Name: Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Erfahren Sie eine Screening-Kaskade zur Entdeckung neuer GABA-A-Rezeptor-Liganden mit Radioligandenbindung und elektrophysiologischen Aufzeichnungen in Xenopus-Oozyten und Nagiergehirnschnitten.

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Die Autoren danken Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab und Marie Claire Pflimlin von Roche und Tifany Schaer und Deborah Paolucci aus HiQScreen für ihre hervorragenden technischen Betreuung.

Xenopus Laevis sind untergebracht und nach Genf Kanton Tier Richtlinien behandelt.
1. Radioligand Bindung
<ol><li>
Vorbereitung der Assay-Platte
	<ol>
<li>1,5 L testpuffer mit 1,25 mM CaCl2, 5 mM KCl, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl und 15 mM Tris vorzubereiten; Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4.</li>
		<li>Bereiten Sie die Verbindungen auf 50.76 µM (z.B. eine Verbindung bei 10 mM in einem 980 µL-Assay-Puffer in einem Microcentrifuge Schlauch 5 µL) getestet werden. Mischen Sie sie gut mit einem Vortex-Maschine mit hoher Geschwindigkeit für 2 – 5 s.</li>
		<li>Eine Vorverdünnung der Referenz zusammengesetzte Flumazenil 1.970 µL testpuffer durch pipettieren 1 µL der Verbindung (10 mM) vorbereiten. Mischen Sie sie gut mit einem Vortex-Maschine mit hoher Geschwindigkeit für 2 – 5 s.</li>
		<li>Verdünnen Sie eine [3H] Flumazenil Stammlösung mit dem Assay-Puffer bei 4 ° C bis 4 nM in einem 50 mL-Polypropylen-Rohr.</li>
		<li>Pipette 50 µL/Well von testpuffer in Spalten 1 und 3 / 11 von einer 96-Well-Mikrotestplatte wie in der Platte Layout dargestellt in Abbildung 2dargestellt.</li>
		<li>Pipette 73,2 µL der Verbindungen 50.76 µM verdünnt (siehe Schritt 1.1.2) in Spalte 12 der Platte.</li>
		<li>Verdünnen Sie jede Verbindung mit der geometrischen Progression über 9 Stufen (1E-10 -1E–06 M), mit einem 23,12 µL Transfervolumen und füllen Spalten 3 – 11. Mischen Sie die Verdünnung gründlich. Ändern Sie die Spitze nach jeder Verdünnung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verdünnen Sie die Zellmembranen
	<ol>
<li>Tauen Sie die Zellmembranen, die zuvor von einer HEK293 überexprimierenden menschlichen GABA-A Rezeptor isoliert (0,025 – 0,15 mg/mL), erhalten 80 mL bei Raumtemperatur (RT) und überträgt die Aussetzung auf der Assay-Puffer bei 4 ° c</li>
		<li>Die Membran-Lösung immer noch bei 4 ° C mit einer Gewebe-Homogenisator für 30-40 s bei 10.000 – 12.000 u/min aufzuwirbeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verdünnen Sie Diazepam für die Kontrolle der unspezifischen Bindung (NSB)
	<ol>
<li>Verdünnen Sie eine 4 mM Diazepam Stammlösung mit dem Assay-Puffer zu einer Konzentration von 40 µM in 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Starten Sie die Reaktion
	<ol>
<li>Pipette 50 µL 4 nM [3H] Flumazenil in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und halten Sie es in einem Eis-Wasser-Behälter.</li>
		<li>Fügen Sie 100 µL der GABA-A Rezeptor Subtyp Membranen Vorbereitung eine Proteinkonzentration von 0,5 mg/mL haben.</li>
		<li>Pipette 50 µL 40 µM Diazepam in Spalte 2.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte für 1 h auf dem Eis.</li>
		<li>50 µL testpuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Filter-Platte für die anschließende Membran Trennung und Radioaktivität Messung hinzufügen und danach die Reaktion zu stoppen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Die Reaktion zu stoppen
	<ol>
<li>Bereiten Sie einen Wasch-Puffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 7.4.</li>
		<li>Filtern Sie die Lösung unter Verwendung einer 96-Well-Zelle-Erntemaschine. Waschen Sie die Platte 3 X mit 300 µL eiskalt waschen Puffer pro Bohrloch.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Unterseite der Platte mit einer Kunststoff-Folie und fügen Sie 40 µL Funkeln cocktail für flüssige Funkeln zählen in jedem gut und wischen Sie es mit Ethanol 70 %.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte für mindestens 1 h bei RT Mindestens eine weitere Stunde bei RT stehen lassen</li>
		<li>Messen Sie die Radioaktivität (in CPM), indem Sie die Platte auf einem Szintillationszähler. Erlauben Sie eine Messung für 3 min pro Bohrloch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Datenanalyse
	<ol>
<li>Bestimmen Sie der Mittelwert für die 8 unspezifischen Bindung (NSB) und die gesamte Bindung (TB) sowie für die Duplikate oder Triplicates der Proben repliziert. Berechnen Sie die % spezifische Bindung (SB) für den Mittelwert jeder Probe nach der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Hier, insgesamt SB = mittlere TB minus die NSB bedeuten.</li>
		<li>Baugrundstück in Abszisse % SB versus in koordinieren die Inhibitor-Konzentrationen. Passen Sie die Daten unter Verwendung der einzigen Website Wettbewerb Analyse Gleichung: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Hier, y = % der SB, A = das Minimum von y, B = y, maximal C = IC50, X = Log10 des Zusammenschlusses der konkurrierenden Verbindung D = die Steigung der Kurve (Hill-Koeffizient).</li>
		<li>Berechnen der Bindungsaffinität (Ki) über die halbe maximale inhibitorischen Konzentration (IC50), die Dissoziationskonstante (Kd) von [3H] Flumazenil auf die jeweiligen Membranen9und die Konzentration von [3H] Flumazenil in der Probe nach der folgenden Gleichung Daten verwenden: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Rezeptor-Expression und Aufnahmen in Xenopus Eizellen
<ol><li>Eierstöcke, die Ernte und Vorbereitung der Eizelle
	<ol>
<li>Bereiten Sie die sterile Barth-Lösung mit 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM Nahco33, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O und 0,41 mM CaCl2.6H2O, bei pH 7,4 , ergänzt mit 100 Einheit/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL von Amphotericin b.</li>
		<li>Bereiten Sie das 1 x OR2 Medium (keine CaCl2) mit 88,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, bei pH 7,4.</li>
		<li>Opfer eine Xenopus Laevis weiblichen durch tiefe Narkose für 20 min in gekühlten Tricaine Methanesulfonate (bei einer Konzentration von 150 mg/L, bei pH 7,4 eingestellt) und Natriumbicarbonat (300 mg/L) durch Enthauptung gefolgt.</li>
