Name: Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Isolierung und Sequenzierung pflanzlicher DNA-Viren aus infizierten Blättern. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung neuer Viren der Familie Caulimoviridae für die Umweltvirologie.

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Forschung wurde durch Oklahoma Zentrum für die Förderung von Wissenschaft und Technik angewandte Forschung Programm Phase II AR 132-053-2 finanziert; und von der Oklahoma Abteilung der Landwirtschaft Sonderkulturen Research Grant Program. Wir danken Dr. HongJin Hwang und der OSU Bioinformatik Core Facility, die durch Zuschüsse von NSF (EOS-0132534) und NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 und 5P20RR15564-03) unterstützt wurde.

<ol><li>Dijkstra, J., Jager, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+J+%22Practical+Plant+Virology+%3A+Protocols+and+Exercises%22">Practical Plant Virology : Protocols and Exercises</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+virus+metagenomics%3A+biodiversity+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology.</a> Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).</li>
<li>Melcher, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+novel+viruses+by+analysis+of+nucleic+acids+in+virus-like+particle+fractions+from+Ambrosia+psilostachya%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya.</a> J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).</li>
<li>Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+metagenomic+data+for+viruses+using+the+e-probe+diagnostic+nucleic+Acid+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay.</a> Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).</li>
<li>Borah, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacilliform+DNA-containing+plant+viruses+in+the+tropics%3A+commonalities+within+a+genetically+diverse+group%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group.</a> Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).</li>
<li>Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy%2C+molecular+phylogeny+and+evolution+of+plant+reverse+transcribing+viruses+%28family+Caulimoviridae%29+inferred+from+full-length+genome+and+reverse+transcriptase+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences.</a> Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).</li>
<li>Geering, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Banana+contains+a+diverse+array+of+endogenous+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses.</a> J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).</li>
<li>Kunii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+putative+DNA+virus+from+endogenous+rice+tungro+bacilliform+virus-like+sequences+in+the+rice+genome%3A+implications+for+integration+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution.</a> BMC Genomics. 5, 80(2004).</li>
<li>Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PHYTO-12-11-0351">An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm.</a> Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).</li>
<li>Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+viral+and+non-viral+reverse+transcribing+elements+in+pineapple+%28Ananas+comosus%29%2C+including+members+of+two+new+badnavirus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species.</a> Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).</li>
<li>Gayral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Banana+streak+virus+integration+event+in+the+banana+genome+as+the+origin+of+infectious+endogenous+pararetrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus.</a> J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).</li>
<li>Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+endogenous+badnaviruses+in+the+New+Zealand+flora%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+Plants%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora.</a> AoB Plants. 2011, 008(2011).</li>
<li>Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+episomal+Banana+streak+viruses+by+multiplex+immunocapture+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR.</a> J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).</li>
<li>Singh, K., Talla, A., Qiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+profiling+of+virus-infected+grapevines%3A+evidences+for+virus+infection-associated+and+variety-specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs.</a> Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).</li>
<li>Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+determining+whole+viral+genomic+sequences+including+termini+using+a+single+deep+sequencing+run%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run.</a> J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).</li>
<li>Kreuze, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+viral+genome+sequence+and+discovery+of+novel+viruses+by+deep+sequencing+of+small+RNAs%3A+a+generic+method+for+diagnosis%2C+discovery+and+sequencing+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses.</a> Virology. 388 (1), 1-7 (2009).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusDetect%3A+An+automated+pipeline+for+efficient+virus+discovery+using+deep+sequencing+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs.</a> Virology. 500, 130-138 (2017).</li>
<li>James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7348.2011.00466.x">Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa.</a> Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).</li>
<li>Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+shorter+than+genome+length+episomal+Banana+streak+OL+virus+like+sequences+isolated+from+banana+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India.</a> Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).</li>
<li>Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+badnaviruses+infecting+Dioscorea+spp.+in+the+Pacific+reveals+two+putative+novel+species+and+the+first+report+of+dioscorea+bacilliform+RT+virus+2%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2.</a> Virus Res. 238, 29-34 (2017).</li>
<li>BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequence-independent+strategy+for+amplification+and+characterisation+of+episomal+badnavirus+sequences+reveals+three+previously+uncharacterised+yam+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="https://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/brief/2004/canna/">Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida.</a> Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Canna+yellow+mottle+virus+in+a+new+host%2C+Alpinia+purpurata%2C+in+Hawaii%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii.</a> Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).</li>
<li>Wijayasekara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+two+badnavirus+genomes+associated+with+Canna+yellow+mottle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease.</a> Virus Res. 243, 19-24 (2018).</li>
<li>Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caulimovirus+isolation+and+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Caulimovirus isolation and DNA extraction.</a> Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+2nd+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn</a>. , Cold Spring Harbor Press. (1989).</li>
<li>Radford, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technologies+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technologies in virology.</a> J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).</li>
<li>Kanagal-Shamanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion+PCR%3A+Techniques+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Emulsion PCR: Techniques and Applications.</a> Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).</li>
