres.</li>
	<li>Pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C und die Überstände zu verwerfen.</li>
	<li>Verdünnen Sie 200 µg des nuklearen Proteins lysate erwarb Schritt 2.6.5 in 800 µL des Puffers IP-bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,2 % NP-40 und 1 X Proteaseinhibitor cocktail. Inkubieren Sie mit dem Antikörper gekoppelt Perlen im Schritt 4.5 über Nacht bei 4 ° c erreicht die lysate</li>
	<li>Pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C, verwerfen die Überstände und waschen Sie die Perlen 3 Mal mit 1 mL eiskaltes TBS mit 0,2 % NP-40.</li>
	<li>Kochen Sie die Perlen in 50 µL Laemmli Probenpuffer bei 95 ° C für 5 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C, sammeln Sie den überstand zu und entsorgen Sie die Perlen. Hinweis: Der Überstand kann bei 4 ° C für den kurzfristigen oder-20 ° C dauerhaft gespeichert werden.</li>
	<li>Ermitteln Sie das Vorhandensein von HIF-1α aus der Immunoprecipitated-Protein-komplexe durch western-Blot wie oben beschrieben im Schritt 3.3 ab. Hinweis: Protein Quantifizierung ist nicht erforderlich für diesen Schritt. Laden Sie vollen Lautstärke (50 µL) des Überstands jeder Probe in jede Vertiefung eine SDS-PAGE Fertigteile gradient Gele (4 – 20 %)</li>
</ol>

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<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Der HIF-1-Komplex ist ein master Regulator der zellulären Sauerstoff Homöostase und regelt eine Vielzahl von Genen, die in verschiedenen zellulären adaptive Reaktionen auf Hypoxie. Identifizierung von neuen HIF-1 interagierenden Proteine ist wichtig für das Verständnis der hypoxischen Signaltransduktion. Co-Immunopräzipitation Experimente werden häufig für ppi Studien verwendet, um zelluläre Signalwege Transduktion zu umreißen. Allerdings Protein Überexpression ist immer noch weit verbreitet und dies kann zu experimentel...

