Name: In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung an paraffin-eingebetteten Korallengeweben zur Visualisierung räumlicher RNA-Expression. Diese Methode ermöglicht die Analyse gewebe- und zellspezifischer Genexpression in Korallen.

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Diese Arbeit wurde von Award finanziert keine. OCE-1323652 durch die National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship und Award-no.1012629 von Burroughs Wellcome Fonds Postdoctoral Enrichment Program.

1. Entfernung des Paraffins
Achtung: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem Abzug.
<ol><li>Wachsentfernung dünn geschnittene Paraffin-eingebetteten Folien mit 100 % Xylol unter der Haube in Coplin Gläser für 10 Minuten. Verwenden Sie keine Coplin Plastikdosen, wie Xylol Kunststoff schmilzt. Sterilisieren Sie die Coplin Gläser im Autoklav vor Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie vier sterile Coplin Gläsern mit den folgenden: 100 % Ethanol, 80 % Ethanol, Ethanol 70 % und 60 % Ethanol. Das Ethanol mit RNase-freies Wasser zu verdünnen.<ol>
<li>Die Folien zu den sterilen Coplin Behälter mit 100 % Ethanol zu übertragen und für 10 Minuten einweichen. Leeren Sie nach 10 min Coplin Glas zu, und ersetzen Sie durch neue 100 % Ethanol. Die Folien wieder für 10 Minuten einweichen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 80 % igem Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Coplin Glas mit 70 % igem Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 60 % Ethanol für 1 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbehandlung von Folien für die Vorbereitung der RNA-Sonde Hybridisierung
<ol><li>Führen Sie die folgenden Waschungen bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. Führen Sie Raumtemperatur Waschungen auf einem Orbitalschüttler mit langsamer Geschwindigkeit. Verwenden Sie sterile Folie Versandtaschen mit Platz für bis zu fünf Folien für das Waschen der Folien.</li>
	<li>Die Folien auf einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) übertragen. Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Gießen Sie 1 X PBS, und sofort behandeln Sie das Gewebe auf den Folien mit Proteinase K Sonde Durchdringung des Gewebes ermöglichen. Die Folie Mailer ca. 18 mL Proteinase K-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle 1 für die Lösungskonzentration Arbeit). Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten. Nicht schütteln.<ol>
<li>Während die Folien Inkubation sind, bereiten Sie prehybridization Puffer (Prehybe Puffer). Legen Sie den Prehybe-Puffer in einem kochenden Wasserbad für 10 min, dann auf einem Eisbad für 5 min abkühlen lassen. Nach einem Rezept von Prehybe Puffer siehe Tabelle 1.</li>
		<li>Stoppen Sie Verdauung der Proteinase K Reaktion durch Ausgießen der Proteinase K-Lösung zu, und sofort 18 mL 0,2 % Glycin-PBS-Lösung für Folie Mailer. Lassen Sie die Folie-Mailer für 5 min bei Raumtemperatur sitzen.</li>
		<li>Gießen Sie die 0,2 % Glycin-PBS-Lösung und jede Folie Mailer fügen Sie 18 mL 2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) Lösung hinzu. Waschen Sie die Folien in den 2 X SSC für 10 min bei Raumtemperatur, mit 100-150 u/min schütteln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Prehybridization von Folien in Vorbereitung für die RNA-Sonde Hybridisierung
<ol><li>Während die Folien mit 2 gewaschen werden X SSC, erhalten einen neue sterile Folie Mailer und ca. 18 mL Prehybe Puffer in Folie Mailer. Legen Sie die Folie Mailer in Hybridisierung Backofen bei Hybridisierung Temperatur. Hinweis: Die Hybridisierung Temperatur hängt von der Sonde verwendet wird, aber in der Regel reicht von 50-60 ° C.</li>
	<li>Nach Abschluss der 2 X SSC Wäsche 2 x SSC und Ort Ausgießen der Folien in der Dia-Mailer in der Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen für 1 h.</li>
</ol>(4) Hybridisierung der RNA-Sonde
<ol><li>Während die Folien mit dem Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen Inkubation sind, bereiten Sie Hybridisierung-Sonde Lösung.<ol>
<li>Jede Sonde in Hybridisierung Puffer (0,5 µL der Sonde mit 24,5 µL Hybridisierung Puffer) verdünnen. Hinweis: Das Rezept für Hybridisierung Puffer findet sich in Tabelle 1. Ein Beispiel der Sonde Vorbereitung und Konzentrationen finden im Traylor-Knowles Et al. 11.</li>
		<li>Legen Sie die verdünnte Probe auf einem Heizblock 86-90 ° C für 12 min, dann für 1 min auf Eis abkühlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den Folie Mailer aus dem Ofen Hybridisierung und entfernen Sie Folien einzeln von der Folie-Mailer mit einer sterilen Pinzette. Legen Sie die Folien flach auf ein Papiertuch und wischen Sie vorsichtig überschüssiges Prehybe Puffer um Gewebeproben. Achten Sie darauf, nicht zu die Proben zu berühren und arbeiten schnell, um zu verhindern, Trocknung von Gewebeproben.</li>
	<li>Umschließen Sie das Gewebe mit einem PAP-Stift. Gelten Sie 25 µL der verdünnten Probe Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Probe mit einem Kunststoff deckgläschen.<ol>
<li>Legen Sie die Proben in der Folie Feuchtigkeit Kammer mit 4 x SSC + 50 % Formamid-Lösung in den Boden der Kammer.</li>
		<li>Sobald Sonden auf alle Folien hinzugefügt wurden, legen Sie die Folie Feuchtigkeit Kammer in der Hybridisierung Ofen für mindestens 24 Stunden bei einer Hybridisierung-Temperatur von 50-60 ° C. Die Inkubationszeit sollte variiert abhängig von der Konzentration der Sonde jedoch mindestens 24 Stunden lang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nehmen Sie nach der Übernachtung Inkubation mit der verwässerte Sonden die Folie Feuchtigkeit Kammer aus der Hybridisierung Ofen.<ol>