		<li>Ernte der Eierstöcke schnell mit sauber Scheren und Pinzetten und legen Sie sie in 2 Petrischalen (10 cm) gefüllt mit 40 mL 1 x Barth Lösung und Antibiotika/antimykotikums.</li>
		<li>Speichern Sie die Eierstöcke nicht dissoziierten für bis zu 2 Wochen in Barth Lösung bei 4 ° C.</li>
		<li>Für die Dissoziation, schneiden die Eierstöcke mit einer sauberen Rasierklinge in kleinen Fraktionen (1 – 2 cm3) und inkubieren sie in 50 mL OR2 Medium ohne CaCl2 (OR2-NoCaCl-2) mit 0,2 % Kollagenase (Typ I) bei 17 – 19 ° C in einem 100 mL-Spinner Kolben mit einem langsamen Agitation für 4 – 5 h sicherstellen, dass die magnetischen Bar platziert ca. 3 – 5 cm über dem Boden des Kolbens zu vermeiden, brechen die Eizellen Spinner.</li>
		<li>Nach 4 – 5 h, stellen Sie sicher, dass die meisten die Eizellen von ihrer Follikel befreit sind (d. h., sie schwimmen einzeln). Waschen Sie sie 5 X mit 200 mL OR2 mit 1,8 mM CaCl2ergänzt.</li>
		<li>Defolliculated Eizellen Petrischalen (10 cm) gefüllt mit Barth Lösung und Antibiotika/Antimykotika und halten Sie sie mindestens über Nacht bei 17 ° C vor der cDNA oder mRNA Injektion zu übertragen.</li>
		<li>Am nächsten Tag, wählen Sie unter ein Fernglas, eine gesunde Eizelle präsentiert eine klare und eindeutige Tier im Vergleich zu einem Vegetal Pfosten (dunkelbraun für Tier Pole gegenüber hellgelb für die Vegetal-Pole). Verwenden Sie saubere Pasteur Pipetten und entsorgen Sie die Eizellen eins nach dem anderen in einem sterilen konische 96-Injektion-well-Platte. Hinweis: Keine besonderer Sorgfalt ist auf die Vermittlung von Eizellen für die mRNA-Injektionen erforderlich; in der Erwägung, dass für die cDNA-Injektionen ist es unerlässlich, die Eizellen mit dem Tier-Pol nach oben zu orientieren.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA oder cDNA automatische Injektion
	<ol>
<li>Die mRNAs mit einem kommerziell erhältlichen Kit folgen Sie den empfohlenen Anweisungen zu synthetisieren. Reinigen Sie die Instrumente und die Tabelle mit RNase und tragen Sie die entsprechende schützende Handschuhe. Hinweis: Die Qualität der mRNA ist Faktor für einen guten Ausdruck zu bringen, und es ist unerlässlich, um mRNA Abbau während der Injektion zu verhindern.</li>
		<li>Bereiten Sie mit einem kommerziell erhältlichen Kit cDNAs und lösen Sie die gewünschte Menge in Bidistilled Wasser bei einer Konzentration von 0,2 µg/µL.</li>
		<li>Injizieren von 10 – 50 nL mRNA-Lösung mit einer Konzentration von 0,2 µg/µL oder 10 nL cDNA-Lösung mit einer Konzentration von 0,02-0,2 µg/µL, vorzugsweise in Chargen von 95 Eizellen.</li>
		<li>Mix für Membran Proteine erfordert mehrere Untereinheiten (d.h. heteromeren α1β2γ2 GABA-A -Rezeptoren), die entsprechenden mRNAs oder cDNAs im gewünschten Verhältnis (d.h., 1:1:1 oder 1:10:1).</li>
		<li>Halten Sie die Eizelle bei 17 ° C, die Expression von hitzeschockproteinen durch die Eizellen zu verhindern; Speichern Sie die Mikrotestplatte in einem Thermo-gesteuerte Speicherbereich.</li>
		<li>Auflösen der Testverbindungen, die in der Bindung Assay in OR2 bei 0,1 – 1.000 positiv getestet wurden µM für elektrophysiologische Aufnahmen und entsorgen sie Sie in einer 96-Well Flachboden Polypropylen-Platte.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmide für Ausdruck
	<ol>
<li>Folgen Sie die Bedienungsanleitungen der handelsüblichen Kits für die mRNA-Synthese mit bakteriellen T7 oder T6 Promotoren und 20 µL einer Lösung bei 0,2 µg/µL RNase-freies Wasser.</li>
		<li>Bereiten Sie mindestens 20 µL einer Lösung mit einem Eukaryote Expressionsvektor für den cDNA-Ausdruck, in der Regel bei 0,2 µg/µL in Bidistilled Wasser aufgelöst.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroinjektion in die Eizelle und Visualisierung seiner Qualität
	<ol>
<li>10 – 50 nL der Lösung mit Plasmid zu injizieren (siehe Punkt 2.3.1 und 2.3.2) mit einer Glas-Mikro-Injektion-Nadel mit einem Tipp-Durchmesser reichen bis zu 100 µm auf einem Mikromanipulator, ausgestattet mit einer Druck-Auswurf-System oder mit einem automatisierten Einspritzsystem montiert. Hinweis: In dem hier besprochenen Beispiel werden Eizellen von Chargen von 95 mit einem automatisierten System geeignet für den Einsatz mit cDNA oder mRNA injiziert.</li>
		<li>Füllen Sie die Injektionsnadel mit 1 µL eines Farbstoffes wie Methylenblau bei 1 % und injizieren Sie die Eizellen mit dem Standardverfahren (entweder im Zellkern für cDNA oder im Zytoplasma für mRNA) zu.</li>
		<li>Die injizierten Eizellen für ungefähr 1 Minute in kochendes Wasser zu entsorgen. Halbieren Sie die Eizellen mit einer Rasierklinge unter ein Fernglas. Hinweis: Der Farbstoff bleibt lokalisierte wie in Abbildung 3E, so dass eine genaue Beobachtung der Injektion.</li>
	</ol></li>
	<li>Zwei-Elektroden-Spannung Klemme Aufnahmen
	<ol>
<li>Legen Sie die well-Platte mit den Eizellen auf dem automatisierten System, das das in Abbildung 4dargestellten Prinzip nutzt. Hinweis: Im Gegensatz zu den Patch-Clamp-System in Abbildung 5dargestellt, wird das wahre Membran-Potential der Zelle von der Elektrode Spannung gelesen.</li>
		<li>Programmieren Sie die automatisierte Recording-System mit den Symbol-basierte Schnittstelle, beispielsweise die Regelung für die Bestimmung der Konzentration AKTIVITÄTSBEZIEHUNG in Abbildung 6 dargestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Kurvenanpassung
	<ol>
<li>Analysieren Sie die Ergebnisse mit der entsprechenden Software, mit der illustrierten Konzentrationskurve Aktivierung, zeichnen Sie die aktuelle Amplitude als Funktion des Logarithmus der Konzentration Agonist.</li>
		<li>Beobachten Sie die sigmoidale Kurve, die mit der empirischen Hill-Gleichung in der Form nachträglich eingebaut werden kann: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Hier, Y= Anteil der evozierten Strom EG 50 = die Konzentration für eine 50 %-Aktivierung X = Konzentration der Substanz, nH = der Hill-Koeffizient oder scheinbare Kooperativität.</li>
		<li>Normalisieren Sie die Ströme zu einer Einheit dividiert die Amplitude der jede Antwort im Vergleich zu der Wert in der höchsten Konzentration zu analysieren, die Daten aus einer Reihe von Zellen aufgenommen.</li>
