Name: Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Lernen Sie die Probenpräparation von Drosophila-Larven für GC-MS-basierte Metabolomik. Diese Methode ermöglicht die direkte Messung von über 100 Metaboliten mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit.

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Vielen Dank an die Indiana University Masse Spektroskopie Anlage und der University of Utah Metabolomik Core Facility für die Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls. J.M.T. wird durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Preis Anzahl R35GM119557 unterstützt.

1. die Eizellentnahme
<ol><li>Ausgewachsene Männchen und jungfräulichen Weibchen der gewünschten Genotypen zu sammeln. Individuell Alter dieser Tiere in einer Lebensmittel Durchstechflasche mit Bloomington Standardmedien für 3 – 5 Tage.</li>
	<li>Die entsprechenden Paarungen durch die Übertragung von 50 jungfräulichen Frauen und 25 Männer zu einem neuen Lebensmittel-Fläschchen eingerichtet. Hinweis: Ein Minimum von sechs unabhängigen Verpaarungen sollten für jeden Genotyp eingerichtet werden. Nur eine Probe wird aus jeder Verpaarung (d. h. sechs Proben von sechs unabhängigen Paarungen) gesammelt werden.</li>
	<li>
Bereiten Sie Melasse eierlegende Kappen.
	<ol>
<li>Mischen Sie 115 mL Melasse und 29 g Agar mit 700 mL H2O in eine 2 L Flasche.</li>
		<li>Kochen Sie die Melasse Agar Mischung auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Auf 70 ° c abkühlen lassen</li>
		<li>Fügen Sie 25 mL saure Mischung (20 mL 85 % Phosphorsäure und Propionsäure 209 mL in 1 L H2O; Store in einer braunen Flasche) und 10 mL 10 % p-hydroxy-Benzoesäure Acid Methylester in 95 % igem Ethanol.</li>
		<li>Gießen Sie die Melasse-Agar in Deckel und Boden Teil einer 35 x 10 mm2 Gewebekultur Schüssel. Hinweis: Vor dem Gießen Melasse Agarplatten, sicher sein, dass die Deckel und/oder Basis der 35 x 10 mm2 Platte Snuggly in den Mund einer Drosophila Lager Flasche passen (im Schritt 1.6 beschrieben). Je nach Marke von Platten verwendet könnte die Basis nicht verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frischen Hefe einfügen durch Zugabe von destilliertem Wasser zu aktivieren Trockenhefe (5 g Hefe/7 mL Wasser) bis die Mischung wird eine Paste, die auf einer festen Oberfläche (d. h., die Konsistenz der Erdnussbutter) leicht verbreitet werden kann.</li>
	<li>Ca. 1,5 g Hefe Paste auf der Oberfläche einer Melasse eierlegende Kappe zu verbreiten.</li>
	<li>Stecken Sie vier Luftlöcher in gegenüberliegenden Seiten aus einem Kunststoff 6 Unzen Drosophila Lager Flasche mit einer 22 G Nadel.</li>
	<li>Übertragen Sie die neu verknüpften fliegen aus der Lebensmittel Durchstechflasche in Kultur Flaschen. Hinweis: Fliegen können übertragen werden, indem Sie entweder mit CO2 als eine vorübergehende Betäubung oder von der Spitze der Ampulle in die Mündung der Flasche halten und scharf Tippen auf den Boden der Flasche gegen eine Benchtop.</li>
	<li>Setzen Sie schnell eine Melasse eierlegende Kappe mit Hefe-Paste auf der Oberfläche in den Mund einer Drosophila Lager Flasche. Verwenden Sie Labor Band um eierlegende GAP im Ort zu sichern. Hinweis: Wenn fliegen narkotisierten vor der Übertragung waren, sollte die Flasche horizontal der Benchtop auferlegt werden bis alle fliegen erholt haben. Einmal fliegen völlig mobil sind, stellen Sie die Flasche in einem Inkubator mit der Melasse eierlegende Kappe an der Unterseite der Kultur.</li>
	<li>Die Verschlusskappe Melasse eierlegende mindestens einmal täglich für die ersten beiden Tage durch Umkehrung der Lager Flasche, durch Tippen auf den Boden der Flasche gegen die Benchtop entfernen die alte Ei-Kappe und sofort eine neue Ei-Kappe in die Mündung der Flasche platzieren. Entsorgen Sie die alte eierlegende Kappe. Hinweis: Diese Schritt wird sichergestellt, dass die Weibchen ihre Eier nicht halten und ermöglicht die Sammlung von synchronisierten Populationen.</li>
	<li>Legen Sie eine neue eierlegende Kappe in die Lager Flasche nach Tag 3, ersetzen nach 2 h, und verwerfen. Entfernen Sie und ersetzen Sie die zweite Eiablage GAP nach vier Stunden. Beschriften Sie diese eierlegende Kappe mit Datum, Uhrzeit und Genotyp. Hinweis: Die Eier gesammelt während dieser 4 h-Fenster werden für die Analyse verwendet werden. Diese Synchronisierung Schritt ist wichtig für die Analyse von bestimmter Entwicklungsstadien. Eier können auf diese Weise für mehrere Tage gesammelt werden.</li>
