Co-Immunopräzipitation Assay mit endogenen nuklearen Proteinen aus Zellen kultiviert unter hypoxischen Bedingungen

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im hypoxischen Bereich zu beantworten, wie z.B. endogene und native Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren transkriptionellen Coregulatoren unter hypoxischen Bedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die hypoxischen Zellen unter hypoxischen Bedingungen geerntet werden und die Kernfraktionen für die Co-Immunpräzipitation verwendet werden. Bei diesem Protokoll werden humane embryonale Nieren-293A-Zellen verwendet, die in vier 10-Zentimeter-Schalen gezüchtet wurden.

Säen Sie drei- bis fünfmal 10 bis sechste Zellen pro Schale in 10 Milliliter des modifizierten Eagle-Mediums von Dulbeco, ergänzt mit 10% FBS, L-Glutamin, Natriumpyruvat, Penicillin und Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Vierundzwanzig Stunden nach der Aussaat, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, legen Sie zwei Schalen mit 1 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für vier Stunden in die Hypoxie-Unterkammer in der Inkubator-Handschuhbox.

Bewahren Sie die anderen beiden Gerichte bei Normoxia auf. Am Tag vor der Entnahme der mit Hypoxie behandelten Zellen wird DPBS auf hypoxische Bedingungen voräquilibriert, indem eine unbedeckte 100-Milliliter-Experiment-Reagenzflasche, die mit DPBS gefüllt ist, für 24 Stunden in die Hypoxie-Unterkammer gestellt wird. Etwa eine Stunde vor der Entnahme der Zellen wird eine Eisbox mit Eis in die Verarbeitungskammer der Glovebox gelegt, die auf 1 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid ausgeglichen wurde.

Die Flasche mit dem voräquilibrierten hypoxischen DPBS wird aus der Hypoxie-Unterkammer in die Verarbeitungskammer überführt und auf Eis gelegt. Vier Stunden nach der Hypoxiebehandlung übertragen Sie die Zellen aus der Hypoxie-Unterkammer in die Prozesskammer, die auf 1 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid voräquilibriert wurde. Entfernen Sie das Kulturmedium durch Aspiration und spülen Sie die Zellen mit einer 10-Milliliter-Pipette einmal mit 10 Millilitern eiskaltem, vorequilibriertem hypoxischem DPBS.

Fügen Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette 5 Milliliter eiskaltes, voräquilibriertes DPBS hinzu und entfernen Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem Zellschaber abkratzen. Kippen Sie die Zellkulturplatte, sammeln Sie die abgelösten Zellen mit einer 10-Milliliter-Pipette und geben Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Halten Sie die Röhre mit den Zellen auf Eis.

Öffnen Sie die Tür zwischen der Verarbeitungs- und der Pufferkammer in der Glovebox, die beide auf 1 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid voräquilibriert wurden. Übertragen Sie die konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis mit Hypoxie-behandelten Zellen aus der Prozesskammer in die Pufferkammer. Öffnen Sie die Tür der Pufferkammer und entnehmen Sie die Zellen vollständig aus der Glovebox.

Sowohl die hypoxischen Zellen als auch die normoxischen Zellen werden durch Zentrifugation bei 1000 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius pelletiert. Für dieses Verfahren wird ein nukleares Extraktionskit verwendet. Beginnen Sie mit der sanften Resuspendierung jedes Zellpellets in 500 Mikrolitern Lysepuffer NL, ergänzt mit 1X Proteaseinhibitor-Cocktail in 0,1 molaren DTT, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.

Geben Sie 25 Mikroliter Detergenzlösung NP in die Zellsuspension und wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit. Zentrifugieren Sie bei 1000 mal 10 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Bewahren Sie sowohl den Überstand als auch die Kernkugel auf.