<li>Getts, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+blockade+in+lethal+West+Nile+virus+encephalitis+indicates+a+crucial+role+for+very+late+antigen+%28VLA%29-4-dependent+recruitment+of+nitric+oxide-producing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages.</a> J Neuroinflammation. 9, 246(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).</li>
<li>Gel filtration principles and methods. <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/ge-gel-filtration.pdf">GE Healthcare</a>. , (2010).</li>
<li>Goff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iPlant+Collaborative%3A+Cyberinfrastructure+for+Plant+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology.</a> Frontiers in Plant Science. 2, (2011).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+bioinformatic+approaches+to+detect+and+analyze+influenza+virus+in+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dev+Ctries%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets.</a> J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+a+multiple+sequence+alignment+method+with+reduced+time+and+space+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity.</a> BMC Bioinformatics. 5, 113(2004).</li>
<li>Hung, J. H., Weng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Alignment+and+Homology+Search+with+BLAST+and+ClustalW%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).</li>
<li>Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA+biocentric+software+for+sequence+and+phylogenetic+analysis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioinform+Res+Appl%22%5BJournal%5D)">MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review.</a> Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191(2013).</li>
<li>Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Moeller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Grooms, K. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Review%3A-Improved-DNA-Yield-and-Quality-from-Diverse-Grooms/b0a1299cacd7451cbbb9270caf72762379cd8e5d">Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa</a>. , (2015).</li>
<li>Nishimori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+antivirus+activity+of+an+anti-programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+rat-bovine+chimeric+antibody+against+bovine+leukemia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection.</a> PLoS One. 12 (4), 0174916(2017).</li>
<li>Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540757627">Plant Virus Evolution</a>. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+unknown%3A+plant+virus+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">The big unknown: plant virus biodiversity.</a> Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).</li>
<li>Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Virus+Metagenomics%3A+Advances+in+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery.</a> Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="NULL">Plant Health Progress</a>. , Online (2004).</li>
<li>Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+diversity+among+badnavirus+isolates+infecting+yam+%28Dioscorea+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.).</a> Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).</li>
<li>Harper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+Banana+streak+virus+isolates+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda.</a> Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).</li>
<li>Muller, E., Sackey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+variability+analysis+of+five+new+complete+cacao+swollen+shoot+virus+genomic+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences.</a> Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Methoden eingesetzt, um pflanzliche Virus Biodiversität in natürlichen Umgebungen zu studieren, darunter bereichernd für virusähnliche Partikel (VLP) oder Virus spezifische RNA oder DNA-2,3,44, 45,46 . Diese Methoden werden von NGS und bioinformatische Analyse gefolgt. Das Ziel dieser Studie war den kausalen Agent eine häufige Erkrankung in eine kultivierte Pflanze zu finden. Die Krankheit wurde berichtet, das Ergebnis von einem unbekannten Virus, die hat unbehüllte Bacilliform Teilchen, und nur ein 565 bp Fragment wurde für die geklonte47. Diese Information war ausreichend für vorherige Forscher hypothetisch das Virus der Gattung Badnavirus innerhalb der Familie Caulimoviridaezuweisen. Während vorherige Berichte vermutet, dass Canna Mottle Krankheit in Canna Lilien das Ergebnis einer einzigen Badnavirus war, mit dem Metagenomik Ansatz in dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Krankheit durch zwei vorläufige Badnavirus Arten24verursacht wurde. So ist die Stärke mit einem Metagenom Ansatz, um den kausalen Agent einer Krankheit zu entdecken, dass wir jetzt Situationen zu erkennen wo es mehr als eine Ursache sein kann.
Unser Ansatz, die Kombination von DNA und RNA Sequenzierungsdaten ist gründlich und zeigt auch, dass die Ergebnisse mit zwei Ansätzen konsistente Ergebnisse gezeitigt und das Vorhandensein von zwei verwandten Viren bestätigte. Wir beschäftigt eine modifizierte Verfahren zur Isolierung von Caulimoviruses und produziert eine Stichprobe, wurde associated Virus-Nukleinsäuren bereichert und, innerhalb der Virus-Kapsid geschützt waren. Ein Servicelabor erhielt den Auftrag zur Durchführung der DNA-Sequenzierung. Das wesentliche Konzept für die de Novo Sequenzierung ist, dass die DNA-Polymerase die fluoreszierenden beschriftet Nukleotide in einem DNA-Strang Vorlage beim sequenziellen Zyklen der DNA-Synthese enthält. Die Contigs montiert gefolgt von NGS wurden in einer bioinformatischen Workflow produzieren ein paar Contigs, die als Virus Contigs identifiziert wurden eingereicht. Eine weitere Bestätigung von zwei Viren Genome10,24,48,49,50 wurde durch bioinformatische Analyse der RNA-Seq Daten aus Ribo-abgereicherte RNA Vorbereitungen erhalten. Ein interessantes Ergebnis war zu erfahren, dass die Bevölkerungen der Sequenzen von DNA und RNA Sequenzierung wiederhergestellt sofern ähnliche Verteilungen von nicht-viralen und viralen Nukleinsäuren. Für die Sequenzierung von DNA und RNA, < 0,5 % der Sequenzen waren Virus Ursprungs. Innerhalb der Bevölkerung des Virus Sequenzen 78-82 % der Familie Caulimoviridaegehörte. Durch den Vergleich der montierten Virus Contigs von DNA und RNA Sequenzierung, haben wir bestätigt, dass die zwei montierten Genome in beiden Datensätzen aufgetreten.
Ein Anliegen der Verwendung nur DNA-Sequenzierung, um das neue Virus-Genom zu identifizieren ist, dass das Badnavirus Genom einer offenen kreisförmige DNA. Wir vermutet, dass überlappende Diskontinuitäten im Genom Sequenzen Hindernisse für die Genom-Montage von Contigs darstellen könnte. Erstuntersuchung der DNA-Sequenzierung Ergebnisse ergab zwei ähnliche Viren Genome. Wir die Hypothese auf, dass diese Genome entweder genetische Vielfalt einer Spezies vertreten, die nicht untersucht worden ist, oder vertretene zwei Arten Co infizieren die gleiche Pflanze24. Daher aktiviert die kollektive bioinformatische Analyse von Datensätzen durch die NGS DNA und RNA Sequenzierung, die Bestätigung der Anwesenheit von zwei Genome in voller Länge.
Gibt es einen weiteren Bericht, der eine alternative Methode für die Extraktion VLP und Nukleinsäuren aus Anlage Homogenates für metagenomischen Untersuchungen, basierend auf Verfahren, die DNA von Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV; eine Caulimovirus)3erholen entwickelt. Dieser Ansatz identifiziert Roman RNA und DNA-Virus Sequenzen in nicht kultivierten Pflanzen. Die Schritte abgeleitet aus dem Caulimovirus-Isolierung-Verfahren in dieser Studie verwendet, um den kausalen Agent auf eine Erkrankung der Kulturpflanzen zu entdecken sind im Gegensatz zu den Schritten zum Extrahieren VLP natürlich infizierten Pflanzen24abgeleitet. Der Erfolg der beiden veränderte Methoden legt nahe, dass das Rahmen-Verfahren zur Caulimovirus Isolierung ein wertvoller Ausgangspunkt für metagenomischen Untersuchungen von Pflanzenviren im Allgemeinen sein kann.