	<li>Legen Sie die eierlegende Kappen in ein 60 x 15 mm2 Petri und Ort in einem Inkubator auf die gewünschte Temperatur und Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Überprüfen Sie die eierlegende Kappen jeden Tag Probleme mit Hunger, Bevölkerungsdichte oder Kontamination. Hinweis: Die Larven müssen Zugang zu ausreichender Ernährung, kontinuierliche Entwicklung zu gewährleisten. Falls erforderlich, kann frische Hefe einfügen auf eierlegende Großbuchstaben verteilt werden, die im Experiment verwendet werden. Außerdem, wenn die Larven Bevölkerungsdichte zu hoch ist, startet Larven aus der Kultur-Platte zu Wandern. Diese Proben sollten nicht für Metabolomic Analyse benutzt werden, weil die hohe Bevölkerungsdichte und Fortgeschrittene Anfälle von Hunger erlebt beim Wandern zu inkonsistenten Daten führen werden. Eine Dichte von ca. 80 – 100 mittlere zweiten Instar Larven (L2) pro Platte oder 40 – 50 mittlere dritte Instar Larven (L3) pro Platte wird empfohlen. Proben, die sichtlich mit Bakterien oder Pilzen kontaminiert sind, müssen entsorgt werden.</li>
</ol>2. Larven Musterkollektion
<ol><li>Alter Larven bis die gewünschte Stufe. Wenn L3 Larven sammeln, resynchronize Proben bei der Häutung L2-L3. Resynchronisation wird häufig durch eine zuvor beschriebenen Methode, die die vorderen Atemlöcher als eine Entwicklungsstörung Meilenstein15 nutzterreicht. Alternativ können Mitte L3-Larven mit ein sgs3 Reporter-gen16synchronisiert werden. Hinweis: In diesem Zusammenhang finden wir Mitte L2 Larven (~ 60 h nach der Eiablage) eignen sich ideal für die meisten Analysen, weil Larvalentwicklung zu diesem Zeitpunkt noch relativ synchron ist, sorgfältig gesammelte Proben haben angemessene Nahrung, diese Timepoint zu entwickeln und die Anzahl der Tiere pro Probe ist überschaubar (siehe unten). Ein zusätzliche Synchronisation Schritt ist erforderlich für L3-Larven, weil die zahlreichen Ecdyson Impulse, die während der L3 Entwicklung auftreten dramatische Auswirkungen auf den Stoffwechsel haben und Artefakte in nicht synchronisierten Populationen erzeugt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sezierenden Nadel um zu heben Sie vorsichtig die Hefe-Paste aus dem Agar. Legen Sie die Hefe auf eine neue Melasse-Agar-Kappe. Hinweis: Die meisten Larven fressen an der Schnittstelle zwischen der Melasse-Agar und die Hefe-Paste.</li>
	<li>Verwenden Sie einen kleinen Pinsel, um Larven von der abgebrochenen Oberfläche des Nährbodens Melasse zu sammeln. Legen Sie die Larven in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen auf Eis. Hinweis: Geeignete Stichprobengröße für jede Entwicklungsstufe sind wie folgt: zuerst instar 50 Larven (L1); 25 Mitte L2 Larven; 20 frühen L3-Larven; 15 Mitte L3 oder späten L3-Larven.</li>
	<li>Waschen Sie und frieren Sie Proben (Schritte 2,3 bis 2,8) in kleinen Chargen (vier bis sechs Proben ein) während einer großen Muster-Set zu sammeln. Proben müssen innerhalb von 20 min des Legens der Larven in Rohre eingefroren werden. Hinweis: Wir empfehlen Eppendorf 1,5 mL Flex Rohre verwenden, da andere Röhren Probentransfer bei Schritt 3 stören können. Proben müssen in Microfuge Röhren gesammelt werden. Sammeln Sie keine Proben in den Wulst Röhren im Schritt 3.1 beschrieben. Keramische Perlen behalten die NaCl Waschlösung, die führt zu ungenauen massenmessungen und Verunreinigungen in der Probe führt.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL eiskaltes 0,9 % NaCl in das Rohr, den Deckel schließen und vertikal spiegeln das Rohr gründlich um die Larven zu waschen.</li>
	<li>Setzen Sie den Schlauch wieder auf Eis für ~ 30 s. Während dieser Zeit Larven werden auf den Boden des Rohres sinken, aber Hefe bleibt in der Schwebe. Sobald alle Larven eine lose Pellets gebildet haben, entfernen Sie die NaCl-Lösung mit einer 1 mL-Pipette.</li>
	<li>2.4 und 2.5 Schritt zweimal wiederholen, oder bis der letzte Waschlösung ist klar. Hinweis: Zusätzliche waschen Schritte möglicherweise erforderlich, wenn die gesammelten Probe eine übermäßige Menge an Hefe enthält.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 × g für 1 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie alle verbleibenden Lösung mit einer Pipette 200 µL.</li>
	<li>Sofort frieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff ein. Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Proben können bis zu 3 Monate bei-80 ° c gelagert werden</li>
</ol>3. Übertragung der Proben auf Bead Tubes