		<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche und Standardfehler und realisieren Sie die Kurvenanpassung mit standardgemäß verfügbare Software zu.</li>
	</ol></li>
</ol>(3) elektrophysiologische Aufnahmen in Hirnschnitten
Hinweis: Hippocampal Ratte Scheiben sind gemäß den nationalen und institutionellen Richtlinien bereit.
<ol><li>
Vorbereitung des Hippocampus Scheiben
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Dissektion künstliche Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (dACSF) mit 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM Nahco33, 10 mM Glukose und 4 mM Saccharose in der Flasche mit einer Mischung aus 95 % O2 und 5 % CO2vergast.</li>
		<li>Bereiten Sie die Aufnahme künstliche Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (rACSF) mit 124 mM NaCl 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM Nahco33und 10 mM Glukose in der Flasche mit einer Mischung aus 95 % O2 und 5 % CO2vergast.</li>
		<li>Die Ratten, die mit einer Mischung aus 2,5 % Isofluran und reinem Sauerstoff zu betäuben und sie zu enthaupten.</li>
		<li>Schneiden Sie die Kopfhaut nach der Mittellinie mit einer feinen Schere. Schneiden Sie entlang der Mittellinie des Schädels, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen. Entfernen Sie den Schädel mit einer Pinzette zu und mit einem feinen Spatel auf das Gehirn aushöhlen.</li>
		<li>Das Gehirn in die Vergaste dACSF Lösung bei RT und sezieren Sie die linken hippocampale Anordnung mit einem feinen Spachtel.</li>
		<li>Schnitt Quere Scheiben (400 µm dick) aus dem mittleren Teil des Hippocampus mit einem Gewebe-Chopper und übertragen Sie sie auf die Aufnahme-Kammer mit einem Pinsel malen. Pflegen Sie die Scheiben bei RT für 45 Minuten.</li>
		<li>Durchspülen der Scheiben mit den vergast rACSF bei 35 ° C und mit einer Rate von 1,5 mL/min Blase die Lösung mit einem Gemisch aus 95 % O2 und 5 % CO2. Hinweis: Nach diesem Schritt sind die Scheiben für den elektrophysiologischen Experimenten bereit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Einzelpopulation Spike Aufnahme
	<ol>
<li>Legen Sie eine Gehirn-Scheibe in die Kammer Mikroskop montiert.</li>
		<li>Durchspülen der Scheibe mit einer Rate von 3 mL/min mit rACSF.</li>
		<li>Ziehen Sie eine Borosilikat Glas Mikropipette mit der Pipette Abzieher mit einem Widerstand von ~ 2 MΩ. Hinweis: Diese Mikropipette dient als Elektrode Aufnahme und elektrisch an den Verstärker angeschlossen ist.</li>
		<li>Füllen Sie die Mikropipette mit einer Lösung, die 2 M NaCl und legen Sie sie in die Pipette Halterung des Verstärkers.</li>
		<li>Positionieren Sie die Aufnahme Mikropipette in Stratum Pyramidale in der CA1-Region des Hippokampus Slice mit der richtigen Mikromanipulator. Hinweis: Die Lage ist schematisch in Abbildung 7dargestellt.</li>
		<li>Legen Sie eine isolierte bipolar Platin/Iridium Elektrode in die Halterung am linken Mikromanipulator. Hinweis: Diese Elektrode dient als die Stimulationselektrode und elektrisch mit Impuls-Generator verbunden ist.</li>
		<li>Position der Stimulationselektrode im Schaffer Sicherheiten in der CA1-Region des Hippokampus Slice mit der richtigen Mikromanipulator. Hinweis: Die Lage ist schematisch in Abbildung 7dargestellt.</li>
		<li>Liefern einem Stromimpuls an die Stimulationselektrode mit dem Impuls-Generator alle 30 s (100 µs Dauer, beginnend bei 10 µA) und die Stärke der Stimulation schrittweise zu erhöhen, bis eine Bevölkerung Spitze (PS) angezeigt wird.</li>
		<li>Passen Sie die Impulse Stärke zu evozieren einen PS entspricht 45 % der maximalen Amplitude, die gewonnen werden können. PSs sind bei 2,4 KHz gefiltert und bei 20 KHz mit dem Signalverstärker digitalisiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gepaart-Puls-Hemmung
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Gehirnscheiben (Schritt 3.1) und gehen Sie wie zuvor beschrieben (Schritte 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Liefern zwei Stromimpulsen (100 µs Dauer in einem Intervall von 20 ms) an die Stimulationselektrode alle 30 s mit dem Impuls-Generator. Legen Sie die Impuls-Stärke, einen PS entspricht 45 % der maximalen Amplitude zu erwähnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verbindung testen
	<ol>
<li>Verdünnungen der Verbindungen in vergast ACFS zu testende machen damit die Endkonzentration von DMSO nicht höher als 0,1 %.</li>
		<li>Die Kontrolllösung in der gleichen Konzentration als der in der zusammengesetzten Lösung DMSO hinzufügen.</li>
		<li>Aufzeichnen einer einziges (Schritt 3.2) oder ein gepaart-Puls (Schritt 3.3) PS hervorgerufen durch Sicherheiten Stimulationen Schaffer alle 30 s für mindestens 30 Minuten. Die PS-Form sollte während dieser Basisperiode stabil sein.</li>
		<li>Bereiten Sie einen Becher mit vergast rACSF mit einer festen Konzentration der Verbindung getestet werden.</li>
		<li>Durchspülen des hippocampalen Slices mit dieser Lösung während der Aufnahme noch der Einzel- oder gepaart-Puls PS.</li>
		<li>Bewerten Sie die Erholung von der Verbundwirkung durch Vorrichtung den Slice mit vergast rACSF ohne Verbindung. Hinweis: Für reversible Effekte kehrt die PS zu seiner ursprünglichen Form während der Basisperiode vor der zusammengesetzten Anwendung beobachtet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Datenanalyse
	<ol>
<li>Durchschnittliche PS Spuren aufgezeichnet während des Experiments in Blöcken von 4 Verwenden der Datenanalyse-Software.</li>
		<li>Messen Sie die PS-Amplituden der gemittelten Spuren.</li>
		<li>Normalisieren Sie die Amplituden als prozentualer Anteil der Ausgangswerte 10 min vor Vorrichtung eine Verbindung aufgenommen.</li>
		<li>Die Daten zu äußern, wie ± SEM bedeuten</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren Frédéric Knoflach und Maria Clemencia Hernandez sind Mitarbeiter der F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, Schweiz, ein pharmazeutisches Unternehmen. Der Autor Daniel Bertrand ist Angestellter der HiQScreen Sàrl 6, Rte de Compois, 1222 Vésenaz Genf, Schweiz, Bereitstellung von Screening-Einrichtungen für Pharma-Unternehmen.