Hypoxie tritt auf, wenn die Zellen und Geweben des Körpers nicht ausreichend Sauerstoff zugeführt wird. Es spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen wie stammzelldifferenzierung, Entzündungen und Krebs1,2. Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) fungieren als Heterodimere bestehend aus einem Sauerstoff-regulierten α-Untereinheit und einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit auch bekannt als ARNT3. Bis heute wurden drei Isoformen von HIF-α-Untereinheiten (HIF-1α, HIF-2α und HIF-3α) und drei HIF-β-Untereinheiten (ARNT/HIF-1β, ARNT2 und ARNT3) identifiziert. HIF-1α und ARNT sind ubiquitär ausgedrückt, während HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 und ARNT3 mehr Ausdruck Muster4eingeschränkt haben. Die HIF-1-Protein-Komplex ist der zentrale Regler der Hypoxie Antwort. Unter hypoxischen Bedingungen HIF-1α stabilisiert wird, dann translocates in den Zellkern und dimerizes mit ARNT5. Anschließend dieser Komplex bindet an spezifische Nukleotide bekannt als Hypoxie reagiert Elemente (HREs) und den Ausdruck der Zielgene in vielfältigen Prozesse einschließlich der Angiogenese, Erythropoese und Glykolyse6regelt. Neben dieser "kanonisch" Reaktion, die Hypoxie-Signalweg ist auch bekannt, Übersprechen mit mehreren zelluläre Reaktion Signalwege wie Notch und Nuclear Factor-Kappa B (NF-κB)7,8,9.
Die Identifizierung von interagierenden Proteine Roman HIF-1 ist wichtig für ein besseres Verständnis für die Hypoxie Signalweg. Im Gegensatz zu ARNT, ist unempfindlich gegenüber Sauerstoff-Niveaus und konstitutiv exprimierten sind HIF-1α proteingehalte zellulären Sauerstoff-Niveaus fest geregelt. Bei normoxiezustand (21 % Sauerstoff) sind Proteine, HIF-1α stark degradierten10,11. Die kurze Halbwertszeit von HIF-1α am normoxiezustand präsentiert spezielle technische Herausforderungen für die Erkennung des Proteins aus Zelle Extrakten sowie für die Identifizierung von HIF-1α-wechselwirkenden Proteinen. Darüber hinaus translozieren mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich derjenigen der HIF-1-Komplex in den Zellkern unter hypoxischen Bedingungen12,13,14. Die meisten der aktuellen Methoden für die PPI-Studien werden mit unphysiologischen Überexpression von Proteinen durchgeführt. Diese Protein-Überexpression wurde berichtet, zu verschiedenen zellulären defekten durch mehrere Mechanismen, einschließlich des Ressource-Überladung, stöchiometrischen Ungleichgewicht und promiscuous Interaktionen Weg Modulation15,16. In Bezug auf PPI Studien kann Protein Überexpression zu falsch positive oder sogar falsch Negative Ergebnisse je nach Protein Eigenschaften und der Funktionsweise der überexprimieren Proteine führen. Die aktuellen Methoden zur PPI Studien müssen daher geändert werden, um die physiologisch relevanten ppi unter hypoxischen Bedingungen zu offenbaren. Zuvor haben wir bewiesen, dass die Interaktion zwischen HIF-1 und Ets Familie Transkriptionsfaktors GA-bindeprotein (GABP) in hypoxischen P19 Zellen, die für die Reaktion des Hes1 -Promotors auf Hypoxie17beiträgt. Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation Protokoll zur ppi zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT erscheint als ein Proof of Concept. Dieses Protokoll eignet sich für den Nachweis der Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulatoren unter hypoxischen Bedingungen, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Tris-HCl Puffer, pH 7,4&nbsp;</td><td>1. BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Sepharosekügelchen</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Natürliches Maus-IgG-Protein</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membran &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Blotting-Grade Blocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Fettfreie Trockenmilch für Western Blotting-Anwendungen</td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Kochsalzlösung (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>SignalFire ECL Reagenz</td><td>Zellsignalisierung</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1 beta Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Konzentration: 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>HIF-1 alpha Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Konzentration: 1,0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Konzentration: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome Nuclear Protein Kit</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Lysepuffer NL und Extraktionspuffer NX1 sind im Kit</td></tr><tr><td>enthalten GAPDH Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Konzentration: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Glycerin (&ge; 99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A Zelllinie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteasehemmer Tabletten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA-Protein-Assay-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>QSP Gel-Ladetipp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 μl</td></tr><tr><td>Ausrüstung/Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thick Blot Filterpapier, vorgestanzt, 7,5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Tetra Vertikale Elektrophoresezelle für Mini-Fertiggele, mit Mini-Trans-Blot&nbsp; Modul und PowerPac Basic Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>I-Glove</td><td>BioSpherix</td><td>I-Glove</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5 ml Stripette serologische Pipets</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10 mL Stripette Serologische Pipets</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25 mL Stripette Serologische Pipets</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Klarer Boden Schwarz Polystyrol Mikrotiterplatten</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15 mL hoch Clarity PP konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>kleine Zellen Schaber</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson &nbsp; Pipetman L 4-Pipetten-Set&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 und Zubehör</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipettierer</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Justrite Lagerschränke für brennbare Flüssigkeiten</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchenrotator SB3</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Mikrozentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysegerät</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, 0,1 mL</td></tr><tr><td>Schwimmbojen für 0,1 mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE Digitale Trockenbadheizungen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 1300 Serie A2 Klasse II, Typ A2 Bio-Sicherheitswerkbänke</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunopräzipitation assay mit endogenen nuklearen proteinen aus zellen kultiviert unter hypoxischen bedingungen

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Niedrige Sauerstoffsättigung (Hypoxie) lösen eine Vielzahl von adaptive Reaktionen mit Hypoxie-induzierbaren Faktors Komplex als ein master Regler 1 (HIF-1). HIF-1 besteht aus einem heterodimerisierenden Sauerstoff reguliert α Untereinheit (HIF-1α) und konstitutiv ausgedrückt β-Untereinheit (HIF-1β) auch bekannt als Aryl Hydrocarbon-Rezeptor nuklearen Nyrianer (ARNT), Regulierung von Genen, die in unterschiedlichen Prozessen einschließlich Angiogenese , Erythropoese und Glykolyse. Die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine ist Schlüssel zum Verständnis der Hypoxie Signalweg. Neben der Regelung von HIF-1α Stabilität löst Hypoxie auch die nukleare Translokation von vielen Transkriptionsfaktoren einschließlich HIF-1α und ARNT. Bemerkenswert ist, basieren die meisten aktuellen Methoden zur Untersuchung solcher Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) auf Systemen, wo proteingehalte durch Protein-Überexpression künstlich erhöht werden. Protein-Überexpression oft führt zu unphysiologischen Ergebnisse aus zeitlichen und räumlichen Artefakte. Hier beschreiben wir eine modifizierte co-Immunopräzipitation Protokoll nach Hypoxie Behandlung mit endogenen nuklearen Proteine und als ein Proof of Concept, das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT zu zeigen. In diesem Protokoll die hypoxischen Zellen unter hypoxischen Bedingungen geerntet wurden und die Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) Waschpuffer war auch vorab äquilibriert hypoxischen Bedingungen vor der Benutzung zum Proteinabbau oder Proteinkomplex mindern Dissoziation in flussbettfilters. Darüber hinaus waren die nuklearen Fraktionen anschließend extrahiert, um konzentrieren und endogenen nuklearen Proteine stabilisieren und vermeiden mögliche falsche Ergebnisse oft während Protein Überexpression gesehen. Dieses Protokoll kann zur endogene und native Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden unter hypoxischen Bedingungen zu demonstrieren.

