Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Umweltvirologie zu beantworten, wie z. B. das Auftreten neuer Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, Varianten von zellulären Bestandteilen zu reinigen und diese Varianten zur Extraktion von DNA für die Sequenzierung zu verwenden. Auf diese Idee kam ich erst, als wir herausfanden, dass die Pflanzen in unseren Gewächshäusern mit einem oder mehreren unbekannten Badnaviren infiziert sind.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden aus drei Gründen Schwierigkeiten haben. Erstens ist die Homogenisierung ein entscheidender Schritt, um qualitativ hochwertige Erträge zu gewährleisten. Zweitens kann die Differenzzentrifugation mehrere Pellets erzeugen, und Sie müssen wissen, wie Sie diese Pellets identifizieren und trennen können.

Drittens kann der Bioanalysator auch schwer zu interpretieren sein. Für alle Schritte dieses Verfahrens sollten ein Laborkittel und Handschuhe getragen werden. Beginnen Sie damit, 80 bis 100 Gramm Blätter von kranken Pflanzen abzuschneiden, die zuvor bei minus 20 Grad Celsius eingefroren wurden.

Mahlen Sie dann die Blätter in einem Waring-Mixer mit 200 Millilitern Mahlpuffer und 0,5 % Natriumsulfit. Das Homogenat in ein Ein-Liter-Becherglas umfüllen. Geben Sie in entsprechender persönlicher Schutzausrüstung 18 g Harnstoff und 25 Milliliter 10 % nichtionisches Reinigungsmittel in das Homogenat und decken Sie das Becherglas mit Folie ab.

Mit einem Magnetrührer über Nacht umrühren. Am nächsten Tag wird das Homogenat in 250-Milliliter-Zentrifugenrotorflaschen umgefüllt und in einem Festwinkelrotor bei 4000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugiert. Den Überstand zurückgewinnen und durch vier Schichten Käsetuch filtrieren.

Messen Sie das Volumen des zurückgewonnenen flüssigen Homogenats und verteilen Sie das Homogenat dann auf 38,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Das Homogenat wird bei 40.000 g bei vier Grad Celsius für 2,5 Stunden zentrifugiert. Wenn die Zentrifuge fertig ist, prüfen Sie, ob sich ein grünes Kügelchen am Boden des Röhrchens und ein weißes Kügelchen entlang der Länge des Röhrchens befindet.

Gießen Sie den Überstand ab, behalten Sie beide Pellets und legen Sie die Proben auf Eis. Die Trennung des weißen und des grünen Pellets ist einer der schwierigsten Schritte des Verfahrens. Es erfordert Geduld und Geschick.

Wenn Sie in einer chemischen Haube arbeiten, verwenden Sie einen Gummipolizisten, um die Pellets zu trennen. Kratzen Sie die Pellets ab und füllen Sie sie in verschiedene Rotorflaschen. Stellen Sie die Rotorflaschen mit den weißen Pellets auf Eis.

Geben Sie einen Milliliter Wasser in jede Flasche und pipettieren Sie auf und ab. Pipettieren Sie die Mischung alle fünf Minuten über einen Zeitraum von ein bis zwei Stunden auf und ab, um das Pellet wieder zu suspendieren. Nachdem die weißen Pellets wieder aufgehängt wurden, halten Sie die Suspensionen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Suspension bei 6000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die restlichen Rückstände zu entfernen. Die konzentrierten Suspensionen werden in neue Röhrchen überführt und zwei Stunden lang bei 136.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um Virionen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter Puffer.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Virionen aufbrechen. Geben Sie vier Mikroliter einer Proteinase-K-Lösung von zwei Mikrogramm pro Mikroliter zu den Pelletsuspensionen und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Jeder Probe wird ein Volumen Phenolchloroform-Isoamylalkohol zugesetzt und 20 Sekunden lang von Hand geschüttelt.