<ol><li>Jede Larven Probe muss auf eine 2 mL-Schraubverschluss-Röhrchen mit 1,4 mm Keramik Perlen aus der 1,5 mL Microfuge Tube übertragen werden. Verwenden Sie in Vorbereitung auf diesen Transfer Schritt einen Ethanol-Beweis-Marker an die Seite einer 2 mL Schraubverschluss Wulst Röhre beschriften (Markierungen auf dem Deckel werden bei Schritt 4.4 zerstört).</li>
	<li>Tara die Masse der beschrifteten Bead Tube mit einer Analysenwaage genau messen 0,01 mg.</li>
	<li>Wenn Larven Proben bei-80 ° C gelagert wurden, legen Sie Probenröhrchen in flüssigem Stickstoff vor der Übertragung.</li>
	<li>Lange Pinzette verwenden, um das 1,5 mL Probenröhrchen von flüssigem Stickstoff entfernen Dewar.</li>
	<li>Nitrilhandschuhe, greifen die gefrorenen Rohr, umkehren und scharf Pfund den Schlauch Deckel gegen die Tischplatte, die gefrorene Kugel zu verdrängen. Sofort Gießen Sie das Pellet in eine vorher tarierten 2 mL Schraubverschluss Bead Tube. Wenn die Pellets nicht zu verdrängen, das Rohr zu flüssigem Stickstoff zurück und wiederholen. Hinweis: Larven Pellets werden nicht von allen Microfuge Röhren vertreiben. Wenn einen Schlauch als dem empfohlenen verwenden, festzustellen Sie, ob Larven Pellets vor dem Sammeln von Proben für die Analyse verdrängt werden können.</li>
	<li>Die kombinierte Masse der Larven Pellet und Bead Tube schnell zu messen. Legen Sie das Probenröhrchen sofort in flüssigem Stickstoff. Die Larven Pellet Masse wird verwendet, um die Metabolomic Daten zu normalisieren. Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Proben können bis zu 3 Monate bei-80 ° c gelagert werden</li>
</ol>4. Probe Extraktion
<ol><li>Legen Sie die Probenröhrchen in einem Benchtop-20 ° C kühler.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90 % Methanol mit 2 µg/mL Bernsteinsäure-d4 Säure in jedes Rohr. Zurück die Probe der Benchtop-20 ° C kühler. Hinweis: Die Bernsteinsäure-d4-Säure dient als interner Standard. Verwenden Sie nur HPLC Klasse H2O und Methanol. Da Methanol und anderen organischen Lösungsmitteln flüchtige und schwierig, genau zu messen, mit Luft Hubraum Pipetten sind, empfehlen wir Positive Verschiebung Pipetten für diesen Schritt und alle folgenden Schritte.</li>
	<li>Richten Sie eine Negativkontrolle durch Zugabe von 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90 % Methanol mit 2 µg/mL Bernsteinsäure-d4 Säure in eine leere Bead Tube.</li>
	<li>Homogenisieren von Proben für 30 Sekunden bei 6,45 m/s mit einer Wulst Mühle Homogenisator befindet sich in einem Kontrollraum 4 ° C Temperatur. Hinweis: Die Nichtbeachtung der Larven Pellet rasch und vollständig zu homogenisieren ist eine Sourceschaltung der Variabilität der Metabolomik Analyse. Verwenden Sie nur Homogenisatoren, die zerstören, gefrorene Larven Gewebe innerhalb von 30 s.</li>
	<li>Zurückkehren Sie die homogenisierte Proben-Röhrchen zu-20 ° C Benchtop Kühler und inkubieren sie in einem Gefrierschrank-20 ° C für mindestens 1 h.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre mit 20.000 × g oder maximale Geschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C um die daraus resultierenden Niederschlags zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie 600 µL des Überstands zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Stören Sie den Niederschlag nicht. Wenn das voreilige Pellet, beim pipettieren des Überstands verdrängt wird alle überstand in das Röhrchen zurück und wiederholen Sie Schritt 4.6.</li>
	<li>Legen Sie die Probenröhrchen in einer Vakuum-Zentrifuge. Achten Sie darauf, dass alle Röhren geöffnet sind, vor dem Versiegeln der Zentrifuge. Die Proben bei Raumtemperatur trocknen, bis alle Lösungsmittel entfernt ist (dieser Schritt dauert in der Regel ~ 16 h in Anspruch). Hinweis: Falls erforderlich, kann das Protokoll an dieser Stelle angehalten werden. Getrocknete Probe kann bei-80 ° c gelagert werden</li>
</ol>(5) chemische Derivatisierung
<ol><li>Wenn die getrockneten Proben bei-80 ° C gelagert wurden, ungeöffnete Probenröhrchen in einer Vakuum-Zentrifuge und für 30 min trocknen. Dieser Schritt muss ausgeführt werden, vor dem Öffnen des probenröhrchens. Hinweis: Diese Schritt entfernt das Kondenswasser, das an der Außenseite des Microfuge Rohres Entnahme aus der Tiefkühltruhe sammelt. Dieser Teil des Protokolls ist extrem empfindlich gegenüber H2O und zusätzliche Vorsichtsmaßnahme getroffen werden, um alle Reagenzien so trocken wie möglich zu halten.</li>
	<li>
Bereiten Sie eine Lösung von 40 mg/mL Methoxylamine Hydrochlorid (MOX) in wasserfreiem Pyridin. Verwenden Sie nur wasserfreies Pyridin. Speichern von MOX und Pyridin in den Exsikkator gestellt und bereiten Sie täglich die MOX-Lösung. Achtung: MOX und Pyridin sind giftig. Bereiten Sie diese Lösung in der Dunstabzugshaube.<ol>