Die zelluläre Reaktion auf Hypoxie, der Ausdruck beurteilen wurden Ebenen und subzelluläre Lokalisation der Komponenten der HIF-1 folgende Hypoxie Komplexbehandlung untersucht. HEK293A Zellen wurden kultiviert unter hypoxischen Bedingungen für 4 h oder als Steuerelemente auf normoxiezustand gehalten. HIF-1α und ARNT proteingehalte untersucht wurden ganze Zelle oder nukleare/zytoplasmatischen extrahiert durch western-Blot. Wie erwartete, total HIF-1α-Ebenen hochreguliert durch Hypoxie, ARN...

Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation-Protokoll, um Protein-Protein-Interaktionen zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Diese Methode eignet sich zur Demonstration der Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden auf Hypoxie.

Co-Immunopräzipitation Assay mit endogenen nuklearen Proteinen aus Zellen kultiviert unter hypoxischen Bedingungen

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im hypoxischen Bereich zu beantworten, wie z.B. endogene und native Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren transkriptionellen Coregulatoren unter hypoxischen Bedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die hypoxischen Zellen unter hypoxischen Bedingungen geerntet werden und die Kernfraktionen für die Co-Immunpräzipitation verwendet werden. Bei diesem Protokoll werden humane embryonale Nieren-293A-Zellen verwendet, die in vier 10-Zentimeter-Schalen gezüchtet wurden.Säen Sie drei- bis fünfmal 10 bis sechste Zellen pro Schale in 10 Milliliter des modifizierten Eagle-Mediums von Dulbeco, ergänzt mit 10% FBS, L-Glutamin, Natriumpyruvat, Penicillin und Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Vierundzwanzig Stunden nach der Aussaat, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, legen Sie zwei Schalen mit 1 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für vier Stunden in die Hypoxie-Unterkammer in der Inkubator-Handschuhbox.Bewahren Sie die anderen beiden Gerichte bei Normoxia auf. Am Tag vor der Entnahme der mit Hypo

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier schlagen wir einfache Methoden, um eine Hypoxie in Zellkulturen und einfache Tests veranlassen, die hypoxischen Zustand der Kulturen zu bewerten.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Dieses Video beschreibt das Protokoll für den Chromatin-Immunpräzipitations-Assay (ChIP), der eine klassische Technik zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist. Diese Technik wird verwendet, um Zielgene in menschlichen chronischen lymphatischen Leukämiezellen zu identifizieren.

Chromatin-Immunpräzipitationsassay: Eine Technik zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Zellen

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität.

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Wir beschreiben eine Technik zur Analyse der globalen RNA-Synthese in Hypoxie mit bildgebenden. Click-Chemie Markierung von RNA wurde bisher nicht unter Hypoxie durchgeführt und ermöglicht die Visualisierung der globalen RNA Veränderungen auf Einzelzellebene. Dieser Ansatz ergänzt die bestehenden gemittelt RNA-Techniken, die eine direkte Visualisierung von Zell-zu-Zell-Veränderungen in der globalen RNA-Synthese.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Dieses Manuskript beschreibt einen Ansatz zur Isolierung ausgewählter verwandter RNPs, die in eukaryotischen Zellen gebildet werden, durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Ansatzes, indem wir ein verwandtes RNP isolieren, das an die retrovirale 5'-untranslatierte Region gebunden ist, die aus DHX9/RNA-Helikase A besteht.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Untersuchung mehrere, können endogene post-translationalen Modifikationen für ein Zielprotein extrem schwierig sein. Hier beschriebene Techniken nutzen eine optimierte Lyse Puffer und Filter System entwickelt mit spezifischen PTM-targeting, Affinität Matrizen, die Acetylierung, Ubiquitination, Sumoylierung 2/3 und Tyrosin Phosphorylierung Änderungen für ein Ziel zu erkennen Protein mit einem einzigen, gestrafften System.

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Hier beschreiben wir ein in-vitro-Protokoll zur Modellierung von Hypoxie/Reoxygenierungsschäden in den hochmetabolischen proximalen tubulären Epithelzellen. Dieses Modell ist darauf ausgelegt, durch metabolischen Stress verursachten Schaden zu induzieren, was durch die Expression proximaler Tubulusschadenmarker und die Beurteilung der mitochondrialen Atemfunktion gemessen werden kann.

Modellierung von Hypoxie/Reoxygenationsschäden in proximalen tubulären Epithelzellen

Erfahren Sie die Co-Immunopräzipitation endogener nuklearer Proteine aus HEK293A-Zellen unter hypoxischen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nativer Protein-Protein-Interaktionen.

Co-Immunopräzipitation Assay mit endogenen nuklearen Proteinen aus Zellen kultiviert unter hypoxischen Bedingungen

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