<li>Entfernen Sie Deckgläsern aus einzelnen Dias, ohne dabei das Gewebe verdrängen. In einer 1000 µL Pipette 1000 µL 2 X SSC-Lösung hinzufügen und die Folie vorsichtig abwaschen.</li>
		<li>Legen Sie die Folie in einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 2 X SSC-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Gießen Sie die Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 2 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie die 2 X SSC-Lösung. 18 mL 1 X SSC Lösung und Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur hinzugeben. Gießen Sie 1 X SSC Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 1 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie die 1 X SSC. 18 mL 0,5 x SSC und Wäsche für 10 min bei 42 ° C ohne schütteln hinzugeben. Gießen Sie die 0,5 x SSC und ersetzen es mit 18 mL frische 0,5 X SSC. Ohne schütteln wieder für 10 min bei 42 ° C waschen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Visualisierung der RNA-Sonde
Hinweis: Für die Visualisierung der Sonde, BM lila während des Entwicklungsprozesses verwendet werden. Allerdings müssen mehrere Wäschen vor diesem Schritt Vorbereitung der Proben für das Beflecken.
<ol><li>Waschen Sie die Folien mit 18 mL Puffer alkalische Phosphatase (AP-Puffer), ohne MgCl2 für 1 min. Ausgießen der AP-Puffer ohne MgCl2, und 18 mL 1 X Boehringer Mannheim blockierende Puffer mit Maleic Säure-Puffer verdünnt. Mindestens 1 h bei Raumtemperatur in einer Dia-Mailer mit sanft schütteln inkubieren. Hinweis: Der Boehringer Mannheim blockierende Puffer Maleic Acid Puffer verwendet vorgefertigte und in dem Graben waschen und Block Puffer Set gekauft (erhältlich im Handel).<ol>
<li>Alternativ kann die Inkubation über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden. Mehr Sperrfrist verringert das Auftreten von unspezifischen Bindung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die 20 mL verdünnten DIG Anti-Digoxigenin-AP-Fab-Fragmente (Anti-DIG-Antikörper = 2 µL Anti-DIG-Antikörper + 20 mL 1 x Boehringer Mannheim blockierende Puffer). Das ist genug für den Einsatz in 1 Kunststoff-Folie-Mailer. Mehr von dieser Lösung müssen bereit sein, wenn mehr als eine Folie Mailer verwendet werden soll.</li>
	<li>Eine neue sterile Folie Mailer der Anti-DIG-Antikörper hinzu, und übertragen Sie die Folien auf die Folie-Mailer mit der Anti-DIG Antikörperlösung. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 h mit sanft schütteln.</li>
	<li>Nach der Inkubation Ausgießen des Anti-DIG-Antikörpers und waschen Sie die Folien in der Dia-Mailer mit 18 mL AP-Puffer ohne MgCl2 für 5 min mit sanft schütteln.</li>
	<li>Der AP-Puffer ohne MgCl2, Gießen Sie aus und 18 mL AP-Puffer. Wäsche für 5 min mit sanft schütteln. Gießen Sie nach 5 min Inkubation den AP-Puffer, ersetzen Sie es mit 18 mL frisch AP-Puffer und waschen für 5 min mit sanft schütteln.</li>
	<li>Gießen Sie in der Dunkelheit die AP-Puffer und 18 mL BM lila an der Folie-Mailer. Die Folien bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, Überprüfung auf lila Farbe Entwicklung jedes ½ h. Reaktionszeiten für die Visualisierung variieren basierend auf der Sonde, die entwickelt wird. Hinweis: Anstelle von BM lila Visualisierung Entwicklungslösung erfolgen mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) und Nitro blau tetrazoliumsalz (NBT). Siehe Tabelle 1 für Anweisungen.</li>
	<li>Vorbeischauen Sie Farbentwicklung, die Dias auf eine neue sterile Folie Mailer mit 18 mL Tris-EDTA (TE)-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln zu übertragen.</li>
	<li>Gießen Sie die TE-Puffer und 18 mL RNase-freies Wasser auf die Folie Mailer und Wäsche für 1 min, im Dunkeln.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folien aus dem Wasser, und trocknen Sie sie an den Rändern des Gewebes. Fügen Sie Glycerin Montage Medium hinzu und platzieren Sie die Deckgläsern. Speichern Sie die Folien bei 4 ° C bis Bilder aufgenommen werden können.</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+Change%2C+Human+Impacts%2C+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933(2003).</li>
<li>Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959378014001782">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742(2007).</li>
<li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540(2008).</li>
<li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59(2007).</li>
<li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora%3A+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311(2008).</li>
<li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+situ+hybridization+protocols%22">In situ hybridization protocols</a>. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).</li>
<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. , Oxford University Press. (1987).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li>
<li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900(2013).</li>
<li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15(2014).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li>
<li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+%28Leucoraja+erinacea%29%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24(2017).</li>
<li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3(2014).</li>
<li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubozoan+jellyfish%3A+an+Evo%2FDevo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde von der früheren Arbeit in medizinischen und evolutionäre Entwicklungsforschung8,9,10,12,17geändert. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nuancen der eine in Situ Hybridisierung mit einer Grabung beschriftet RNA Gegenstrang Sonde auf Erwachsenen Korallen, die konserviert und in Paraffin eingebettet ...