Aufstrebenden Pflanzenkrankheiten fahren Forscher entwickeln neue Werkzeuge, um die richtige kausale Agents zu identifizieren. Erste Berichte über neue oder wiederkehrende Virosen basieren auf häufig auftretende Symptome wie Mosaik und Fehlbildungen des Blatt, Vene, clearing, Kleinwuchs, welken, Läsionen, Nekrose oder andere Symptome. Der Standard für die Meldung eines neuen Virus, wie der kausale Agent für eine Krankheit ist, es von anderen kontaminierende Erreger zu trennen in geeigneten Host zu verbreiten und vermehren sich die Krankheit durch impfen in gesunde Pflanzen von der ursprünglichen Wirtsarten. Die Einschränkung bei diesem Ansatz ist, dass ein Insekt oder andere Vektoren für die Übertragung zu einem geeigneten Wirt oder zurück zu den ursprünglichen Wirtsarten viele Gattungen von Pflanzenviren abhängen. In diesem Fall die Suche nach der geeigneten Vektor kann verlängert werden, möglicherweise gibt es Schwierigkeiten, Labor Kolonien des Vektors zu etablieren und weitere Anstrengungen sind erforderlich, um ein Protokoll für die experimentelle Übertragung zu entwickeln. Wenn die Voraussetzungen für die erfolgreiche Übertragung Laborstudien nicht erreicht werden können, fällt die Arbeit hinter den Standard für die Meldung einer neuen Viruskrankheit. Für Viren, die in ihrer natürlichen Wirte auf sehr niedrige Titer auftreten, müssen Forscher alternative Gastgeber für die Vermehrung um ausreichende infektiöse Vorräte für die Durchführung von Recherchen erhalten identifizieren. Dies kann auch ein Hindernis für den Anbau von Stammkulturen1Virus-Arten, die nur ein paar Pflanzen infizieren.
In den letzten Jahren beschäftigen Wissenschaftler immer häufiger Hochdurchsatz-NGS und metagenomische Ansätze Virus Sequenzen aufzudecken, die in der Umgebung vorhanden, die möglicherweise nicht im Zusammenhang mit einer bekannten Krankheit vorhanden sind, aber taxonomische Arten und Gattungen zugeordnet werden kann 2 , 3 , 4. solche Ansätze zur Entdeckung und Kategorisierung des genetischen Materials in einer deutlichen Umgebung bieten die Möglichkeit, Virus-Vielfalt in der Natur oder ihre Präsenz in einem bestimmten Ökosystem beschreiben bestätigt jedoch nicht unbedingt zu einem Rahmen für die Festlegung kausale Agenten für eine offensichtliche Krankheit.
Gattung Badnavirus gehört zur Familie Caulimoviridae von Pararetroviruses. Diese Viren sind Bacilliform in Form mit kreisförmigen Doppelstrang DNA Genome von etwa 7 bis 9 kb. Alle Pararetroviruses werden durch ein RNA-Zwischenprodukt repliziert. Pararetroviruses gibt es als Episomes und unabhängig von der Pflanze chromosomale DNA-5,6zu replizieren. Feldstudien über Virus Populationen zeigen, dass diese Virus-Populationen genetisch komplexer sind. Darüber hinaus Informationen über eine Reihe von pflanzengenomen von Hochdurchsatz-Sequenzierung haben aufgedeckt, zahlreiche Beispiele von Badnavirus Genom Fragmente pflanzengenomen durch illegitime Integrationsveranstaltungen eingefügt. Diese endogene Badnavirus-Sequenzen sind nicht unbedingt in Zusammenhang mit Infektionen7,8,9,10,11. Anschließend wird die Verwendung von NGS, neue Badnaviruses als kausale Agent der Krankheit zu identifizieren durch die Teilgesamtheit Vielfalt episomal Genome sowie das Auftreten von endogenen Sequenzen12,13erschwert.
Zwar gibt es nicht eine optimale Pipeline für die Entdeckung von Roman Pararetrovirus Genomen, gibt es zwei Möglichkeiten, diese Viren als kausale Agenten für die Krankheit zu identifizieren. Eine Methode ist die Bereicherung für kleine RNA-Sequenzen aus den infizierten Blättern und dann montieren Sie diese Sequenzen um das Virus Genome(s)14,15,16,17wieder zusammenzusetzen. Ein weiterer Ansatz ist die rollenden Kreis Verstärkung (RCA), kreisförmige DNA-Virus Genome18zu verstärken. Der Erfolg von RCA hängt das Alter des Blattes und der Virustiter im ausgewählten Gewebe. Die RCA-Produkte sind Beschränkungsverdauung unterzogen und in Plasmide für direkte Sequenzierung19,20,21kloniert.