Die Entwicklung von neuartigen Verbindungen aktiv auf eine Liganden-gated Ion Channel wie die GABA-A -Rezeptoren erfordert den Einsatz von mehreren Ansätzen. In der Regel ist der erste Schritt oft mit verbindliche Tests durchgeführt; solche Messungen sind jedoch nicht ausreichend, um die physiologische Aktivität die Verbindung oder die genauen Pharmakologie zu charakterisieren. Insbesondere eine Verbindung, die an einen Rezeptor bindet verbessern kann oder hemmen die Funktion oder sogar produzieren keine funktionalen Auswirkungen (Schweig) (d.h.Bindung an den Rezeptor, ohne seine Funktion zu ändern). Somit ist eine Funktionsprüfung erforderlich für eine vollständige Verbindung Charakterisierung.
Assays verbindlich: Der Hauptvorteil des Assays Bindung ist, dass es auf eine große Anzahl von Proben bis hin zu mehreren tausend effizient durchgeführt werden kann und dass es verbindliche Affinitäten für die aktiven Moleküle. Wie hierin beschrieben, besteht der erste Schritt eine Methode für die Bewertung der gewünschten Rezeptor-Subtypen zu etablieren. Nämlich, während Bindung auf native Rezeptoren aus Brüche oder ganze Gehirn durchgeführt werden kann, wird diese Methode die Bestimmung der Affinitäten zu bestimmten Rezeptor-Subtypen verhindern. Es ist daher notwendig, rekombinante Systeme auf Bildschirm Moleküle an das gewünschte Ziel zu verwenden. Heute bietet eine transiente und stabile Transfektion von gewünschten Rezeptor Untereinheit cDNAs in Zelllinien eine effiziente und zuverlässige Methode, um die Rezeptor-Subtypen von Interesse (z.B. GABA-A -α5β3γ2) zum Ausdruck bringen. Traditionelle Bindung Assays machen Verwenden von Radioligands, aber heute Techniken zur Verfügung, die Unannehmlichkeiten der Umgang mit Radioaktivität (z.B. quantitative Fluoreszenz basierende Ligand-Bindung) zu vermeiden.
Funktionaler Ausdruck in einem Host-System: Gene in einem Host-System zum Ausdruck zu bringen, muss die kodierende Sequenz des Interesses in ein Plasmid eingefügt werden, die geeigneten Promotoren enthält. In der Regel werden für in-vitro- mRNA-Synthese der bakteriellen T7 oder T6 Promotoren verwendet. Für eine cDNA-Ausdruck muss ein Eukaryote Promotor wie CMV (Zytomegalievirus) oder Äquivalent der Transkription des Gens von Interesse geregelt werden. Heute sind mehrere Plasmide, einschließlich der zwei Promotoren (d. h., pUNIV, pCMV-6AC, Psf-CMV/T7, pCI-Neo, PcDNA), zur Verfügung ermöglicht entweder eine in-vitro- Synthese der mRNA oder eine cDNA-Ausdruck wie in Abbildung 15dargestellt. Ein Ausdruck der GABA-A -Rezeptoren erhalten Sie treu in Zell-Linien oder in Xenopus Eizellen. Die wichtigsten Vorteile des letzteren sind der Mangel an einer endogenen Rezeptor-Expression, die Einfachheit der Manipulationen und die Verfügbarkeit eines automatisierten Systems für Mikro-Injektionen und Aufnahmen. In diesem Protokoll beschriebenen Verfahren illustrieren die Effizienz des automatisierten Systems, das erlaubt der Injektion von 96 Eizellen innerhalb von 7 Minuten und erfordert keine Kenntnisse der Mikromanipulation. Daran erinnern, dass ein einziger Eierstock aus einem Xenopus zwischen 10.000 – 30.000 Eizellen enthält, ist es klar, dass eine große Anzahl von Zellen Messungen auf einer einzigen Vorbereitung durchgeführt werden kann. Darüber hinaus da ein Ausdruck mit cDNA-Injektionen durchgeführt werden kann, die gleichen Plasmide mit den Genen von Interesse, die für die verbindliche Experimente entwickelt werden für eine funktionelle Charakterisierung ohne die Notwendigkeit für weitere Molekulare Biologie einsetzbar Manipulationen.
Angesichts seiner Größe und hohen oberflächenexpression, ergibt eine einzelne Eizelle eine Reihe von Rezeptoren, die die konfluierende Zellen in einem 35 mm Petrischale ungefähr entspricht. Jedoch stellt eine Eizellen Vorbereitung und Injektion einen Bruchteil der Kosten einer Zelllinie, da die Experimente keinem speziellen Nährmedium und sterile Manipulationen erfordern. Die Aktivierung eines einzigen GABA-A -Kanal ergibt sich ein paar Picoamperes (10-12) und Ströme bis hin bis zu zehn Mikroampere (10-6) leicht in einer einzigen Eizelle, die bestätigt, die gleichzeitige Tätigkeit von mehreren Millionen aufgezeichnet Rezeptoren während einer einzigen Antwort.
Ein erster Schritt in der Charakterisierung der Liganden-gated Ionenkanäle ist oft die Bestimmung der scheinbaren Affinität der Rezeptoren. Die Experimente, die durchgeführt werden müssen bestehen aus Anwendung einer Reihe von kurzen Agonist Prüfimpulse und Plotten die Amplitude der evozierten aktuelle oder in bestimmten Fällen die Fläche unter der Kurve (AUC) als Funktion des Logarithmus der Konzentration Agonist. Da es leicht möglich, verschiedene Plasmid-Konzentrationen und Verhältnis in der gleichen Charge von Eizellen microinject ist, ist dieses System der Ausdruck besonders geeignet für eine solche Charakterisierung. Außerdem ergab ein Vergleich von Charge zu Charge ein hohes Maß an Stabilität für verschiedene EG50s. Der Einfluss der Untereinheit Zusammensetzung auf den Rezeptor scheinbare Affinität ist leicht mit einer Spinne Grundstück, wie in Abbildung 10veranschaulicht visualisiert.
Die Ergebnisse der zwei-Elektroden-Spannung Klemme in Xenopus Eizellen gewonnen werden oft mit Aufnahmen, die mit Patch-Clamp-Elektroden verglichen. Während es den Rahmen dieser Arbeit in einen detaillierten Vergleich zwischen diesen beiden Systemen gehen sprengen würde, können ein paar Punkte untersucht werden. Während eine Patch-Clamp in Zellen Vorteile für eine biophysikalische Charakterisierung mit einer schnellen Drug Application bietet, sind die Anforderungen komplexer als jene der zwei-Elektroden-Aufnahmen in Xenopus Eizellen. Eine erste und nicht zu vernachlässigenden Schwierigkeit ist der Ausdruck eines gegebenen Proteins mit der Notwendigkeit einer Zellkultur, eine transiente und stabile Transfektion und die Identifizierung der Zellen, die das gewünschte Konstrukt zum Ausdruck bringen. Darüber hinaus ist es unerlässlich, um den möglichen Beitrag des endogenen Ausdrucks in der betrachteten Zelle untersuchen. Darüber hinaus erfordert eine Patch-Clamp-Aufnahme einen Fachmann der Mikromanipulation unter dem Mikroskop hoher Vergrößerung durchzuführen, während diese Person auch eine angemessene Analyse während des Experiments zu bewerten, z. B. die Qualität der Dichtung durchführen muss, der Zugang Widerstand etc. im Gegensatz dazu ein zwei-Elektroden-Spannung Klemme Aufnahme, vor allem mit einem automatisierten elektrophysiologische System erfordert keine besonderen Fähigkeiten und von Laboranten durchgeführt werden kann.
Beim Erwerb einer elektrophysiologischen Set-up ist Kosten berücksichtigen sicherlich ein wichtiger Faktor, der muss sorgfältig analysiert werden. Zum Beispiel die Kosten eines automatisierten Systems relativ hoch ist, zeigt ein genauerer Vergleich, dass die Installation eines kompletten elektrophysiologische Rigs schließt Kauf von Geräten wie z. B. gute Mikromanipulatoren, ein Fernglas-Objektiv, ein Verstärker, ein perfusion System und eine Anti-Vibrationstisch, aber auch die Erfassung von Daten und Durchführung einer Analyse. Ein Kostenvergleich zwischen einer zwei-Elektroden-Spannung Klemme Set-up gegen ein Patch Clamp-Setup zeigt noch weitere Unterschiede. Darüber hinaus das automatisierte System bietet den Vorteil der vollautomatischen Anlagen und wird Tag und Nacht unbeaufsichtigt ausgeführt.
Die pharmakologischen Eigenschaften eines Stoffes werden durch seine Wirkungsweise am Rezeptor bestimmt. Zum Beispiel sind wettbewerbsfähige Inhibitoren Moleküle, die die gleichen bindungstasche oder Orthosteric Website eingeben können, wie der Agonist selbst bewirkt, einen Wettbewerb dass. Nicht-kompetitiver Hemmer sind Verbindungen, die die Rezeptoren durch die Interaktion an anderer Stelle und im Falle einer Liganden-gated Ionenkanal hemmen, die können geben Sie und blockieren die ionische Pore, zum Beispiel. Es würde den Rahmen dieser Arbeit, die verschiedenen Mechanismen der Interaktion zu untersuchen hinausgehen, aber weitere Informationen erhalten Sie aus einer pharmakologischen Lehrbuch und/oder andere Arbeiten wie Bertrand und Bertrands22.
Bei allosterische Modulatoren ändert die Verbindung bindet an einem Standort, der sich aus der Orthosteric-Website, aber die Anwesenheit des Moleküls unterscheidet der Energiebarriere zwischen den aktiven und anderen Staaten. Positive allosterische Modulatoren (PAMs) sind Verbindungen, die der Energiebarriere zu reduzieren, von der Ruhe in den aktiven Zustand und daher verstärken die Wirkung des Agonisten. Um mögliche Auswirkungen von PAM zu charakterisieren, ist es daher notwendig, um festzustellen, wenn eine Exposition gegenüber der Verbindung die Antwort auf Agonisten verbessert und, wenn ja, in welcher Konzentration. Die Experimente, dargestellt in Abbildung 11 und Abbildung 14 veranschaulichen Protokolle, die für die Charakterisierung von PAMs an den GABA-A -Rezeptoren erfolgreich eingesetzt werden können.
In einigen Fällen möglicherweise Exposition gegenüber der PAM allein ausreicht, um die Rezeptoren aktivieren. Diese Aktivität kann durch eine leichte Modifikation des hier vorgestellten experimentellen Protokolls ermittelt werden. Nämlich, kann statt mit einer Co-Anwendung des Modulators während der Exposition gegenüber der GABA, das Protokoll für die Anwendung der ersten Verbindung allein und dann im Beisein der GABA geändert werden. Eine Charakterisierung der direkten Agonist Tätigkeit wird durch die Bestimmung der Amplitude der Reaktion hervorgerufen durch die Verbindung selbst und im Vergleich zu den GABA-evozierten Strom erfolgen.
Experimente in Hirnschnitten, wie in Abbildung 7dargestellt werden verwendet, um die zusammengesetzte Aktivität auf native Rezeptoren in einem bestimmten hemmenden Kreislauf zu bestätigen, bevor wir weitermachen, in Tiermodellen und den Weg in Richtung klinischer Studien. Das relativ einfache Daten Erfassung und Analyse-Protokoll ermöglicht das Ranking von mehreren Verbindungen durch die Auswertung ihrer differentiellen modulierende Wirkung auf PS-Amplitude. Unspezifische Effekte von Verbindungen, die nicht auf das GABA-System beziehen kann auch erkannt (z. B., wenn Änderungen in der PS-Form eingehalten werden). Direkte, kann Gabaergen Neurotransmission in diesen Fällen beurteilt werden durch die Messung der Auswirkungen der Verbindungen auf die inhibitorischen postsynaptischen Ströme (IPSCs) über die ganze Zelle Patch Clamp Technik8.