<li>Verwenden einer Heißluftpistole eine 1 mL Spritze mit Glas zu trocknen.</li>
		<li>Stechen Sie die Nadel der Spritze in die Flasche von wasserfreiem Pyridin. 1 mL Pyridin zu entfernen und Hinzufügen einer Microfuge Röhre mit 40 mg von MOX.</li>
		<li>Spülen Sie die Flasche von wasserfreiem Pyridin mit Argon. Verschließen Sie die Flasche und in den Exsikkator zurück.</li>
		<li>Lösen Sie MOX in die Pyridin durch das Rohr in einem thermischen Mischer bei 35 ° C für 10 min bei 600 u/min Inkubation auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die getrocknete Probe 40 µL von 40 mg/mL MOX in wasserfreiem Pyridin Projektmappe hinzufügen.</li>
	<li>Wirbel für 10 s und kurz Zentrifuge (10.000 X g für 20 s).</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° C für 1 h bei 600 u/min in einem thermischen Mischer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g oder maximale Geschwindigkeit für 5 min um den Feinstaub zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie 25 µL des Überstands in einem Autosampler Fläschchen mit einem Glaseinsatz Microvolume 250 µL deaktiviert.</li>
	<li>Hinzufügen von 40 µL des N- Methyl -N- Trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) mit 1 % TMCS. Achtung: MSTFA ist giftig. Führen Sie diesen Schritt in der Dunstabzugshaube. Hinweis: Falls vorhanden, kann dieser Schritt durch eine Gerstel-Autosampler ausgeführt werden.</li>
	<li>Setzen Sie eine Kappe auf dem Autosampler Fläschchen und Dichtung mit einem Crimper Tool.</li>
	<li>1 Stunde mit schütteln (250 u/min) inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C.</li>
	<li>Fatty Acid Methyl Ester (Kamera) Standardlösung als zuvor Desceribed3vorbereiten. Der Autosampler Durchstechflasche mit einem Roboter Autosampler unmittelbar vor der Injektion fügen Sie 3 µL FAMES hinzu. Hinweis: FAMEs dienen zur Retention Time-Shift zu kalibrieren und prüfen die Geräteleistung. Wenn keine Roboter Autosampler verfügbar ist, können Berühmtheiten während Schritt 5.8 hinzugefügt werden.</li>
</ol>6. GC-MS-Detektion
Hinweis: In den meisten Fällen wird der Benutzer mit Hilfe einer Massenspektroskopie Core Facility diesen Schritt durchführen. Dieses Protokoll soll mit einem 30 m, GC-Säulen mit einer Vorsäule 5 m verwendet werden.
<ol><li>Zufällig die Probe bestellen.</li>
	<li>
Bereiten Sie das GC-MS.
	<ol>
<li>Die Helium-Träger-Gas-Durchfluss bis 1 mL/min eingestellt.</li>
		<li>Legen Sie die Vorlauftemperatur bis 250 ° C.</li>
		<li>Programmieren der GC der folgenden Temperaturgradient ausführen:<ol>
<li>Anfängliche Temperatur 95 ° c mit einen Einfluß von 1 min.</li>
			<li>Erhöhen Sie die Temperatur auf 110 ° C mit einer Rate von 40 ° C/min einen Halt von 2 min.</li>
			<li>Bis 5° C/min Rampe auf 250 ° C ansteigen.</li>
			<li>Bis 330 ° C mit einer Rate von 25 ° C/min einen letzten Halt von 4 min erhöhen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Solvent Verzögerung auf 3,5 min einstellen Hinweis: Die Zeit kann nach dem GC-MS-System geändert werden. Dieser Schritt soll MSTFA und MOX verhindern Beschädigungen des Detektors.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie 1 µL der derivatisierte Probe in das GC-MS (split-Verhältnis von 10:1). Hinweis: Spritzen Sie 2 µL der Probe, wenn die Intensität der Peaks zu niedrig ist. Die Injektion Reihenfolge der Proben sollte randomisiert werden.</li>
	<li>Das Massenspektrometer in full-Scan-Modus zu betreiben, über einen Massenbereich von 50 – 500 m/Z.</li>
</ol>7. die Datenanalyse
<ol><li>Metabolomic Datenanalyse verwenden entweder eine gezielte oder ungezielte Ansatz. Gezielte Analyse konzentriert sich auf die Messung der Fülle an einen definierten Satz von Metaboliten, wie z. B. die Laktat-Messungen, denen wir weiter unten beschreiben. Im Gegensatz dazu verwendet ungezielte Analyse eine unvoreingenommene Herangehensweise, um jede metabolische Funktion zu identifizieren, die zwischen den zwei Sample-Sets erheblich geändert wird. Hinweis: Unser Labor verwendet in erster Linie die kostenlose Programme MetAlign17 und MetaboAnalyst18,19 für die Datenanalyse. Da eine angemessene Beschreibung der Qualitätskontrolle, Normalisierung, sowohl die Datenverarbeitung Schritte gehen über den Rahmen dieser Handschrift, verweisen wir den Benutzer auf ausführlichere Protokolle, die Datenverarbeitung20,21gewidmet sind, 22. Darüber hinaus kann ein Flussdiagramm beschreibt die Schritte für diese Analyse an anderer Stelle8gefunden.</li>
</ol>