Bei Raumtemperatur bei 16.000 g fünf Minuten lang zentrifugieren. Entfernen Sie die obere wässrige Phase und geben Sie sie in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie diese Extraktion zwei- oder mehrmal.

Konzentrieren Sie die DNA durch Ethanolfällung. Verwenden Sie 0,3 molar Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Volumen 95%iges Ethanol. Platzieren Sie die Proben 30 bis 60 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie dann 10 bis 20 Minuten lang bei 13.000 g g, um die DNA zu pelletieren. Arbeiten Sie an einem Labortisch und suspendieren Sie das DNA-Pellet in einem Milliliter 0,1 Millimolar TE-Puffer. Filtrieren Sie die Suspension durch Zentrifugation durch eine handelsübliche Gelfiltrationskolonne.

Analysieren Sie die Proben mittels 1%Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung von Ethidiumbromid-Färbung, um die Qualitätspräparate zu betrachten und die Qualität der DNA, wie im Text beschrieben, zu beurteilen. Bei der Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie waren Viruspartikel in dem weißen Pellet vorhanden, das durch grobe Fraktionierung infizierter Canna-Blätter gewonnen wurde. Die Agarose-Gelelektrophorese der DNA, die aus den grünen und weißen Kügelchen gewonnen wurde, identifizierte zwei hochmolekulare DNA-Banden in der weißen Fraktion, die durch die roten und gelben Punkte gekennzeichnet sind.

Die Integrität der aus infizierten Blättern isolierten RNA wurde ebenfalls durch verifizierte Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Dieses Diagramm zeigt die Abundanz und taxonomische Verteilung der Contigs, die aus der rohen Viruspräparation zusammengestellt wurden. Und diese Grafik zeigt die Anteile der Virus-Contigs, die mit der Familie der Caulimoviridae, der Gattung Badnavirus assoziiert sind, und der Contigs, die mit drei eng verwandten Arten assoziiert sind.

Die nächsten beiden Diagramme zeigen die Häufigkeit von Contigs, die aus der RNA-Sequenzierung abgeleitet wurden, basierend auf ihrer taxonomischen Verteilung. Die Grafik auf der rechten Seite zeigt die Häufigkeit von Contigs innerhalb der Population von Virus-Contigs, die mit der Familie der Caulimoviridae, der Gattung Badnavirus, und drei eng verwandten Arten assoziiert sind. Der Vergleich der Virusgenomlängen-Contigs, die durch DNA- und RNA-Sequenzierung als gegenseitiges Gerüst erzeugt werden, bestätigt das Vorhandensein von zwei Virusgenomen in voller Länge.

Schließlich wurden durch RT-PCR-Analysen mit RNA, die aus virusinfizierten Blättern isoliert wurde, beide Virusgenome nachgewiesen. Einmal gemeistert, kann diese Technik zwei Tage dauern, während ein Anfänger drei Tage brauchen kann. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal durchführen, ist es wichtig, Aufzeichnungen über das Homogenatvolumen in jedem der Überstände zu führen, damit Sie am Ende des Verfahrens die endgültige DNA-Ausbeute mit dem ursprünglichen Ausgangsmaterial vergleichen können.

Nach ihrer Entdeckung hat diese Methode den Weg auf dem Gebiet der Pflanzenvirologie für Forscher geebnet, um neue DNA-Viren in der Umwelt zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pflanzenmaterial homogenisiert, Varianten konzentriert und eine gute DNA-Ausbeute erzielt, die für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Harnstoff und Phenolchloroform äußerst gefährlich ist und eine Vorsichtsmaßnahme wie das Tragen einer Schutzbrille, einer Bluse und eines Laborkittels sowie einer Maske immer getragen werden sollte, wenn Sie mit diesen Chemikalien arbeiten.

Für eine sichere Ultrazentrifugation ist es wichtig, die Röhrchen richtig auszubalancieren, daher müssen Sie sie wiegen und gegenüberliegend in der Wippe platzieren, da das Gewicht zwischen 0,01 liegen sollte.