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für die Entdeckung von aktiven Verbindungen am GABA-A -Rezeptoren von der Bindung an die Physiologie und Pharmakologie. Bei der Suche nach neuartigen Molekülen spezifisch für GABA-A -Rezeptoren, ist es wichtig, zu definieren, so genau wie möglich, den Untertyp des Interesses und der Bewertung der Besonderheit der neu identifizierten Verbindungen (z. B.für einen Beitrag sehen, Rudolph und Knoflach1oder Sieghart2). Ein typischer Pfad in der Wirkstoffforschung und die Schritte, die erreicht werden müssen sind in Abbildung 1dargestellt.
Bindung-Assays wurden und werden noch weitgehend als der erste Schritt in der Drogeentdeckung verwendet. Im Falle von GABA-A -Rezeptoren sind sie optimiert, um Verbindungen zu identifizieren, die an der Benzodiazepin-Bindungsstelle des Rezeptors binden wo therapeutisch nützlich und sicher Medikamente binden. Andere Techniken, mit fluorometrisch bildgebenden Platte Leser (FLIPR) Membran potenziellen roten Farbstoff basierende Assays3, erkennen Verbindungen wie Barbiturate, die Bindung an weitere Standorte, die aufgrund ihrer unerwünschten Nebenwirkung Profil weniger wünschenswert sind. Darüber hinaus können die eingesetzten Farbstoffe GABA-A -Rezeptoren, so Fragen die Nützlichkeit dieser Assays für Drug Discovery4direkt aktivieren. Verbindliche Tests können nur die Beweise, die eine bestimmte Verbindung an einen spezifischen Rezeptor Klassebinden kann. In-vitro- Assays mit Zellmembranen dienen zur selektiven menschlichen GABA-A α5β3γ2-Rezeptor Liganden zu identifizieren. Transient transfizierte HEK293 Zellen mit dem Ausdruck der menschlichen GABA-A -α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 und α3β3γ2-Rezeptoren werden verwendet, um Membranen auf diese Tests vorbereiten. Die Wirkung der Liganden wird erkannt, indem Sie messen das Funkeln von [3H] Flumazenil an die Membranrezeptoren (Hemmung der [3H] Flumazenil Bindung) gebunden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass eine rasche und effiziente Bestimmung der Verbindung-Bindungsaffinität an den Rezeptor des Interesses an den Rezeptor von Interesse finden.
Funktionelle Studien sind notwendig, um die funktionelle Aktivität der Verbindungen zu bewerten und zu eine physiologischen und pharmakologische Erklärung der Mechanismen, die durch die Bindung der Verbindungen an den Rezeptoren verursacht vorschlagen. Es ist heute anerkannt, dass funktionelleA GABA-Rezeptoren von der Baugruppe aus fünf Untereinheiten um eine Achse des Pseudosymmetry von den Ionischen Pore und ergeben sich aus der Versammlung der fünf identischen Untereinheiten gebildet führen. Die meisten der GABA-A -Rezeptoren bestehen aus zwei oder mehr verschiedenen Untereinheiten. Der großen Gehirns GABA-A -Rezeptor, zum Beispiel besteht der α1, β2 und γ2 Untereinheiten in einer Stöchiometrie von 2, 2 und 1 bzw.5,6. Eine Wiederherstellung auf einem Host wie Xenopus Eizellen oder HEK293 Zellen bietet die Möglichkeit, schnell die pharmakologischen Eigenschaften der Rezeptoren zu erkunden.
Die pharmakologischen Eigenschaften der Verbindungen werden dann mit extrazellulären Aufnahmen im Gehirn Scheiben7untersucht. Diese Methode ermöglicht eine Auseinandersetzung mit der Wirkung der Verbindungen auf Neurotransmission und bietet eine effektive Möglichkeit, die funktionellen Auswirkungen der Verbindungen im heterologen Expressionssysteme auf der Ebene der native Rezeptoren in der Gesamtwertung bestimmt bestätigen neuronale Umfeld. Gabaerge Neurotransmission kann auch auf molekularer Ebene beurteilt werden, durch die Messung der Auswirkungen der Verbindungen auf die inhibitorischen postsynaptischen Ströme (IPSCs)8. Aber das Protokoll hier verwendet und anhand der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahmen in Gehirnscheiben ist aufwendiger und ergibt einen geringeren Durchsatz.
Abschließend werden die Stärken und Schwächen des in-vitro- screening-Kaskade, die zur Identifizierung des α5β3γ2-selektive Liganden im Hinblick auf die verschiedenen Techniken und ihre immanente Grenzen diskutiert. Diese Arbeit soll, Experten und Laien auf dem Gebiet der GABA-A -Rezeptoren eine hilfreiche Überprüfung der Kombination der verschiedenen in-vitro- Methoden verwendet, um die Entdeckung der neuen Modulatoren dieser Liganden-gated Ion-Kanäle zu bekämpfen.

