Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, eine Screening-Kaskade zu veranschaulichen, die die Entdeckung neuartiger GABA-A-Rezeptor-Liganden ermöglicht. Der Vorteil der Verwendung von Radioligandenbindung, elektrophysiologischer Aufzeichnung in Xenopus-Eizellen und in Hirnschnitten von Nagetieren in literativer Weise besteht darin, dass das Profil der Verbindung verbessert werden kann. Letztendlich werden potente Subtypen, selektive und wirksame Verbindungen identifiziert.

Diese Vorführung wird von Kumico Kambara und Jenna Tognaccini sowie Sonia und Daniel Bertrand von HiQScreen und Marie Claire Pflimlin von Roche durchgeführt. 10 bis 50 Nanoliter der plasmidhaltigen Lösung werden mit einer Mikroinjektionsnadel aus Glas mit einem Spitzendurchmesser von bis zu 100 Mikrometern injiziert, die auf einem Mikromanipulator montiert ist, der mit einem Druckauswerfersystem oder einem automatisierten Injektionssystem ausgestattet ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, halten Sie die Eizellen bei 17 Grad Celsius, um die Expression von Hitzeschockproteinen zu verhindern.

Lagern Sie die Mikroplatte in einem thermisch kontrollierten Lagerbereich. Dann lösen Sie die Testverbindungen, die im Bindungsassay in OR2 positiv getestet wurden, bei 0,1 und 1000 Mikromolar für elektrophysiologische Aufzeichnungen auf und entsorgen Sie sie in einer 96-Well-Polypropylenplatte mit flachem Boden. Um eine Aufzeichnung mit zwei Elektroden-Spannungsklemmen durchzuführen, legen Sie eine Platte mit den Eizellen auf das automatisierte System.

Programmieren Sie das automatisierte Aufzeichnungssystem über die symbolbasierte Schnittstelle mit diesem Schema für die geeignete Bestimmung der Konzentrations-Wirkungs-Beziehung. Für die Kurvenanpassung wird die Stromamplitude anhand der dargestellten Konzentrationsaktivierungskurve als Funktion des Logarithmus der Agonistenkonzentration dargestellt. Für die elektrophysiologische Aufzeichnung halten Sie das Gehirn in einer dACSF-Lösung, die mit Carbogen bei Raumtemperatur blasig ist.

Präparieren Sie dann die linke Hippocampus-Formation mit einem feinen Spatel. Anschließend werden Querschieber mit einer Dicke von 400 Mikrometern aus dem medianen Teil des Hippocampus mit einem Gewebehacker geschnitten. Übertragen Sie die Scheiben mit einem Malpinsel in die Aufnahmekammer und halten Sie sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Anschließend perfundierten Sie die Scheiben mit rACSF, das mit Carbogen bei 35 Grad Celsius und einer Geschwindigkeit von 1,5 Millilitern pro Minute blasiert wurde. Um einen einzelnen Populations-Spike aufzuzeichnen, platzieren Sie eine Gehirnscheibe in der am Mikroskop montierten Kammer. Perfundierten Sie die Scheibe mit rACSF mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute.

Ziehen Sie mit dem Pipettenabzieher an einer Mikropipette aus Borosilikatglas mit einem Widerstand von etwa zwei Megaohm. Füllen Sie die Mikropipette mit einer Lösung, die zwei molare Natriumchloride enthält, und geben Sie sie in den Pipettenhalter. Positionieren Sie die Aufzeichnungsmikropipette mit dem rechten Mikromanipulator im Stratum pyramidale in der CA1-Region des Hippocampus-Schnitts.

Setzen Sie anschließend eine isolierte bipolare Platin-Iridium-Elektrode in die Halterung am linken Mikromanipulator ein. Positionieren Sie die Stimulationselektrode mit dem linken Mikromanipulator in den Schaffer-Kollateralen im CA1-Bereich des Hippocampus-Schnitts. Geben Sie mit dem Stimulusgenerator alle 30 Sekunden einen Stromimpuls an die Stimulationselektrode ab und erhöhen Sie die Stimulationsstärke allmählich, bis eine Populationsspitze auftritt.

Passen Sie die Stimulusstärke an, um eine Populationsspitze hervorzurufen, die 45 % der maximal erreichbaren Amplitude entspricht. Um eine gepaarte Impulshemmung durchzuführen, geben Sie alle 30 Sekunden mit dem Stimulusgenerator zwei Stromimpulse an die Stimulationselektrode ab. Stellen Sie die Stimulusstärke so ein, dass eine Populationsspitze hervorgerufen wird, die 45 % der maximalen Amplitude entspricht.

Um die Verbindungen zu testen, verdünnen Sie die zu prüfenden Verbindungen in ACSF so, dass die Endkonzentration von DMSO nicht höher als 0,1 % ist. Geben Sie DMSO in der gleichen Konzentration wie in der Verbindungslösung in die Kontrolllösung. Zeichnen Sie mindestens 30 Minuten lang alle 30 Sekunden einen einzelnen oder einen gepaarten Anstieg der Pulspopulation auf, der durch Schaffer-Kollateralstimulationen hervorgerufen wird. Die Spike-Form der Population sollte während dieses Basiszeitraums stabil sein.

Bereiten Sie als Nächstes ein Becherglas mit karbogeniertem rACSF vor, das eine feste Konzentration der zu testenden Verbindung enthält, und perfundieren Sie die Hippocampusscheibe mit der Lösung während der Aufzeichnung von einzelnen oder gepaarten Pulspopulationsspitzen. Bewerten Sie außerdem die Wiederherstellung nach dem Compound-Effekt, indem Sie die Scheibe mit carbogenated rACSF ohne die Verbindung perfundieren. Hier ist eine schematische Darstellung einer Hippocampusscheibe der Ratte zu sehen, wobei die Schaffer-Kollateralen, die von den CA3-Pyramidenzellaxonen stammen, auf die dendritische Arborisation der CA1-Pyramidenneuronen projizieren.

Mikropipetten wurden im Stratum pyramidale platziert, um Populationsspitzen aufzuzeichnen, und im Stratum radiatum für dendritische Aufzeichnungen von exzitatorischen postsynaptischen Feldpotentialen. Die Stimulationselektrode wurde in den Schaffer-Kollateralen platziert. Diese Abbildung zeigt Populationsspitzen, die durch die gepaarten Stimuli hervorgerufen werden, die über dieselbe Stimulationselektrode in einem Intervall von 20 Millisekunden angewendet werden.

Die Reaktion der Population auf den zweiten Stimulus ist von kleinerer Amplitude als die Reaktion auf den ersten Stimulus. Populationsspitzen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von beta CCM, einem nicht-selektiven GABA-A-Rezeptor NAM, aufgezeichnet. Beta CCM erhöhte die Amplitude des zweiten Populationsspikes, indem es jede gabaerge Hemmung nach vorne teilweise blockierte.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Pharmakokinetik, die Rezeptorbelegung und -wirksamkeit in vivo und die Sicherheitspharmakologie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie das Potenzial für die klinische Entwicklung der identifizierten Wirkstoffe zu beantworten.