Canna gelbe Mottle virus (CaYMV) ist ein Badnavirus und wird beschrieben als die ätiologische Ursache der gelben Mottle Krankheit in Canna, obwohl nur ein 565 bp Fragment des Genoms von infizierten Cannas22zuvor isoliert wurde. Eine zeitgenössische Studie identifiziert CaYMV in Alpinia Purpurata (Blüte Ingwer; CaYMV-Ap)23. Das Ziel dieser Studie war, komplette Badnavirus Genomsequenzen von infizierten Canna Lilien zu erholen. Wir beschreiben ein Protokoll zum Virus von pflanzlichen Verunreinigungen zu reinigen, und dann isolieren virale DNA aus dieses Präparat und bereiten eine DNA-Bibliothek für den Einsatz in NGS. Dadurch entfällt die Notwendigkeit zwischen-Molekulare Verstärkung Schritte. Wir isolieren auch mRNA von infizierten Pflanzen für RNA-FF NGS, die RNA-Seq umfasst mit jeden Nukleinsäure-Vorbereitung durchgeführt wurde. Montierten Contigs befanden sich auf dem Badnavirus Taxon in beiden Datensätzen über das nationale Zentrum für Biotechnologie und Information (NCBI) grundlegende lokale Suche Ausrichtwerkzeug für Nukleinsäuren (BLASTn) beziehen. Wir ermittelten die Genome von zwei Badnavirus Arten24.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Mahlpuffer für die Virenaufreinigung</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>S0751</td><td>Mahlpuffer für die Virusaufreinigung</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Mahlpuffer für die Virusaufreinigung</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Homogenat-Extraktion&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X-100</td><td>Homogenat-Extraktion&nbsp;</td></tr><tr><td>Käsetuch</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Filter homogenat&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Pellet-Resuspension & DNA-Resuspensionspuffer</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Pellet-Resuspensionspuffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Stoppt Enzymreaktionen</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>DNA-Resuspensionspuffer</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Virionproteine auflösen</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Zelluläre DNA aus Extrakten abbauen</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Virus-DNA-Fällung</td></tr><tr><td>Labormixer</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Mahlen von Blattproben</td></tr><tr><td>Bodenmodell Ultrazentrifuge & Ti70 Rotor</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>Trennung von Zellextrakten</td></tr><tr><td>Zentrifuge nach Bodenmodell und JA-14 Rotor</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Trennung von Zellextrakten</td></tr><tr><td>Magnetische Rührplatte</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Einmischen von Harnstoff in Proben über</td></tr><tr><td>Nacht Gummipolizist</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Viruspellet auflösen</td></tr><tr><td> 2100 Bioanalysator Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare,</td><td>CA G2939BA</td><td>Empfindliche Detektion von DNA- und RNA-Qualität und -Quantität</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Mikrofluidik-Chip zum Bewegen, Färben und Messen der RNA-Qualität in einem 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive Chip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>Mikrofluidik-Chip zum Bewegen, Färben und Messen der DNA-Qualität in einem 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Nanotropfen-Spektralphotometer</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Analyse der DNA/RNA-Qualität in Zwischenschritten von Verfahren</td></tr><tr><td>Pflanzliches Gesamt-RNA-Isolierungskit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>Isolat RNA für RNA-seq</td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>Resuspension von DNA und RNA für</td>NGS-RNA-Konzentrator-Spin-Säule</tr><tr><td></td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>Vorbereiten von RNA für RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA-Entfernungskit</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>Vorbereiten von RNA für RNA-seq</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Vorbereiten von RNA für RNA-seq</td></tr><tr><td>&nbsp; RNA&nbsp; Anreicherungssystem</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>RNA für RNA-seq</td></tr><tr><td>Agarose vorbereiten&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Gelanalyse der DNA/RNA-Qualität in den Zwischenschritten des</td></tr><tr><td>Verfahrens Ethidiumbromid</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Agarose-Gelfärbung</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 kompetente Zellen</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Klonen von Genomfragmenten</td></tr><tr><td>pFU Taq-Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR Amplifikation des Virusgenoms</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR-Amplifikation des Virusgenoms</td></tr><tr><td>PCR-Oligonukleotide</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>Sonderanfertigung</td><td>PCR-Amplifikation des Virusgenoms</td></tr><tr><td>Miniprep DNA-Aufreinigungskit</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Plasmid-DNA-Aufreinigung vor der Sequenzierung</td></tr><tr><td>PCR-Clean-up-Kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Vorbereiten von PCR-Produkten für die Klonierung</td></tr><tr><td>pDRAW32-Software</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Computeranalyse von zirkulärer DNA und Motiven</td></tr><tr><td>MEGA6.0 Software</td><td>MEGA</td><td></td><td>Molekulare evolutionäre genetische Analyse</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; RiboGreen&Handel; RNA Assay Kit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Fluorometrische Bestimmung der RNA-Menge</td></tr><tr><td>GS Junior&trade; Pyrosequencing System</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>Sequenzierungsplattform</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>Reagenzien für die Emulsions-PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Reagenzien für die Bead-Rückgewinnung</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>Reagenzien für die Emulsions-PCR</td></tr><tr><td>GS Junior EmPCR Reagenzien (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996538001</td><td>Reagenzien für die Emulsions-PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Öl & Breaking Kit</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>Reagenzien für die Emulsions-PCR</td></tr><tr><td>GS Jr Titanium Sequenicing Kit*</td><td></td><td>Roche 