Korallen sind kritische Ökosystem Bauherren und wichtig für die biologische Vielfalt in den Ozean und menschliche Gesundheit1,2,3. Sie sind bedroht durch Klimawandel und anderen anthropogenen Stressfaktoren, und viele Korallenarten gelten als vom Aussterben bedroht. Somit ist ein erheblicher Bedarf für Zelluläre und molekulare Werkzeuge zur diagnose von Korallen unter Stress. Außerdem ist es wenig über wo Gene innerhalb von Erwachsenen korallengewebes und daher wenig Verständnis für die Funktionen dieser Gene exprimiert werden verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir in Situ Hybridisierung (ISH), häufig verwendete Protokoll in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie, für den Einsatz auf Paraffin-eingebetteten Gewebeproben von Erwachsenen Korallen angepasst. Diese Technik ist mächtigsten auf Erwachsenen Korallen verwendet, die ein belastendes Ereignis wie Hitzestress unterzogen wurden. Doch diese Technik kann auf eine Vielzahl von Geweben und Lebensphasen in Korallen verwendet werden und beschränkt sich nicht nur Wärme betonte Korallen4,6,7. Darüber hinaus kann diese Technik auf Gewebe oder Zellen von jeder riffbildende verwendet werden, solange gibt es cDNA-Sequenzinformationen.
Der Zweck dieser Methode ist, RNA-Sonden in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die bewahrt und in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Diagnosetool, das für die Visualisierung von Nukleinsäuren in Erwachsenen korallengewebe ermöglicht. Ursprünglich wurde diese Methode für die medizinische Diagnostik entwickelt, und es ist seitdem ein beliebtes Hilfsmittel in Bereichen wie Entwicklungsbiologie und evolutionären Entwicklungsbiologie8,9,10. ISH ist auch eine kritische Methode, vor allem in nicht-Modellsysteme, wenn genomische und transkriptomischen Sequenzdaten sind verfügbar, aber räumliche gen Expressionsmuster sind unbekannt. Für die diagnostische Arbeit in nicht-Modellsystemen ist diese Technik mächtig, weil sie angeben kann, welche Zellen und Geweben ein Gen des Interesses Express und zu mehr zielgerichtete Therapieansätze8,9,10führen, 11,12. Zu guter Letzt ist diese Technik qualitativer und leistungsfähiger, wenn gepaart mit quantitativen Gen Ausdruck Daten11.
In diesem Papier skizzierte Ansatz werden von Interesse für Forscher, die bereits eine Digoxigenin (DIG) entworfen haben-mit der Bezeichnung RNA-Sonde (Sinn und Antisense-Sonden) und sind nun bereit, in Situ Hybridisierung der Sonden zu einer Probe durchführen. Um diese Methode durchzuführen, benötigt zwei Schnittserien eines Gewebes, Paraffin Korallen für jede Sonde getestet. Ein Teil wird für die Sinne-Sonde und die andere für die antisense-Sonde verwendet werden. Die Sinn-Sonde wird ein Steuerelement an unspezifischen Bindung sein. Wenn Färbung in der Sinn-Sonde beobachtet wird, ist die antisense-Sonde nicht spezifisch für die RNA von Interesse. Sonden können für jedes Gen ausgedrückt ausgelegt werden. In diesem Protokoll werden mehrere Beispiele verwendet, die bisher gefunden wurden, während Hitzestress in Korallen ausgedrückt werden: FBJ murinen Osteosarkom viral Oncogene Homolog B (Fos-B), Activator Protein (AP1) und Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor 41 (TNFR 41)11. ISH mit DIG-Label RNA-Sonden wird vorgezogen mit radioaktiven Sonden, weil deren Handhabung viel sicherer10ist. Darüber hinaus ist diese Technik ist sehr empfindlich und kann auf eine Vielzahl von Geweben und Embryonen über Wärme-gestressten Erwachsenen Korallen13,14,15,16durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Denhardt's Lösung</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkalischer Phosphatase-Puffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger-Versandtaschen</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkalischer Phosphatase-Puffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon-Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperma DNA-Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperma DNA-Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger weißer Apex überlegener Klebstoff</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Lösung, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, Molekulare Qualität, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wasch- und Blockpuffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung, 500 mL Größe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Puffer 20X Konzentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut des Schweins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xylole, AR (ACS), für den histologischen Gebrauch</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE Puffer</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridisierung techniken für paraffin-eingebetteten erwachsenen korallen proben