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<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+inference+of+biological+patterns%2C+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li>
<li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Metabolomik bietet eine einmalige Gelegenheit die Stoffwechselreaktionen vermessen, die intermediären Stoffwechsel zu komponieren. Die Empfindlichkeit dieser Technologie macht jedoch Daten anfällig für genetische Hintergrund, Entwicklungsstörungen Cues und eine Vielzahl von Umweltbelastungen, einschließlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Bevölkerungsdichte und nährstoffverfügbarkeit. Daher eine hohe Qualität und reproduzierbare Metabolomik Analyse erfordert, dass Proben unter sehr kontrollierten Bedingungen gesammelt werd...

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster ist entstanden, als ein ideales System für das Studium des molekularen Mechanismus, der intermediären Stoffwechsel regulieren. Nicht nur sind die meisten Stoffwechselwege konserviert zwischen Mensch und Drosophila , aber wichtigen Nährstoff Sensoren und Wachstumsregulatoren, wie Insulin, Tor und Myc, sind auch aktiv in die Fliege1,2. Drosophila ist dadurch lässt sich die metabolische Grundlagen menschlicher Erkrankungen, Diabetes und Adipositas bis hin zu Neurodegeneration und Krebs zu erforschen. In diesem Zusammenhang bietet Drosophila Larvalentwicklung den idealen Rahmen, um eine metabolische Studiengang als aerobe Glykolyse oder der Warburg-Effekt bekannt. So wie viele Tumoren aerobe Glykolyse Biomasse aus Kohlenhydraten zu generieren, aktivieren Sie also dazu Drosophila Larven aerobe Glykolyse zur Förderung der entwicklungspolitischen Wachstum3,4,5. Diese Ähnlichkeiten zwischen Larven und Tumor-Stoffwechsel Drosophila als ein Modell für das Verständnis wie aerobe etablieren Glykolyse ist geregelt in Vivo.
Trotz der Tatsache, die die Fliege als ein beliebtes Modell für Stoffwechsel entstanden ist, setzen die meisten Drosophila Studien auf Methoden, die entworfen sind, um die einzelnen Metaboliten3, wie Trehalose, Triglyceride oder ATP zu messen. Da ein bestimmtes Protokoll erforderlich ist, um jede Metaboliten zu messen, sind Assay-basierten Studien arbeitsintensiv, teuer und voreingenommen gegenüber dieser Verbindungen, die mit kommerziellen Kits gemessen werden kann. Eine Lösung für diese Einschränkungen entstanden aus dem Bereich der Metabolomik, sorgt für eine effizientere und unvoreingenommene Mittel der Drosophila Stoffwechsel. Im Gegensatz zu einem Assay-basierten Studie kann eine einzelne Metabolomic Analyse gleichzeitig Hunderte von niedermolekularer Metaboliten zu messen und bieten ein umfassendes Verständnis von einem Organismus Stoffwechsellage6,7. Diese Technik hat die Drosophila metabolische Studien deutlich erweitert und repräsentiert die Zukunft dieser aufstrebenden Feld8.
Metabolomic sind in erster Linie Studien mit drei Technologien: (i) Kernspinresonanz (NMR), (Ii) flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und (Iii) Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)9. Jeder Ansatz bietet deutliche Vorteile und Nachteile, und alle diese Technologien wurden verwendet, um erfolgreich studieren Drosophila Stoffwechsel. Da die Forschung in unserem Labor auf kleine, polaren Metaboliten gerichtet ist, beschäftigen wir in erster Linie eine GC-MS-basierte Methode. GC-MS bietet dem Anwender eine Reihe von Vorteilen, einschließlich hohe Reproduzierbarkeit, Peak Auflösung, Empfindlichkeit, und die Verfügbarkeit einer standard Elektron Auswirkungen (EI) spektrale Bibliothek, ermöglicht eine schnelle Bestimmung entdeckt metabolische Funktionen10,11. Die Vorbereitung der Proben für GC-MS, jedoch ist etwas komplex und erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit zum Detail. Proben müssen gesammelt, gewaschen, gewogen und in einer Weise, die schnell Stoffwechselreaktionen stillt eingefroren. Darüber hinaus fliegende Karkasse ist resistent gegen standard Homogenisierung Protokolle und erfordert eine Rührwerksmühle um optimale Metabolit Extraktion zu gewährleisten. Zu guter Letzt müssen Proben von GC-MS analysiert chemische Derivatisierung vor Erkennung12unterzogen werden. Während zuvor veröffentlichte Methoden alle diese Schritte3,13,14 beschreiben, ist eine visuelle Protokoll, die den unerfahrenen Benutzer reproduzierbar hochwertige Daten generieren lassen würde noch benötigt. Hier zeigen wir wie Drosophila Larven Proben für Metabolomik GC-MS-basierte Analyse vorzubereiten. Dieses Protokoll ermöglicht dem Benutzer, reproduzierbar Messen viele der kleinen polaren Metaboliten, die zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel zu komponieren.