5996554001</td><td>Enthält Sequenzierungsreagenzien, Enzyme, Puffer und Packungsperlen</td></tr><tr><td>GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td><td>Roche</td><td>5996619001</td><td>Sequencing Plate mit zugehörigen Reagenzien und Dichtungen</td></tr><tr><td>IKA Turrax Mischer</td><td></td><td>3646000</td><td>Spezialmischer für Turrax Röhrchen</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (Spezialmischer)</td><td></td><td>20003213</td><td>Spezialisierte Mischröhrchen mit Innenrotor zur Herstellung von Emulsionen</td></tr><tr><td>GS Vernebler Kit</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Nukleinsäuregrößenfraktionator für den Einsatz bei der Vorbereitung von Bibliotheken</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Bead Counter</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Library Bead</td></tr><tr><td>Counter GS Junior Bead Deposition Device</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Halter für Pikotiterplatte während der Zentrifugation</td></tr><tr><td>Gegengewicht & Adapter für die Bead-Depositioniergeräte</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Zum Ausbalancieren des Depositionsgeräts mit der Picotiterplattenzentrifugation</td></tr><tr><td>GS Junior Software</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>Software-Suite zur Steuerung des Instruments, zum Sammeln und Analysieren von Daten</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Enthalten in Artikel 05 996 643 001 oben)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Enthalten in Artikel 05 996 643 001 oben)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Enthalten in Artikel 05 996 643 001 oben)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Enthalten in Artikel 05 996 643 001 oben)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Enthalten in Artikel 05 996 643 001 oben)</td></tr></tbody></table>

kombination von analyse von dna in eine grobe virion-extraktion mit der analyse der rna aus den infizierten blättern, entdecken neue virus-genom

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Dieser Ansatz Metagenom wird verwendet, um Pflanzenviren mit kreisförmigen DNA Genome und ihre Zeugnisse zu identifizieren. Oft Pflanze DNA-Viren, die in niedrige Titer in ihrem Wirt auftreten oder können nicht mechanisch geimpft werden, auf einen anderen Host sind schwer zu propagieren, um eine höhere Titer von infektiösem Material zu erreichen. Infizierte Blätter sind Boden in einem milden Puffer mit optimalen pH-Wert und Ionischen Zusammensetzung empfohlen für die meisten Bacilliform Para Retroviren zu reinigen. Harnstoff wird verwendet, Einschlusskörperchen aufzubrechen, die Virionen Falle und zelluläre Komponenten auflösen. Differentielle Zentrifugation liefert weitere Trennung der Virionen von pflanzlichen Verunreinigungen. Proteinase K Behandlung entfernt dann die Capsids. Dann wird die virale DNA konzentriert und für Next Generation Sequencing (NGS) verwendet. Die NGS-Daten dienen zum montieren Contigs die eingereicht werden, NCBI-BLASTn, eine Teilmenge der Virus-Sequenzen in das generierte Dataset zu identifizieren. In einer parallelen Pipeline ist RNA isoliert aus den infizierten Blättern mit einer standard spaltenbasierten RNA Extraktionsmethode. Dann wird Ribosom Erschöpfung durchgeführt, um für eine Teilmenge von mRNA und Virus Transkripte zu bereichern. Montierte Sequenzen von RNA Sequenzierung (RNA-Seq) abgeleitet abgegeben NCBI-BLASTn, eine Teilmenge der Virus-Sequenzen in diesem Dataset zu identifizieren. In unserer Studie haben wir zwei verwandte in voller Länge Badnavirus Genome in den beiden Datensätzen identifiziert. Diese Methode wird bevorzugt, eine andere Möglichkeit die Gesamtbevölkerung von kleinen RNA-Sequenzen zur Pflanze Virus Genomsequenzen rekonstruieren extrahiert. Dieses letztere metagenomische Pipeline erholt sich Virus im Zusammenhang mit Sequenzen, die sind Retro-Transkription Elemente eingefügt in das pflanzliche Genom. Damit verbunden ist, Biochemische und molekulare Tests weiter aktiv Krankheitserreger zu erkennen. Der Ansatz in der vorliegenden Studie dokumentiert erholt sich Sequenzen Vertreter der Replikation von Viren, die wahrscheinlich aktive Virus-Infektion hinweisen.

Diese veränderten Virus Reinigung Methode bereitgestellt, eine Bereicherung des Virus DNA nützlich zur Identifikation von zwei Virus-Arten von NGS und Bioinformatik. Nachdem das Homogenat bei 40.000 x g für 2,5 h zentrifugiert wurde, gab es einen grünen Pellet am Boden des Röhrchens und einem weißen Pellet entlang der Länge. Das grüne Pellet wurde in einem Microcentrifuge Schlauch Nukleinsäuretablette und das weißen Pellet wurde in zwei Mikrozentrifugenröhrchen Nukleinsäuretablette. PCR wurde mit standard CaYMV PCR-Diagnostik-Primern durchgeführt, und Produkte wurden in die solubilized weißen Pellet und nicht die grüne Kugel (Abb. 1A) nachgewiesen. Ein Beispiel für die groben Vorbereitung war von Transmissions-Elektronenmikroskopie untersucht und wir beobachteten Bacilliform Partikel Messen 124-133 nm Länge (Abbildung 1B). Dies ist innerhalb der prognostizierten modal Länge von den meisten Badnaviruses. DNA wurde extrahiert aus der weißen und grünen Pellets und Nukleinsäuretablette getrennt. In Abbildung 1Cluden wir 5 µL DNA extrahiert von den grünen und weißen Pellet Probe (1,6 µg DNA für die grüne Fraktion) und 3,1 µg DNA für die weißen Bruchteil um 0,8 % Agarose gel Elektrophorese und analysierten die DNA nach Interkalation Bromid Färbung. Die grüne Fraktion enthaltenen niedermolekularen DNA, während der weiße Anteil zwei Bänder aus höherem Molekulargewicht DNA sowie das geringere Molekulargewicht DNA (Abbildung 1C) produziert. Das Gel, dargestellt in Abbildung 1C für 40 min. bei 100 V ausgeführt wurde und der Abstrich auf Spur 3 legt nahe, dass die Gel Spannung gesenkt werden sollte, um klarere Bands produzieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass die weiße Kugel für Virionen angereichert wurde. Die DNA (0,6 µg/mL) Konzentration der weißen Probe entnommen war gering, aber ausreichend für NGS, die erfordert ein Minimum von 10 ng DNA um fortzufahren. Fragmentierte DNA wurden verwendet, um eine Bibliothek auf NGS vorzubereiten.
Parallel wurde RNA aus infizierten Canna Pflanzen (Abbildung 1D) für Hochdurchsatz-RNA-FF gewonnen. Ein standard Workflow erfolgte für Bibliothek Vorbereitung, NGS, Erstellen von Contigs und virale Genomsequenzen (Abbildung 1E) zu identifizieren. Die Ausgangsresultate hindern, DNA und RNA als Ausgangsstoffe wurden verglichen.