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Korallen sind wichtige Ozean Wirbellosen, die entscheidend für die allgemeine Gesundheit der Meere sowie die menschliche Gesundheit sind. Korallen sind jedoch durch menschliche Einflüsse wie steigenden Meerestemperaturen und Versauerung bedroht. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, erwiesen Fortschritte in der Zell- und Molekularbiologie sich für die Gesundheit der Korallen Diagnose von entscheidender Bedeutung. Ändern einige der häufig in der Humanmedizin verwendet Techniken könnte erheblich verbessern Forscher Fähigkeit Korallen zu behandeln. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein Protokoll zur in Situ Hybridisierung verwendet, vor allem in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie angepasst für den Einsatz in Erwachsenen Korallen unter Stress.
Der Zweck dieser Methode ist den räumliche Ausdruck einer RNA-Sonde in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurde. Diese Methode konzentriert sich auf die Entfernung des Paraffins und Rehydrierung der Probe, Vorbehandlung der Probe zur Durchlässigkeit der Probe, Pre-Hybridisierung Inkubation, Hybridisierung der RNA-Sonde und Visualisierung der RNA-Sonde zu gewährleisten. Dies ist eine leistungsfähige Methode, wenn nicht Modellorganismen mit um zu entdecken, wo bestimmte Gene exprimiert, und das Protokoll kann für andere Modellorganismen leicht angepasst werden. Die Methode ist jedoch beschränkt, dass es sich in erster Linie qualitative, da Ausdruck Intensität, abhängig von der Höhe der Zeit während der Visualisierung Schritt und die Konzentration der Sonde verwendet variieren kann. Darüber hinaus ist Geduld erforderlich, da dieses Protokoll bis zu 5 Tagen (und in vielen Fällen länger) abhängig von der verwendeten Sonde nehmen kann. Zu guter Letzt unspezifische Hintergrundfärbung ist üblich, aber diese Einschränkung überwunden werden kann.