<table><tbody><tr><td>Ungeschwefelte schwarze Melasse</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila-Agar Typ II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridin</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyaminhydrocholorid (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA mit 1% Trimethylchlorsilan</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann" s Aktive Trockenhefe</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila Stammflasche</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Weichgewebe-Homogenisierungsmischung (2 mL Röhrchen) &nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Fläschcheneinsatz, 250 & Mikro; L deaktiviertes Glas mit Polymerfüßen</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Bernsteinsäure-2,2,3,3-d4</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphorsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxybenzoesäure Methylester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker mit einem 24 x 12 mm Block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 x 10 mm Gewebekulturschale</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC-Säule</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung von drosophila larven proben für gaschromatographie-massenspektrometrie (gc-ms)-basierte metabolomik

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Metabolomik haben der Taufliege Drosophila Melanogaster als ein leistungsfähiges genetischen Modell für tierischen Stoffwechsel etabliert. Durch die Kombination von der Vielzahl der Drosophila genetische Werkzeuge mit der Fähigkeit, große Schwaden des intermediären Stoffwechsels Umfrage, kann ein Metabolomik Ansatz komplexe Wechselwirkungen zwischen Ernährung, Genotyp, Lebensgeschichte Veranstaltungen und ökologische Hinweise offenbaren. Darüber hinaus können Metabolomik Studien entdecken Sie neuartige enzymatische Mechanismen und bisher unbekannte Verbindungen zwischen scheinbar disparaten Stoffwechselwege zu entdecken. Um eine breitere Nutzung dieser Technologie unter den Drosophila -Community zu erleichtern, bieten wir hier ein detailliertes Protokoll, der beschreibt, wie Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) vorbereiten- Metabolomic Analyse basiert. Unser Protokoll enthält Beschreibungen der Larven Musterkollektion, Metabolit Extraktion, chemische Derivatisierung und GC-MS-Analyse. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls ermöglicht es Benutzern, die relative Häufigkeit von kleinen polaren Metaboliten, darunter Aminosäuren, Zucker und organischen Säuren beteiligt in Glykolyse und der TCA-Zyklen zu messen.