Wir erhalten 188.626 rohe DNA liest von NGS mit DNA isoliert von der rohen Virus Vorbereitung. Liest in 13.269 Contigs versammelt waren und BLASTn wurde verwendet, um das NCBI-Dataset von Nukleotidsequenzen suchen (mit Viridplantae TaxID: 33090 und Virus USt: 10239 als begrenzenden Organismen) (Abbildung 1E). Die NCBI-BLASTn-Ergebnisse zeigten, dass 93 % der de Novo montiert Contigs zellulären Sequenzen waren, 22 % unbekannt waren, und 0,3 % Virus Contigs (Abb. 2A). Die Mehrheit der Contigs kategorisiert, wie zelluläre Sequenzen wie Mitochondrien identifiziert wurden oder Chloroplast DNA. Innerhalb des Datasets der Virus Contigs, 32 % der Virus Contigs wurden im Zusammenhang mit Mitgliedern des Caulimoviridae (die nicht Badnavirus Sequenzen waren) und 58 % davon wurden im Zusammenhang mit Badnavirus. Von dem Virus Contigs 29 % waren sehr ähnlich (e < 1 x 10-30), CaYMV isolieren V17 ORF3-gen (EF189148.1), Zuckerrohr-Bacilliform-Virus zu isolieren Batavia D, vollständige Genom (FJ439817.1), und Banane Streifen CA Virus komplette Genom ( KJ013511). Innerhalb dieser Population gab es lange Contigs, die zwei volle Länge Genome ähnelte.
Hochdurchsatz-RNA-Seq produziert 153.488 gereinigte einzelne Sequenz liest mit einer durchschnittlichen Länge von < 500 BP. Contig Montage lesen reduziert dies auf 8.243 Contigs. Diese wurden eingereicht, NCBI-BLASTn (mit Viridplantae TaxID: 33090 und Virus USt: 10239 als begrenzenden Organismen) und die Ausgänge platziert 76 % der Contigs in einer Kategorie Pflanze zellulären Sequenzen, 23 % waren unbekannt, und 0,1 % wurden als Virus Contigs (kategorisiert Abbildung 2 ( B). näherer Betrachtung der Bevölkerung die 0,1 % der Bevölkerung des Virus Contigs festgestellt, dass 68 % davon Caulimoviridae (Abbildung 2B) zugeordnet wurden. Drei große Contigs innerhalb dieser Population wurden mit hohen Ähnlichkeit identifiziert (e < 1 X 10-30), CaYMV isolieren V17 ORF3-gen (EF189148.1) Zuckerrohr Bacilliform-Virus zu isolieren, Batavia D, vollständige Genom (FJ439817.1) und Banane-Streifen CA-Virus vollständige Genom (KJ013511). Prüfung der drei Contigs, traten wir manuell zwei davon, eine Full-Length Virusgenom zu produzieren.
Wir verglichen die Virus-Genom Länge Contigs produziert von DNA und RNA Sequenzierung als gegenseitige Gerüst, das Vorhandensein von zwei Full-Length Virus Genome zu bestätigen. Eine Full-Length Virusgenom von 6.966 bp wurde vorläufig benannt Canna gelbe Mottle verbundenen Virus 1 (CaYMAV-1)(Abbildung 3). Das zweite Genom wurde 7.385 bp und eine Variante des CaYMV infizieren Alpinia Purpurata (CaYMV-Ap01)(Abbildung 3).
Zu guter Letzt PCR Zündkapseln, die entworfen wurden, um Klon ~ 1.000 bp Fragment von jedem Virus dienten differentiell beide Genome in einer Population von 227 Canna-Pflanzen für neun kommerziellen Sorten erkennen. In vielen Fällen wurden einzelne Pflanzen mit beiden Viren infiziert. Wir bieten ein Beispiel für RT-PCR-Nachweis von CaYMAV-1 und CaYMV-Ap01 in 12 Werken. Drei davon waren positiv nur für CaYMV-Ap01 und neun positiv für beide Viren (Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Abbildung 1 : Virus-Nukleinsäure-Vorbereitungen und NGS Workflow. (A) Agarose (1,0 %) gel-Elektrophorese von 565 bp-PCR-Fragmente von CaYMV Genomen. Zwei PCR-Produkte wurden in Proben aus der weißen Pellet (Bahnen 1, 2) vorbereitet, aber nicht in die grüne Pellet-Probe (Bahn 3) nachgewiesen. Positivkontrolle (+) stellt ein PCR-Produkt von infizierten Pflanzen-DNA, die mit einem automatisierten Verfahren mit standard paramagnetischen Zellulose Partikel isoliert wurde verstärkt. Lane L enthält die DNA-Leiter als Standard für die Messung der Größe des linearen DNA-Bänder in Probe Bahnen verwendet. (B) Beispiel der Viruspartikel von Transmissions-Elektronenmikroskopie im weißen Pellet erholt von Rohöl Fraktionierung von infizierten Canna Blätter angezeigt. (C) Agarose (0,8 %) gel-Elektrophorese von DNA erholte sich von den grünen (Spur 1) und weiß (Bahn 2) pellets, positiv getestet durch PCR im Bedienfeld "A." Die rote und gelbe Punkte neben Bahn 2 identifizieren zwei hochmolekularen DNA-Bänder, die in den weißen Bruch auftreten. (D) Agarose (1 %) gel-Elektrophorese von Gesamt-RNS durch spaltenbasierten RNA Reinigung wiederhergestellt. Lane L enthält die DNA-Leiter als Standard für die Messung der Größe des linearen Bändern in Probe Bahnen verwendet. Spur 1-6 enthält RNA isoliert von infizierten Canna Blätter, die zusammengefasst wurden auf eine einzelne Probe für Ribo-Erschöpfung und RNA-f (E) schematische Pipeline von Nukleinsäure-Isolationen, Bibliothek Vorbereitung, Sequenzierung, Contig Montage und Virusgenom Entdeckung. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Abbildung 2 : Krone Diagramme visualisieren die taxonomischen Kategorien von Contigs. (A) das Diagramm auf der linken Seite zeigt die Fülle und taxonomische Verteilung von Contigs aus Rohöl Virus Vorbereitung zusammengestellt. Das rechte Diagramm zeigt die Proportionen des Virus Contigs der Familie Caulimoviridae , Badnavirus Gattung und drei nah verwandte Arten zugeordnet. (B) zeigt das Panel auf der linken Seite die Fülle von Contigs RNA-Seq abgeleitet basierend auf deren taxonomische Verteilung. Auf der rechten Seite ist der Graph zeigt die Fülle von Contigs innerhalb der Bevölkerung des Virus Contigs der Familie Caulimoviridae , Badnavirus Gattung und drei nah verwandte Arten zugeordnet. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Abbildung 3 . Charakterisierung von CaYMAV-1 und CaYMV-Ap01 Genomen. (A) schematische Darstellung der Canna gelbe Mottle Virus 1 zuordnen (CaYMAV) und Canna gelbe Mottle Virus ähnlich wie das Genom isoliert von Alpinia Purpurata (CaYMV-Ap01). Nukleotid-Positionen 1-10 wird als Beginn des Genoms identifiziert und enthält eine tRNAtraf Anticodon Website typisch für die meisten Badnavirus Genomen. Stop und Start Positionen für die Übersetzung der offenen Leserahmen (ORF) 1 und 2 liegen. Diese Proteine haben unbekannte Funktionen. ORF3 ist ein funkionalen mit Zinkfinger (ZnF), Protease (Pro), Reverse Transkriptase (RT) und RNAse H-Domänen. Eine 3' poly(A) Signalsequenz ist für beide Virus-Genom erhalten. (B) RT-PCR-Analyse wurde durchgeführt mit RNA isoliert vom Virus infizierte Blätter und Grundierungen, die CaYMAV und CaYMV-Ap01 erkennen. In der gleichen Bevölkerung von 12 Pflanzen waren drei mit CaYMV-Ap01 nur infiziert während der verbleibenden mit CaYMAV und CaYMV-Ap01 infiziert waren. (+) zeigt positive Kontrolle und (-) zeigt negative Kontrolle. Diese Zahl ist von Wijayasekara Et Al. reproduziert/geändert 24 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Umweltvirologie beantworten, beispielsweise zur Entstehung neuer Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, Virusvarianten von zellulären Bestandteilen zu reinigen und diese Varianten anschließend zur DNA-Extraktion für die Sequenzierung zu nutzen. Auf diese Idee kam ich, als wir feststellten, dass die Pflanzen in unseren Gewächshäusern mit einem oder mehreren unbekannten Badnaviren infiziert waren. Personen, die mit dieser Methode erstmals arbeiten, werden aus drei Gründen Schwierigkeiten haben. Erstens ist die Homogenisierung ein entscheidender Schritt, um eine hohe Ausbeute zu gewährleisten. Zweitens kann die Differenzialzentrifugation mehrere Pellets erzeugen, und es ist wichtig zu wissen, wie man diese identifiziert und voneinander trennt. Drittens kann die Auswertung des Bio-Analysators ebenfalls schwierig sein.Bei allen Schritten dieses Verfahrens sollten ein Laborkittel und Handschuhe getragen werden. Schneiden Sie zunächst 80 bis 100 Gramm Blätter von zuvor bei minus 20 Grad Celsius eingefrorenen befallenen Pflanzen ab. Anschließend werden die Blätter in einem Waring-Mixer mit 200 Milliliter Pufferlösung und 0,5 % Natriumsulfit gemahlen. Überführen Sie das Homogenat in einen Ein-Liter-Becher. Unter weiterhin angemessener persönlicher Schutzausrüstung 18 Gramm Harnstoff und 25 Milliliter 10%igen nichtionischen Detergens zum Homogenat geben und das Becherglas mit Aluminiumfolie abdecken. Über Nacht mit einem magnetischen Rührer umrühren. Am folgenden Tag das Homogenat in 250-Milliliter-Zentrifugenrotorflaschen überführen und in einem Festwinkelrotor bei 4000 × g und vier Grad Celsius 10 Minuten lang zentrifugieren. Das Überstandsvolumen gewinnen und durch vier Lagen Mulltuch filtrieren. Das Volumen des gewonnenen flüssigen Homogenats messen und anschließend das Homogenat auf 38,5-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen verteilen. Das Homogenat bei 40.000 × g und vier Grad Celsius 2,5 Stunden lang zentrifugieren. Nach Beendigung der Zentrifugation auf das Vorhandensein eines grünen Pellets am Boden des Röhrchens sowie eines weißen Pellets entlang der Seitenwand des Röhrchens prüfen. Den Überstand vorsichtig abgießen, wobei beide Pellets zurückbehalten werden, und die Proben auf Eis stellen. Die Trennung des weißen und des grünen Pellets ist einer der anspruchsvollsten Schritte des Verfahrens. Sie erfordert Geduld und Geschick.Arbeiten Sie in einer chemischen Abzugshaube und verwenden Sie einen Gummispatel, um die Pellets zu trennen. Kratzen Sie die Pellets ab und überführen Sie sie in verschiedene Rotorkolben. Stellen Sie die Rotorkolben mit den weißen Pellets auf Eis. Geben Sie je einen Milliliter Wasser hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab. Pipettieren Sie im Abstand von jeweils fünf Minuten über einen Zeitraum von ein bis zwei Stunden die Mischung mehrmals auf und ab, um das Pellet erneut zu suspendieren. Nachdem die weißen Pellets erneut suspendiert wurden, lagern Sie die Suspensionen über Nacht bei vier Grad Celsius.Am folgenden Tag die Suspension bei 6000 × g und vier Grad Celsius zehn Minuten lang zentrifugieren, um das verbleibende Zelltrümmermaterial zu entfernen. Die konzentrierten Suspensionen in neue Röhrchen überführen und bei 136.000 × g und vier Grad Celsius zwei Stunden lang zentrifugieren, um die Virionen zu pelletieren. Das Überstand entfernen und das Pellet in einem Milliliter Puffer erneut suspendieren.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Zerstörung der Virionen. Geben Sie vierzig Mikroliter einer Proteinase-K-Lösung mit zwei Mikrogramm pro Mikroliter zum Pellettansatz hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie zu jeder Probe ein Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und schütteln Sie per Hand 20 Sekunden lang.Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur mit 16.000 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie die obere wässrige Phase und überführen Sie sie in ein neues Gefäß. Wiederholen Sie diese Extraktion zwei- oder mehrmals.Konzentrieren Sie die DNA durch Ethanolpräzipitation. Verwenden Sie 0,3 M Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Volumina 95 %igen Ethanol. Stellen Sie die Proben für 30 bis 60 Minuten auf minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend 10 bis 20 Minuten bei 13.000 × g, um die DNA zu pelletieren. Am Laborplatz arbeiten und das DNA-Pellet in einem Milliliter 0,1 Millimolarer TE-Pufferlösung resuspendieren. Die Suspension durch eine kommerzielle Gelfiltrationssäule mittels Zentrifugation filtrieren. Die Proben durch 1 %ige Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung einer Ethidiumbromid-Färbung analysieren, um die Qualität der Präparationen zu beurteilen und die DNA-Qualität wie im Text beschrieben zu bewerten. Bei Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie waren Viruspartikel im weißen Pellet vorhanden, das durch eine grobe Fraktionierung infizierter Canna-Blätter gewonnen wurde. Die Agarosegelelektrophorese der aus den grünen und weißen Pellets isolierten DNA wies in der weißen Fraktion zwei DNA-Banden mit hohem Molekulargewicht nach, die durch die roten und gelben Punkte markiert sind.Die Integrität der aus infizierten Blättern isolierten RNA wurde ebenfalls durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Dieses Diagramm zeigt die Häufigkeit und taxonomische Verteilung der aus der rohen Viruspräparation zusammengesetzten Contigs. Und dieses Diagramm veranschaulicht die Anteile der Virus-Contigs, die der Familie Caulimoviridae, der Gattung Badnavirus sowie Contigs, die mit drei eng verwandten Arten assoziiert sind, zugeordnet werden können.Die nächsten beiden Diagramme zeigen die Häufigkeit von aus der RNA-Sequenzierung gewonnenen Contigs basierend auf ihrer taxonomischen Verteilung. Das rechte Diagramm zeigt die Häufigkeit von Contigs innerhalb der Population von Virus-Contigs, die der Familie Caulimoviridae, der Gattung Badnavirus und drei eng verwandten Arten zugeordnet sind. Der Vergleich der durch DNA- und RNA-Sequenzierung erzeugten Virusgenomlängen-Contigs als gegenseitiges Gerüst bestätigt das Vorhandensein von zwei vollständigen Virusgenomen.Schließlich wurde mittels RT-PCR-Analyse unter Verwendung von aus virusinfizierten Blättern isolierter RNA die Genome beider Viren nachgewiesen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie zwei Tage in Anspruch nehmen, während ein Anfänger möglicherweise drei Tage benötigt. Wenn dieses Verfahren zum ersten Mal durchgeführt wird, ist es wichtig, die Volumina des Homogenats in jedem der Überstände zu dokumentieren, sodass am Ende des Verfahrens die endgültige DNA-Ausbeute mit dem ursprünglichen Ausgangsmaterial verglichen werden kann.Seit ihrer Entdeckung hat diese Methode den Weg in der Pflanzenvirologie geebnet, um neue DNA-Viren in der Umwelt zu identifizieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pflanzliches Material homogenisiert, Varianten anreichert und eine gute DNA-Ausbeute erhält, die für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Harnstoff und Phenol-Chloroform äußerst gefährlich ist, und stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel sowie einer Maske getroffen werden sollten, wenn Sie mit diesen Chemikalien arbeiten. Für eine sichere Ultrazentrifugation ist es wichtig, die Röhrchen korrekt auszubalancieren; dazu müssen Sie sie wiegen und gegenüberliegend im Rotor platzieren, wobei das Gewicht der Röhrchen maximal um 0,01 voneinander abweichen darf.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2

Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression. Teil 3 beschreibt den Prozess der Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA aus beiden Gastgeber und virale Proben durch Amino Allyl-Kupplung von Farbstoffen.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3

Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Eine einfache, effiziente und robuste Art, die Bereitstellung von mehreren viralen Komponenten auf Pflanzenzellen zu synchronisieren...

Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Wir bieten eine neuartige Strategie zur Isolierung von viralen Replikationskompartimenten (RC) aus Adenoviren (Ad)-infizierten menschlichen Zellen an. Dieser Ansatz stellt ein zellfreies System dar, das dazu beitragen kann, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die Replikation und Expression des viralen Genoms sowie die Regulation der am RC etablierten Virus-Wirt-Interaktionen regulieren.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Hier präsentieren wir einen Tiefe Sequenzierung Ansatz, der eine objektive Bestimmung der im Entstehen begriffenen 3'-Termini sowie mutagenen Profile der einzelsträngigen DNA-Moleküle enthält. Die Hauptanwendung ist die Charakterisierung der im Entstehen begriffenen retrovirale ergänzende DNAs (cDNAs), die Zwischenprodukte, die während des Prozesses der retroviralen reversen Transkription generiert.

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Virusinfektion in Vivo in Drosophila Melanogaster mit dem Nano-Injektionsverfahren und Grundtechniken zu Virus-Wirt Interaktionen analysieren zu etablieren.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Lernen Sie eine Methode zur Isolierung und Sequenzierung pflanzlicher DNA-Viren aus infizierten Blättern. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung neuer Viren der Familie Caulimoviridae für die Umweltvirologie.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom (Video) | JoVE Journal

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

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