<table><tbody><tr><td>Allgemeine Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well Cell Harvester -(Filtermate 196)&nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>Zur Filtration von Membranen mit gebundenem Radioliganden</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Flüssigszintillationszähler (Top Count NXT)</td><td>Packard</td><td></td><td>Mikrotiterplatten-Szintillations- und Lumineszenzzähler</td></tr><tr><td>Fläschchen Flüssigszintillationszähler (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Packard</td><td></td><td>Fläschchen-Szintillations- und Lumineszenzzähler</td></tr><tr><td>Flüssigflüssiger Handler (Biomek 2000)</td><td>Beckman-Schar</td><td></td><td>Zur Herstellung von Verbindungsverdünnungen</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>Zum Mischen von zusammengesetzten Stammlösungen</td></tr><tr><td>Gewebehomogenisator (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>Zur Resuspendierung der Membranpräparationen</td></tr><tr><td>XLfit5 Software</td><td>Microsoft Excel &nbsp; Add-on von IDBS</td><td></td><td>Curve Fitting Software</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td></td> UniPix-Elektrodenzieher <td></td><td></td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>Mehrkanalsysteme-Automatisierte</td><td></td> <td>Injektion (Xenopus-Oozyten)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>Mehrkanalsysteme-Automatisierte</td><td></td> <td>Spannungsklemme (Xenopus Eizellen)</td></tr><tr><td>DataMining</td><td>Mehrkanalsysteme-Daten</td><td></td><td> Analysesoftware</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel</td><td></td> <td>Systems-Datenverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Rauscharmes Datenerfassungssystem</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 oder gleichwertig</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programmierbarer Signalaufbereiter</td></tr><tr><td>pClamp Programmsuite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software für die Datenerfassung und -analyse Software</td></tr><tr><td>Antivibrationstabelle&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>Zur Vermeidung von Mikroelektrodenvibrationen&nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Mikromanipulatoren</td><td>Scientifica</td><td></td><td>Zur genauen Positionierung von Mikroelektroden in Gehirnschnitten</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Zur Isolierung von Aufnahmen von Geräuschen</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD</td><td></td><td>Zur Vorbereitung von Hirnschnitten</td></tr><tr><td>Mikropipetten aus Borosilikatglas&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>Zur Aufzeichnung extrazellulärer Potentiale in Hirnschnitten</td></tr><tr><td>Twisted Pair, Platin-Iridiumdrähte Stimulationselektrode</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Zur Stimulation der Gehirnschnitte mit Strom</td></tr><tr><td>Stimulusgenerator für strom- und spannungsgesteuerte Stimulation</td><td>MultiChannel Systems</td><td>STG4000</td><td>Liefert den Strom an die Stimulationselektrode</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte mit rundem</td><td>Boden Corning</td><td>#3365</td><td>Wird für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>GF/C Glasfaserfilter-Boden 96-Well-Mikroplatte mit 1,2 & Mikrotiterplatten verwendet; M PoreSize, für Zellernte-Assays mit einem Vakuum-Verteilerfilter&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6005174</td><td>für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>verwendet 50 mL Röhrchen</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>#352070</td><td>für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Safe-lock Röhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>verwendet Safe-lock Röhrchen 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Versandröhrchen 180 mL&nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&nbsp;</td><td>#3722</td><td>verwendet für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Pony Fläschchen Polyethylen 6 mL&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Top Seal&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#60051859</td><td>für den Bindungsassay verwendet</td></tr><tr><td>Spinnerkolben</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Spinnerkolben</td></tr><tr><td>96&nbsp; Vertiefungsplatte (konisch)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Injektionsplatte für die Eizellen</td></tr><tr><td>96&nbsp; Well Plate (flacher Boden)</td><td>Corning (Vitaris Schweiz)</td><td>3364-cor</td><td>Compound Plate für die HiClamp</td></tr><tr><td>Glass Kapillare&nbsp;</td><td>Hilgenberg (Deutschland)</td><td>-</td><td>Borosilikatglas 1,2 O.D. 0,76 I.D. mit</td></tr> <tr><td>FilamentRNA-Präparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>für die in vitro Synthese</td></tr><tr><td>Chemikalien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay-Puffer: KCl 5 mM; CaCl2 1,25 mM; MgCl2 1,25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH-Wert mit HCl auf 7,4 einstellen; Bis zu 3 Monate bei 4 °C lagern.</td><td></td><td></td><td>Wird für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>verwendet Waschpuffer: Tris 50 mM -HCl pH 7,4; bei 4 & °C lagern.</td><td></td><td></td><td>Zur Verwendung für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Stammlösung von Testverbindungen 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Zur Verwendung für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Zur Verwendung für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Zur Verwendung für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; Lagerung bei -20 & Grad; C</td><td></td><td></td><td>Wird für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp;</td> verwendet<td>Packard&nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Wird für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>Ultima Gold verwendet&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Wird für den Bindungsassay</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>Antibiotika / Antimykotika</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Kollagenase Typ I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250</td><td>mL RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Salze für künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (NaCl, KCl, etc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefrorene Membranpräparate aus transienten oder stabil transfizierten HEK293-Rezeptor-Subtypen überexprimieren verschiedene humane GABAA-Rezeptor-Subtypen: &alpha; 1&Beta; 3&Gamma; 2, &alpha; 2&Beta; 3&Gamma; 2, &alpha; 3&Beta; 3&Gamma; 2, &alpha; 5&Beta; 3&gamma;2. Siehe Ballard et al. 2009 für detaillierte Methoden.</td><td></td><td></td><td>Wird für Bindungsassays verwendet</td></tr></tbody></table>