Laktat-Dehydrogenase (dLDH) Mutanten, die dLDH Aktivität4und genetisch passenden Steuerelemente fehlen wurden als Mitte-L2 Larven gesammelt und nach oben beschriebenen Protokoll verarbeitet. Im Vergleich zu Kontrollen zeigen mutierte Larven signifikante Veränderungen in Laktat, Pyruvat und L-2-Hydroxyglutarate-4. Spektren wurden mit einem Agilent GC6890-5973i MS-System erworben. Ein Beispiel für die GC-MS Spektren erzeugen mit unser...

Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich des Stoffwechsels beantworten, z. B. wie der Onkometabolit L2-Hydroxyglutarat in gesunden Zellen synthetisiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es dem Benutzer ermöglicht, über 100 Metaboliten direkt auf empfindliche und reproduzierbare Weise zu messen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Protokoll eine effiziente Probenverarbeitung erfordert und extrem empfindlich auf Wasserdampf reagiert.Zu Beginn des Protokolls geben Sie einen Milliliter eiskaltes 0,9%iges Natriumchlorid in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit zuvor vorbereiteten Larven. Schließen Sie den Deckel, klappen Sie das Röhrchen senkrecht um, um die Larven gründlich zu waschen, und legen Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang auf Eis. Die Larven sinken auf den Boden des Röhrchens, aber die Hefe bleibt in der Schwebe.Sobald alle Larven ein loses Pellet gebildet haben, entfernen Sie die Natriumchloridlösung mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie alle Lösungsreste mit einer 200-Mikroliter-Pipette und frieren Sie die Probe sofort in flüssigem Stickstoff ein.Verwenden Sie einen ethanolbeständigen Marker, um die Seite eines Zwei-Milliliter-Schraubverschluss-Perlenröhrchens zu beschriften. Als nächstes tarieren Sie die Masse des markierten Bead-Rohrs mit einer Analysenwaage, die 0,01 Milligramm genau messen kann. Entfernen Sie mit einer langen Pinzette das 1,5-Milliliter-Probenröhrchen aus dem Flüssigstickstoff-Dewar.Greifen Sie mit Nitrilhandschuhen nach dem gefrorenen Rohr, drehen Sie es um und schlagen Sie den Röhrchendeckel scharf gegen die Tischplatte, um das gefrorene Granulat zu lösen. Gießen Sie das Pellet sofort in ein vortariertes Zwei-Milliliter-Perlrohr mit Schraubverschluss. Die Probe muss schnell verarbeitet werden, um sicherzustellen, dass endogene Stoffwechselwege nicht reaktiviert werden.Messen Sie schnell die kombinierte Masse des Larvenpellets und des Perlenröhrchens. Legen Sie das Probenröhrchen sofort in flüssigen Stickstoff. Legen Sie die Probenröhrchen in einen Tischkühler mit minus 20 Grad Celsius.In jedes Röhrchen werden 0,8 Milliliter vorgekühltes 90%iges Methanol mit zwei Mikrogramm Bernstein-D4-Säure pro Milliliter gegeben. Bringen Sie die Proben wieder in den Tischkühler mit minus 20 Grad Celsius. Eine Negativkontrolle wird eingerichtet, indem 0,8 Milliliter vorgekühltes 90%iges Methanol mit zwei Mikrogramm Bernstein-D4-Säure pro Milliliter in ein leeres Bead-Röhrchen gegeben werden.Homogenisieren Sie die Proben dann 30 Sekunden lang bei 6,45 Metern pro Sekunde mit einem Kugelmühlen-Homogenisator, der sich in einem Kontrollraum mit einer Temperatur von vier Grad Celsius befindet. Bringen Sie die homogenisierten Proben wieder in den Tischkühler mit minus 20 Grad Celsius und stellen Sie den Kühler für mindestens eine Stunde in einen Gefrierschrank mit minus 20 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um den entstehenden Niederschlag zu entfernen.Übertragen Sie 600 Mikroliter des Überstands in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und stören Sie den Niederschlag nicht. Öffnen Sie alle Probenröhrchen und legen Sie sie in eine Vakuumzentrifuge. Trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur, bis alle Lösungsmittel entfernt sind.Wenn die getrockneten Proben bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, legen Sie ungeöffnete Probenröhrchen in eine Vakuumzentrifuge und trocknen Sie sie 30 Minuten lang. Bereiten Sie eine Lösung von 40 Milligramm Methoxylaminhydrochlorid oder MOX in wasserfreiem Pyridin vor. Bewahren Sie das MOX und das Pyridin in einem Exsikkator auf.Verwenden Sie anschließend eine Heißluftpistole, um eine Ein-Milliliter-Glasspritze etwa fünf Sekunden lang zu trocknen. Führen Sie die Nadel der Spritze in die Flasche mit wasserfreiem Pyridin ein. Entfernen Sie einen Milliliter Pyridin und geben Sie es in ein Mikrofuge-Röhrchen mit 40 Milligramm MOX.Dieser Teil des Protokolls ist extrem empfindlich gegenüber Wasser. Alle Reagenzien müssen vor der Verwendung in einem Exsikkator gelagert werden. Darüber hinaus muss der Benutzer sicherstellen, dass die Probe nur minimal dem atmosphärischen Wasserdampf ausgesetzt ist.Spülen Sie dann die Flasche mit wasserfreiem Pyridin mit Argon. Verschließen Sie die Flasche und legen Sie sie wieder in den Exsikkator. Lösen Sie das MOX in Pyridin auf, indem Sie das Röhrchen in einem thermischen Mischer bei 35 Grad Celsius für 10 Minuten bei 600 U/min inkubieren.Als nächstes fügen Sie der getrockneten Probe 40 Mikroliter 40 Milligramm pro Milliliter MOX in wasserfreier Pyridinlösung hinzu. Die Probe 10 Sekunden lang vortexen und kurz zentrifugieren. Inkubieren Sie dann die Probe in einem thermischen Mischer.Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 20.000 g oder maximaler Geschwindigkeit, um die Partikel zu entfernen. Übertragen Sie 25 Mikroliter des Überstands in ein Autosampler-Fläschchen mit einem deaktivierten 250-Mikroliter-Glasmikrovolumeneinsatz. Fügen Sie 40 Mikroliter MSTFA mit 1%TMCS hinzu.Setzen Sie eine Kappe auf das Autosampler-Fläschchen und verschließen Sie das Fläschchen mit einem Crimpwerkzeug. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 250 U/min. Geben Sie schließlich unmittelbar vor der Injektion drei Mikroliter einer zuvor vorbereiteten Fettsäuremethylester-Standard- oder FAMES-Lösung mit einem Roboter-Autosampler in das Autosampler-Fläschchen.Gaschromatographie-Massenspektrometrie von Laktatdehydrogenase-mutierten Larven zeigen signifikante Veränderungen von Laktat, Pyruvat und L2-Hydroxyglutarat im Vergleich zu Kontrolllarven. Die mit dem Protokoll erzeugten GC-MS-Spektren zeigen viele sichtbare Merkmale und einen bemerkenswerten Peak für Trehalose, der normalerweise den größten Peak in einer Larvenprobe darstellt. Die Hauptkomponentenanalyse (Principle Component Analysis, PCA) zeigt deutlich, dass sich die Knockout- und Wildtyp-Gruppen voneinander trennen und dass es in keiner der beiden Gruppen einen Ausreißer gibt.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proben vor der Homogenisierung einzufrieren und alle Reagenzien während des gesamten Verfahrens trocken zu halten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm...

