Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten: Antigenimmunisierung, induzierte abhängige und unabhängige Antikörperantworten sowie B-Zell-Aktivierung und Keimzentrumsreaktionen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zuverlässige und quantitative Messungen der Ig-Isotyp-Reaktion mit einem direkten Vergleich der B-Zell-Aktivierung und der humoralen Immunität bei Mäusen ermöglicht. Für die TNP-Polysaccharid-Immunisierung laden Sie eine Milliliter-Insulinspritze pro Maus mit 100 Mikrolitern frisch zubereiteter Antigenlösung und führen Sie die Nadel in einem Winkel von etwa 30 Grad in den unteren rechten Quadranten jedes Tieres ein, um eine Injektion in die unteren Organe zu vermeiden.

Wenn alle Mäuse injiziert wurden, bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück, wo sie in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung untergebracht werden. Zu den entsprechenden Versuchszeitpunkten werden von jedem immunisierten Tier 150 bis 200 Mikroliter Blut durch retroorbitale Blutungen entnommen und die Proben ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die geronnenen Blutproben und überführen das klare Serum von der Oberseite jedes Blutgerinnsels in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Nach einer zweiten Zentrifugation, um alle verbleibenden Blutgerinnsel zu entfernen, werden 50 Mikroliter Serum in einzelne sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius überführt. Vor dem Plattieren werden einzelne 96-Well-Immunplatten mit der entsprechenden Konzentration von Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Einfangantikörpern für den Gesamtserum-Ig-Isotyp TNP-38BSA-Antigen für den TNP-spezifischen Ig-Isotyp oder TNP-3BSA-Antigen für den hochaffinen TNP-spezifischen Ig-Isotyp beschichtet und die beschichteten Platten über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Morgen waschen Sie die Platten zweimal mit 200 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung.

Entsorgen Sie den Waschpuffer und tupfen Sie die Platten nach jedem Waschgang auf einem Stapel Papiertücher trocken. Als nächstes blockieren Sie die Platten mit 200 Mikrolitern Blockierungspuffer pro Vertiefung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Während die Platten blockiert werden, bereiten Sie die entsprechenden Standard- und Serumverdünnungen sowie Blockierungspuffer in einer separaten, unbehandelten 96-Well-Platte mit 150 Mikrolitern pro Vertiefung vor, wie angegeben.

Waschen Sie dann die ELISA-Platte wie gezeigt mit Waschpuffer und geben Sie 100 Mikroliter jeder verdünnten Ig-Isotyp-Standard- und Serumprobe in die entsprechenden Vertiefungen der ELISA-Platte. Nach einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius waschen Sie die Platten wie gezeigt und fügen Sie 100 Mikroliter eines geeigneten alkalischen Phosphatase-konjugierten isotypspezifischen Antikörpers, verdünnt in Blockierungspuffer, in jede Vertiefung für eine ein- bis zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Waschen Sie am Ende der Inkubation die Platten und geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete Substratlösung in jede Vertiefung

Überwachung der Entwicklung der Reaktion in den nächsten Minuten bei Raumtemperatur. Wenn die Reaktion robust genug ist, um sie zu analysieren, legen Sie die Platte in einen Mikroplatten-Reader und klicken Sie auf Einstellungen, um die Wellenlänge auf 405 Nanometer einzustellen. Klicken Sie auf OK und dann auf Vorlage, um die entsprechenden leeren, standardmäßigen und unbekannten Wells entsprechend der eingerichteten 96-Well-Platte zuzuweisen.

Wenn der am stärksten konzentrierte Standard eine optische Dichte von etwa eins, 1,5, zwei und 2,5 erreicht, klicken Sie auf Lesen, um die Platte zu lesen und die resultierende Datendatei nach jeder Analyse zu speichern. In Ermangelung einer Immunisierung wird ein Anstieg der basalen Serumspiegel von IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgA bei B-Zell-spezifischen TNF-Rezeptor-assoziierten Faktor 3 oder B-TRAF3-Knockout-Mäusen beobachtet, verglichen mit geschlechts- und altersgleichen B-TRAF3-Kontrolltieren, die ausreichend Wurfgebinder hatten. Sieben Tage nach der Immunisierung mit TNP-Polysaccharid oder TNP-KLH zeigt, wie gerade gezeigt, die Analyse der thymusunabhängigen Ig-Isotyp-Antworten auf die Immunisierung signifikant höhere Thymus-unabhängige TNP-spezifische IgG3-Spiegel sowie erhöhte thymusabhängige TNP-spezifische IgG2b-Spiegel bei myeloischen zellspezifischen TRAF3-Knockout-Mäusen im Vergleich zu Wurfgeschwisterkontrollen.

Darüber hinaus deutet die Auswertung der Thymus-abhängigen Primär- und Gedächtnisreaktionen von Mäusen auf die TNP-KLH-Immunisierung auf das Vorhandensein von teilweise verminderten Thymus-abhängigen IgM-Primärantworten und defekten IgG1-Primär- und Gedächtnisantworten bei T-Zell-spezifischen TRAF3-Knockout-Mäusen hin. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass ELISA Nachweisgrenzen haben, die normalerweise durch den linearen Bereich der Standardkurven definiert werden, und daher möglicherweise mehrere Verdünnungen Ihrer Probe erforderlich sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere komplementäre Methoden wie die Durchflusszytometrie oder der L-Spot durchgeführt werden, um ein umfassendes Verständnis der Antikörperreaktionen in einer bestimmten Versuchsumgebung zu erlangen.