Nach Abschluss dieses Protokolls, erfolgt die Identifikation von Zellen und Geweben, die die RNA-Sonde von Interesse zum Ausdruck bringen. Die repräsentativen Ergebnisse für dieses Protokoll sind für AP-1, FosB und TNFR41. Diese Ergebnisse, zuvor von Traylor-Knowles Et Al. veröffentlicht 11, Sonden zeigen räumliche Ausdruck der RNA auf Erwachsenen Korallen, die Hitze-Stress ausgesetzt waren. Zwei Beispiele verschiedener Färbung sind in <strong class="xfig"...

Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.

In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie von Korallen zu beantworten, z. B. welche Arten von Geweben und Zellen bestimmte Arten von Genen exprimieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie visuelle Informationen über die RNA-Expression haben. Obwohl diese Methode Einblicke in die räumliche Genexpression bei erwachsenen Korallen geben kann, kann sie auch in anderen Lebensstadien von Korallen sowie in anderen wirbellosen Systemen eingesetzt werden.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es so viele Schritte und Lösungen gibt, die man im Auge behalten muss. Sie müssen also darauf achten, wo sie sich im Protokoll befinden, und die Zeit im Auge behalten, wenn sie die Wäschen durchführen. Kevin Rodriguez, ein Techniker in meinem Labor, wird dieses Verfahren vorführen.Entwachsen Sie zunächst dünngeschnittene, in Paraffin eingebettete Objektträger mit 100 % Xylol in Coplin-Glasgläsern für 10 Minuten unter der Haube. Füllen Sie anschließend vier sterile Coplin-Glasgläser mit 100 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol bzw. 60 % Ethanol. Füllen Sie zuerst die Objektträger in das Coplin-Gl

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Eine Kombination verschiedener Techniken, um die Datenerfassung von der Maus Gewebe zu maximieren wird vorgestellt.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Der Zebrafisch, einem kleinen tropischen Fischen, hat sich zu einem beliebten Modell zum Studium der Genfunktion während Wirbeltiere Entwicklung und Krankheit. Die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen kann bestimmt werden...

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

Eine integrierte Suite von bildgebenden Verfahren wurde angewandt, um Polypen Morphologie und Gewebestruktur in der Karibik Korallen Montastraea annularis und M. bestimmen faveolata. Fluoreszenz, Serienblock Gesicht und Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konfokalen haben gelappten Struktur, Polypen Wände, und die geschätzte Chromatophoren und Zooxanthellen Dichten und Verteilungen identifiziert.

Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.

In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung stammartig wuchernder Zellen in der Qualle Cladonema. Die Whole-mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung mit einem Stammzellmarker ermöglicht den Nachweis stammähnlicher Zellen, und die 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung ermöglicht die Identifizierung proliferierender Zellen. Zusammen können aktiv wuchernde stammartige Zellen nachgewiesen werden.

Fluoreszierende In situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum

In diesem Artikel werden zwei Methoden vorgestellt, die auf der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung basieren, um den X-chromosomalen Gehalt von Ovarialzellen in nicht transplantiertem und transplantiertem Ovarialrindengewebe von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu bestimmen.

Erforschung von X-Chromosomen-Aberrationen in Ovarialzellen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Hier stellen wir die Extraktion und Präparation von polaren und semipolaren Metaboliten aus einem Korallenholobionten, sowie getrenntem Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellfraktionen für die gaschromatographische Massenspektrometrie-Analyse vor.

Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben

Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung an paraffin-eingebetteten Korallengeweben zur Visualisierung räumlicher RNA-Expression. Diese Methode ermöglicht die Analyse gewebe- und zellspezifischer Genexpression in Korallen.

In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben

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