Nach dem Sammeln und Lagern des Überstandes, wie im Textprotokoll beschrieben, resuspendieren Sie die pellethaltigen Zellkerne in 500 Mikrolitern Lysepuffer NL, ergänzt mit 1X Proteaseinhibitor-Cocktail und 0,1 molaren DTT, indem Sie fünf Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Resuspendieren Sie das nukleare Pellet in 50 Mikrolitern Extraktionspuffer NX1, ergänzt mit 1X Proteaseinhibitor-Cocktail, indem Sie das Pellet mehrmals auf und ab pipettieren. 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Alle fünf Minuten 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit wirbeln. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Der Überstand wird aufgefangen und zur Entsalzung in Mini-Dialysegeräte mit einem maximalen Volumen von 100 Mikrolitern pro Einheit überführt.

Verschließen Sie die Mini-Dialysegeräte und legen Sie sie in eine Schwimmhilfe. Legen Sie die Schwimmhilfe in ein Becherglas mit 500 Millilitern vorgekühltem Dialysepuffer. Achten Sie darauf, den direkten Kontakt mit der Haut oder das Einatmen des Dialysepuffers zu vermeiden, da er PMSF enthält.

vier Grad Celsius unter leichtem Rühren 30 Minuten lang inkubieren. Nach 30 Minuten werden die Proben aus der Ecke der Mini-Dialysegeräte entnommen und in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 12 Tausend g bei vier Grad Celsius.

25 Mikroliter jedes Überstands werden in ein 1,5-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen aliquotiert und bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Bereiten Sie die Sepharosekügelchen des Proteins AG für die Immunpräzipitation vor. Pipettieren Sie 50 Mikroliter Kügelchen in jedes der vier 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter DPBS-Puffer pro Röhrchen hinzu.

Pelletieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern TBS-Puffer. Fügen Sie zwei Mikroliter monoklonalen Maus-Anti-ARNT-Antikörper oder Maus-Immunglobulin G hinzu, das durch Rekonstitution von 0,7 Milligramm Maus-IgG in 500 Mikrolitern TBS-Puffer hergestellt wurde.

Bringen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den Kügelchen in einen Kühlraum. Legen Sie sie in einen Röhrenrotator und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 10 U/min. Nach zwei Stunden werden die Kügelchen durch Zentrifugation pelletiert und die Überstände verworfen.

200 Mikrogramm des zuvor hergestellten Kernproteinlysats werden in 800 Mikrolitern Immunpräzipitationspuffer verdünnt. Inkubieren Sie das Lysat mit den antikörpergekoppelten Kügelchen über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag pelletieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei 3000 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie einen Milliliter eiskaltes TBS mit 0,2 % NP-40 in jedes Röhrchen und schleudern Sie es herunter. Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise dreimal mit eiskaltem TBS mit 0,2 % NP-40.

Kochen Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern Laemmli-Probenpuffer bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 10 Tausend g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Sammle den Überstand ein und wirf die Perlen weg.

Die Expressionsniveaus in der subzellulären Lokalisation der Komponenten des HIF-1-Komplexes nach einer Hypoxiebehandlung wurden in HEK293A Zellen untersucht. Wie erwartet wurden die Gesamt-HIF-1a-Spiegel durch Hypoxie hochreguliert, während die ARNT-Spiegel in den gesamten zellulären Lysaten nicht signifikant verändert wurden. Darüber hinaus induzierte Hypoxie eine nukleare Akkumulation von HIF-1a und ARNT.

Co-Immunpräzipitationsexperimente wurden mit Kernextrakten aus HEK293A Zellen durchgeführt, die normoxischen oder hypoxischen Bedingungen ausgesetzt waren. Wie hier gezeigt, wurde HIF-1a zusammen mit ARNT aus den Kernextrakten hypoxischer HEK293A Zellen co-immunpräzipitiert, was darauf hindeutet, dass HIF-1a unter hypoxischen Bedingungen mit ARNT interagiert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hypoxie, endogene Wechselwirkungen zwischen Kernproteinen und deren hypoxische Bedingungen zu erforschen.