methoden für die entdeckung der neuartige substanzen modulieren einen gamma - aminobuttersäure-rezeptor geben eine neurotransmission

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Dieses Manuskript stellt eine schrittweise Protokoll für das Screening bei Gamma-Aminobuttersäure Verbindungen Säure geben eine Rezeptoren (GABA-A) und deren Verwendung zur Identifizierung der neuartige Moleküle aktiv in präklinischen Tests aus einer in-vitro- rekombinante Rezeptor auf ihre pharmakologischen Wirkungen auf native Rezeptoren im Nagetier Gehirnscheiben. Für Verbindungen, die Bindung an die Benzodiazepin-Standort des Rezeptors ist der erste Schritt zu einem primären Bildschirm einrichten, die darin besteht, entwickeln Radioligand Bindung Assays auf Zellmembranen mit dem Ausdruck der großen GABA-A -Subtypen. Dann unter Ausnutzung der heterologen Expression Nagetier und menschlichen GABA-A -Rezeptoren im Xenopus Eizellen oder HEK-293-Zellen, ist es möglich zu erkunden, in elektrophysiologische Tests, die physiologischen Eigenschaften der verschiedenen Rezeptor Subtypen und die pharmakologischen Eigenschaften der identifizierten Verbindungen. Das Xenopus Eizelle System präsentiert hier, beginnend mit der Isolierung von der Eizellen und die Mikroinjektion mit verschiedenen mRNAs, bis die pharmakologische Charakterisierung mittels zwei-Elektroden-Spannung Klemmen. Zu guter Letzt werden Aufnahmen im Nagetier Gehirnscheiben durchgeführt beschrieben, die als sekundäre physiologischen Test verwendet werden, um die Aktivität der Moleküle auf ihre native Rezeptoren in einem genau definierten neuronale Schaltkreis zu beurteilen. Extrazelluläre Aufnahmen mit Bevölkerung Antworten von mehreren Neuronen werden zusammen mit dem Zulassungsantrag demonstriert.

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Verbindungen zu GABA-A -Rezeptoren von der Bindung an die Physiologie und Pharmakologie aktiv zu entdecken.

