Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Umweltvirologie beantworten, beispielsweise zur Entstehung neuer Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, Virusvarianten von zellulären Bestandteilen zu reinigen und diese Varianten anschließend zur DNA-Extraktion für die Sequenzierung zu nutzen. Auf diese Idee kam ich, als wir feststellten, dass die Pflanzen in unseren Gewächshäusern mit einem oder mehreren unbekannten Badnaviren infiziert waren. Personen, die mit dieser Methode erstmals arbeiten, werden aus drei Gründen Schwierigkeiten haben. Erstens ist die Homogenisierung ein entscheidender Schritt, um eine hohe Ausbeute zu gewährleisten. Zweitens kann die Differenzialzentrifugation mehrere Pellets erzeugen, und es ist wichtig zu wissen, wie man diese identifiziert und voneinander trennt. Drittens kann die Auswertung des Bio-Analysators ebenfalls schwierig sein.

Bei allen Schritten dieses Verfahrens sollten ein Laborkittel und Handschuhe getragen werden. Schneiden Sie zunächst 80 bis 100 Gramm Blätter von zuvor bei minus 20 Grad Celsius eingefrorenen befallenen Pflanzen ab. Anschließend werden die Blätter in einem Waring-Mixer mit 200 Milliliter Pufferlösung und 0,5 % Natriumsulfit gemahlen. Überführen Sie das Homogenat in einen Ein-Liter-Becher.

Unter weiterhin angemessener persönlicher Schutzausrüstung 18 Gramm Harnstoff und 25 Milliliter 10%igen nichtionischen Detergens zum Homogenat geben und das Becherglas mit Aluminiumfolie abdecken. Über Nacht mit einem magnetischen Rührer umrühren. Am folgenden Tag das Homogenat in 250-Milliliter-Zentrifugenrotorflaschen überführen und in einem Festwinkelrotor bei 4000 × g und vier Grad Celsius 10 Minuten lang zentrifugieren. Das Überstandsvolumen gewinnen und durch vier Lagen Mulltuch filtrieren. Das Volumen des gewonnenen flüssigen Homogenats messen und anschließend das Homogenat auf 38,5-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen verteilen. Das Homogenat bei 40.000 × g und vier Grad Celsius 2,5 Stunden lang zentrifugieren. Nach Beendigung der Zentrifugation auf das Vorhandensein eines grünen Pellets am Boden des Röhrchens sowie eines weißen Pellets entlang der Seitenwand des Röhrchens prüfen. Den Überstand vorsichtig abgießen, wobei beide Pellets zurückbehalten werden, und die Proben auf Eis stellen.

Die Trennung des weißen und des grünen Pellets ist einer der anspruchsvollsten Schritte des Verfahrens. Sie erfordert Geduld und Geschick.

Arbeiten Sie in einer chemischen Abzugshaube und verwenden Sie einen Gummispatel, um die Pellets zu trennen. Kratzen Sie die Pellets ab und überführen Sie sie in verschiedene Rotorkolben. Stellen Sie die Rotorkolben mit den weißen Pellets auf Eis. Geben Sie je einen Milliliter Wasser hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab. Pipettieren Sie im Abstand von jeweils fünf Minuten über einen Zeitraum von ein bis zwei Stunden die Mischung mehrmals auf und ab, um das Pellet erneut zu suspendieren. Nachdem die weißen Pellets erneut suspendiert wurden, lagern Sie die Suspensionen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am folgenden Tag die Suspension bei 6000 × g und vier Grad Celsius zehn Minuten lang zentrifugieren, um das verbleibende Zelltrümmermaterial zu entfernen. Die konzentrierten Suspensionen in neue Röhrchen überführen und bei 136.000 × g und vier Grad Celsius zwei Stunden lang zentrifugieren, um die Virionen zu pelletieren. Das Überstand entfernen und das Pellet in einem Milliliter Puffer erneut suspendieren.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Zerstörung der Virionen. Geben Sie vierzig Mikroliter einer Proteinase-K-Lösung mit zwei Mikrogramm pro Mikroliter zum Pellettansatz hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie zu jeder Probe ein Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und schütteln Sie per Hand 20 Sekunden lang.

Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur mit 16.000 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie die obere wässrige Phase und überführen Sie sie in ein neues Gefäß. Wiederholen Sie diese Extraktion zwei- oder mehrmals.

Konzentrieren Sie die DNA durch Ethanolpräzipitation. Verwenden Sie 0,3 M Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Volumina 95 %igen Ethanol. Stellen Sie die Proben für 30 bis 60 Minuten auf minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend 10 bis 20 Minuten bei 13.000 × g, um die DNA zu pelletieren.

Am Laborplatz arbeiten und das DNA-Pellet in einem Milliliter 0,1 Millimolarer TE-Pufferlösung resuspendieren. Die Suspension durch eine kommerzielle Gelfiltrationssäule mittels Zentrifugation filtrieren. Die Proben durch 1 %ige Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung einer Ethidiumbromid-Färbung analysieren, um die Qualität der Präparationen zu beurteilen und die DNA-Qualität wie im Text beschrieben zu bewerten.

Bei Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie waren Viruspartikel im weißen Pellet vorhanden, das durch eine grobe Fraktionierung infizierter Canna-Blätter gewonnen wurde. Die Agarosegelelektrophorese der aus den grünen und weißen Pellets isolierten DNA wies in der weißen Fraktion zwei DNA-Banden mit hohem Molekulargewicht nach, die durch die roten und gelben Punkte markiert sind.

Die Integrität der aus infizierten Blättern isolierten RNA wurde ebenfalls durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Dieses Diagramm zeigt die Häufigkeit und taxonomische Verteilung der aus der rohen Viruspräparation zusammengesetzten Contigs. Und dieses Diagramm veranschaulicht die Anteile der Virus-Contigs, die der Familie Caulimoviridae, der Gattung Badnavirus sowie Contigs, die mit drei eng verwandten Arten assoziiert sind, zugeordnet werden können.

Die nächsten beiden Diagramme zeigen die Häufigkeit von aus der RNA-Sequenzierung gewonnenen Contigs basierend auf ihrer taxonomischen Verteilung. Das rechte Diagramm zeigt die Häufigkeit von Contigs innerhalb der Population von Virus-Contigs, die der Familie Caulimoviridae, der Gattung Badnavirus und drei eng verwandten Arten zugeordnet sind. Der Vergleich der durch DNA- und RNA-Sequenzierung erzeugten Virusgenomlängen-Contigs als gegenseitiges Gerüst bestätigt das Vorhandensein von zwei vollständigen Virusgenomen.

Schließlich wurde mittels RT-PCR-Analyse unter Verwendung von aus virusinfizierten Blättern isolierter RNA die Genome beider Viren nachgewiesen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie zwei Tage in Anspruch nehmen, während ein Anfänger möglicherweise drei Tage benötigt. Wenn dieses Verfahren zum ersten Mal durchgeführt wird, ist es wichtig, die Volumina des Homogenats in jedem der Überstände zu dokumentieren, sodass am Ende des Verfahrens die endgültige DNA-Ausbeute mit dem ursprünglichen Ausgangsmaterial verglichen werden kann.

Seit ihrer Entdeckung hat diese Methode den Weg in der Pflanzenvirologie geebnet, um neue DNA-Viren in der Umwelt zu identifizieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pflanzliches Material homogenisiert, Varianten anreichert und eine gute DNA-Ausbeute erhält, die für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Harnstoff und Phenol-Chloroform äußerst gefährlich ist, und stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel sowie einer Maske getroffen werden sollten, wenn Sie mit diesen Chemikalien arbeiten. Für eine sichere Ultrazentrifugation ist es wichtig, die Röhrchen korrekt auszubalancieren; dazu müssen Sie sie wiegen und gegenüberliegend im Rotor platzieren, wobei das Gewicht der Röhrchen maximal um 0,01 voneinander abweichen darf.