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

Wir beschreiben hier die Verfahren für die Extraktion und Reinigung von mRNA und Metaboliten...

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels und der Homöostase. Subtile Veränderungen im mitochondrialen Stoffwechsel, die die Physiologie des Organismus beeinflussen, könnten in Metabolomik-Studien des gesamten Organismus schwer zu erkennen sein. Hier beschreiben wir eine Isolationsmethode, die den Nachweis subtiler metabolischer Verschiebungen bei Drosophila melanogaster verbessert.

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em&gt; Drosophila</em

Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Minorarbeiterinnen Ameisenarten Colobopsis Explodens werden indiziert, um den Wachs-wie Inhalt gespeichert in ihre hypertrophierten Unterkiefer Drüse Lagerstätten für nachfolgende Lösungsmittel-Extraktion und Analyse von Gaschromatographie-Massenspektrometrie zu isolieren. Die Beschriftung und Kennzeichnung an flüchtigen Bestandteilen, die mit der Open-Source-Software MetaboliteDetector ist ebenfalls beschrieben.

Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean "explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

In diesem Protokoll stellen wir einen optimierten Workflow vor, der eine effiziente und schnelle Probenvorbereitung vieler Proben kombiniert. Darüber hinaus bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Reduzierung analytischer Variationen für die Hochdurchsatzbewertung metabolischer GWAS-Studien.

Large-scale Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Richtlinien für die Probenvorbereitung und Normalisierung

Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur richtigen Probenvorbereitung für die Lipid- und Metabolitenanalyse in kleinen Geweben wie dem Drosophila-Gehirn unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie bereitzustellen.

Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Gonadengewebe der Larven Zebrabärbling Isolierung, die Untersuchungen von Zebrabärbling Geschlechtsdifferenzierung und Wartung erleichtert.

Dissection von Larval Zebrabärbling Gonadal Tissue

Lernen Sie die Probenpräparation von Drosophila-Larven für GC-MS-basierte Metabolomik. Diese Methode ermöglicht die direkte Messung von über 100 Metaboliten mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

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