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, eine Screening-Kaskade zu veranschaulichen, die die Entdeckung neuartiger GABA-A-Rezeptor-Liganden ermöglicht. Der Vorteil der Verwendung von Radioligandenbindung, elektrophysiologischer Aufzeichnung in Xenopus-Eizellen und in Hirnschnitten von Nagetieren in literativer Weise besteht darin, dass das Profil der Verbindung verbessert werden kann. Letztendlich werden potente Subtypen, selektive und wirksame Verbindungen identifiziert.Diese Vorführung wird von Kumico Kambara und Jenna Tognaccini sowie Sonia und Daniel Bertrand von HiQScreen und Marie Claire Pflimlin von Roche durchgeführt. 10 bis 50 Nanoliter der plasmidhaltigen Lösung werden mit einer Mikroinjektionsnadel aus Glas mit einem Spitzendurchmesser von bis zu 100 Mikrometern injiziert, die auf einem Mikromanipulator montiert ist, der mit einem Druckauswerfersystem oder einem automatisierten Injektionssystem ausgestattet ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, halten Sie die Eizellen bei 17 Grad Celsius, um die Expression von Hitzeschockproteinen zu verhindern.Lagern Sie die Mikroplatte in einem thermisch kontrollierten Lagerbereich. Dann lösen Sie die Testverbindungen, die im Bindungsassay in OR2 positiv getestet wurden, bei 0,1 und 1000 Mikromolar für elektrophysiologische Aufzeichnungen auf und entsorgen Sie sie in einer 96-Well-Polypropylenplatte mit flachem Boden. Um eine Aufzeichnung mit zwei Elektroden-Spannungsklemmen durchzuführen, legen Sie eine Platte mit den Eizellen auf das automatisierte System.Programmieren Sie das automatisierte Aufzeichnungssystem über die symbolbasierte Schnittstelle mit diesem Schema für die geeignete Bestimmung der Konzentrations-Wirkungs-Beziehung. Für die Kurvenanpassung wird die Stromamplitude anhand der dargestellten Konzentrationsaktivierungskurve als Funktion des Logarithmus der Agonistenkonzentration dargestellt. Für die elektrophysiologische Aufzeichnung halten Sie das Gehirn in einer dACSF-Lösung, die mit Carbogen bei Raumtemperatur blasig ist.Präparieren Sie dann die linke Hippocampus-Formation mit einem feinen Spatel. Anschließend werden Querschieber mit einer Dicke von 400 Mikrometern aus dem medianen Teil des Hippocampus mit einem Gewebehacker geschnitten. Übertragen Sie die Scheiben mit einem Malpinsel in die Aufnahmekammer und halten Sie sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur.Anschließend perfundierten Sie die Scheiben mit rACSF, das mit Carbogen bei 35 Grad Celsius und einer Geschwindigkeit von 1,5 Millilitern pro Minute blasiert wurde. Um einen einzelnen Populations-Spike aufzuzeichnen, platzieren Sie eine Gehirnscheibe in der am Mikroskop montierten Kammer. Perfundierten Sie die Scheibe mit rACSF mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute.Ziehen Sie mit dem Pipettenabzieher an einer Mikropipette aus Borosilikatglas mit einem Widerstand von etwa zwei Megaohm. Füllen Sie die Mikropipette mit einer Lösung, die zwei molare Natriumchloride enthält, und geben Sie sie in den Pipettenhalter. Positionieren Sie die Aufzeichnungsmikropipette mit dem rechten Mikromanipulator im Stratum pyramidale in der CA1-Region des Hippocampus-Schnitts.Setzen Sie anschließend eine isolierte bipolare Platin-Iridium-Elektrode in die Halterung am linken Mikromanipulator ein. Positionieren Sie die Stimulationselektrode mit dem linken Mikromanipulator in den Schaffer-Kollateralen im CA1-Bereich des Hippocampus-Schnitts. Geben Sie mit dem Stimulusgenerator alle 30 Sekunden einen Stromimpuls an die Stimulationselektrode ab und erhöhen Sie die Stimulationsstärke allmählich, bis eine Populationsspitze auftritt.Passen Sie die Stimulusstärke an, um eine Populationsspitze hervorzurufen, die 45 % der maximal erreichbaren Amplitude entspricht. Um eine gepaarte Impulshemmung durchzuführen, geben Sie alle 30 Sekunden mit dem Stimulusgenerator zwei Stromimpulse an die Stimulationselektrode ab. Stellen Sie die Stimulusstärke so ein, dass eine Populationsspitze hervorgerufen wird, die 45 % der maximalen Amplitude entspricht.Um die Verbindungen zu testen, verdünnen Sie die zu prüfenden Verbindungen in ACSF so, dass die Endkonzentration von DMSO nicht höher als 0,1 % ist. Geben Sie DMSO in der gleichen Konzentration wie in der Verbindungslösung in die Kontrolllösung. Zeichnen Sie mindestens 30 Minuten lang alle 30 Sekunden einen einzelnen oder einen gepaarten Anstieg der Pulspopulation auf, der durch Schaffer-Kollateralstimulationen hervorgerufen wird. Die Spike-Form der Population sollte während dieses Basiszeitraums stabil sein.Bereiten Sie als Nächstes ein Becherglas mit karbogeniertem rACSF vor, das eine feste Konzentration der zu testenden Verbindung enthält, und perfundieren Sie die Hippocampusscheibe mit der Lösung während der Aufzeichnung von einzelnen oder gepaarten Pulspopulationsspitzen. Bewerten Sie außerdem die Wiederherstellung nach dem Compound-Effekt, indem Sie die Scheibe mit carbogenated rACSF ohne die Verbindung perfundieren. Hier ist eine schematische Darstellung einer Hippocampusscheibe der Ratte zu sehen, wobei die Schaffer-Kollateralen, die von den CA3-Pyramidenzellaxonen stammen, auf die dendritische Arborisation der CA1-Pyramidenneuronen projizieren.Mikropipetten wurden im Stratum pyramidale platziert, um Populationsspitzen aufzuzeichnen, und im Stratum radiatum für dendritische Aufzeichnungen von exzitatorischen postsynaptischen Feldpotentialen. Die Stimulationselektrode wurde in den Schaffer-Kollateralen platziert. Diese Abbildung zeigt Populationsspitzen, die durch die gepaarten Stimuli hervorgerufen werden, die über dieselbe Stimulationselektrode in einem Intervall von 20 Millisekunden angewendet werden.Die Reaktion der Population auf den zweiten Stimulus ist von kleinerer Amplitude als die Reaktion auf den ersten Stimulus. Populationsspitzen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von beta CCM, einem nicht-selektiven GABA-A-Rezeptor NAM, aufgezeichnet. Beta CCM erhöhte die Amplitude des zweiten Populationsspikes, indem es jede gabaerge Hemmung nach vorne teilweise blockierte.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Pharmakokinetik, die Rezeptorbelegung und -wirksamkeit in vivo und die Sicherheitspharmakologie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie das Potenzial für die klinische Entwicklung der identifizierten Wirkstoffe zu beantworten.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.

Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

Die molekularen Mechanismen, die während der Ontogenese koordinieren die Bildung von inhibitorischen GABAergen Synapsen sind weitgehend unbekannt. Um diese Prozesse zu untersuchen, haben wir eine Co-Kultur-Modellsystem, das embryonale mittelgroßen Projektions GABAergen Neuronen zusammen mit stabil transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK293-Zellen) exprimieren funktionellen GABA-A-Rezeptoren enthält, kultiviert entwickelt.

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA A Receptors

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

Die Methode der Autoradiographie wird routinemäßig zur Bindung von Radioligands an Gewebeschnitten zur Bestimmung der qualitativen oder quantitativen Pharmakologie zu studieren.

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.

Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung

Diese Methode führt eine einfache Technik zum Nachweis der endogenen Monoaminfreisetzung unter Verwendung akuter Hirnschnitte ein. Das Setup verwendet eine 48-Well-Platte, die einen Gewebehalter für die Monoaminfreisetzung enthält. Freigesetztes Monoamin wird mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Darüber hinaus bietet diese Technik eine Screening-Methode für die Arzneimittelentdeckung.

Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Das Protokoll beschreibt die Herstellung von CMAC-Säulen (Cell Membrane Affinity Chromatography) mit immobilisierten Zellmembranfragmenten, die funktionelle Transmembran-Tropomyosin-Kinase-Rezeptor-B-Proteine enthalten. Die Verwendung von CMAC-Säulen bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit diesen Rezeptoren interagieren und in komplexen natürlichen Mischungen vorhanden sind, wird ebenfalls erläutert.

Zellmembranaffinitätschromatographiesäulen zur Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit dem immobilisierten Tropomyosinkinase-Rezeptor B interagieren

Das Protokoll zeigt, dass es durch die Durchführung einer Mikrotransplantation synaptischer Membranen in Xenopus laevis-Eizellen möglich ist, konsistente und zuverlässige Reaktionen von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure- und γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren aufzuzeichnen.

Mikrotransplantation synaptischer Membranen zur Reaktivierung humaner synaptischer Rezeptoren für funktionelle Studien

Der BS3 Chemical Crosslinking Assay zeigt eine reduzierte Expression desGABA-A-Rezeptors auf der Zelloberfläche im Gehirn von Mäusen unter chronischen psychosozialen Stressbedingungen.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Bewertung der Wirkung von chronischem Stress auf die Präsentation desGABA-A-Rezeptors auf der Zelloberfläche im Gehirn von Nagetieren

Hier beschreiben wir ein Hefesystem, das die humane γ-Sekretase rekonstituiert. Dieses System ermöglicht die Identifizierung und Untersuchung von Mutationen, die die Aktivität beeinflussen, sowie das Screening von γ-Sekretase-Inhibitoren (GSIs). Unter Ausnutzung des Verlusts der Funktionseigenschaften familiärer Alzheimer-Mutanten ist es möglich, nach γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) zu suchen.

Saccharomyces cerevisiae Modelle der Alzheimer-Krankheit zum Screening von Genen, Mutationen und Chemikalien, die die Amyloid-Beta-Produktion durch γ-Sekretase beeinflussen

Erfahren Sie eine Screening-Kaskade zur Entdeckung neuer GABA-A-Rezeptor-Liganden mit Radioligandenbindung und elektrophysiologischen Aufzeichnungen in Xenopus-Oozyten und Nagiergehirnschnitten.

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission (Video) | JoVE Journal

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

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