Eine Invasive Methode zur Aktivierung der Maus Dentate Gyrus durch hochfrequente Stimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirkung von hochfrequenter Stimulation auf die neuronale Aktivität in der Neurogenese zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in einem abgestimmten zellulären und molekularen Mechanismus der hochfrequenten tiefen Hirnstimulation zu beantworten, wie z.B. die Induktion der Neuronenaktivität und die Neurogenese im Hippocampus. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die starke Wirkung der hochfrequenten TBS auf die Neuronenaktivität und die Neurogenese im erwachsenen Gehirn demonstriert.

Obwohl diese Methode Aufschluss über die Auswirkungen der hochfrequenten TBS auf den Gyrus dentatus der Maus geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie die Basalganglien und die subthalamischen Regionen für die Erkrankungen des Gehirns in der Klinik angewendet werden. Um diesen Vorgang zu starten, platzieren Sie eine betäubte Maus auf dem stereotaktischen Rahmen. Richten Sie die Ohrbänder an seinem Kopf aus und ziehen Sie sie vorsichtig fest, um den zentrierten Kopf zu stützen.

Fassen Sie die Haut vor den Ohren und entfernen Sie etwa einen Quadratzentimeter davon über dem Schädel. Entfernen Sie dann den Muskel und andere Ansätze, die über dem Schädel liegen, mit einem Wattestäbchen, um die Schädeloberfläche freizulegen. Tragen Sie anschließend Wasserstoffperoxidlösung auf, um den Schädel zu trocknen, um die sagittalen und Lambda-Nahtlinien zu identifizieren.

Identifizieren Sie dann das Bregma und das Lambda. Der Bregma-Punkt wird als ursprünglicher Punkt verwendet, um die Position des Zellkerns festzulegen. Nivellieren Sie danach den Schädel auf der horizontalen Ebene mit diesen beiden Punkten.

Achten Sie darauf, dass die Höhen dieser beiden Punkte in der dorsalen Bauchebene nahezu gleich sind. Achten Sie außerdem darauf, dass der Schädel in der medialen lateralen Ebene nivelliert ist. Montieren Sie als Nächstes eine selbstgemachte Zweikanal-Mikrodrahtelektrode aus Kupfer in den rotierenden Elektrodenhalter am stereotaktischen Operationsrahmen.

Platzieren Sie die Elektrode direkt über dem Bregma und stellen Sie sie als Originalstelle ein. Bewegen Sie dann die Elektrode vorsichtig in die richtige Position über dem Schädel, ohne ihn zu berühren. Verwenden Sie die Digitalanzeige am stereotaktischen Operationsrahmen, um die vordere, hintere, mediale laterale und dorsoventrale Position anzuzeigen.

Wenn die gewünschte Stelle für das Einführen der Elektrode identifiziert ist, markieren Sie die Position mit einer schwarzen Markierung. Verwenden Sie anschließend die dorsoventralen stereotaktischen Anpassungen, um den Elektrodenhalter anzuheben. Sterilisieren Sie dann den Bohrer mit 70 % Ethanol.

Verwenden Sie einen handgeführten Bohrer mit Mikromanipulator-Unterstützung und bohren Sie ein Bohrloch genau an der markierten Position. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um Blutungen während der Operation zu stoppen. Bohren Sie weiter, bis Dura freigelegt ist.

Verwenden Sie eine gebogene Nadel, um alle Knochenreste zu entfernen, die während des Bohrens entstehen, und machen Sie ein Nadelloch in die Dura, ohne das darunter liegende weiche Hirngewebe zu beschädigen. Um zu bestätigen, dass das Fräsloch an der gewünschten Position richtig ausgeführt wurde, senken Sie die Elektrode ab, um sicherzustellen, dass sie sanft durch das Fräsloch eingeführt wird, ohne ein Hindernis zu berühren. Wenn kein Widerstand erkannt wird, führen Sie die Elektrode langsam bis zur Zieltiefe von der Schädeloberfläche ein.

Tragen Sie dann Zahnzement mit einem kleinen Spatel auf, um die Elektrode an Ort und Stelle zu halten. Wenn der Zement eindickt, formen Sie ihn um die eingesetzte Elektrode und andere Knochenschrauben, um eine schöne, glatte Kappe zu bilden. Lösen Sie anschließend die Elektrode vom Elektrodenhalter.

Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen, und setzen Sie sie wieder in einen warmen Käfig ein. Lassen Sie die Maus frei bewegen und lassen Sie sie sich zwei Tage lang im Käfig erholen. Um eine Stimulation abzugeben, verbinden Sie die implantierte Elektrode über Kabel mit einem programmierbaren Stimulator.

Richten Sie die Softwareschnittstelle ein. Stellen Sie dann die HFS-Parameter als sechs Serien von sechs Zügen mit sechs Impulsen bei 400 Hertz und die Stimulationsintensität von 200 Milliampere ein. Stellen Sie HFS für den gewünschten Zeitraum bereit, wie es eingerichtet ist.

Für die Kontrollgruppe implantieren Sie Elektroden in die Mäuse, ohne eine Stimulation abzugeben. Für die CFAS-Färbung stimulieren Sie die Versuchsmäuse zweimal für einen Tag. Für die BrdU-Markierung wenden Sie geeignete Stimulationen sowohl auf die akute als auch auf die chronische Stimulationsgruppe an.

Vergewissern Sie sich während der Stimulation, dass die Maus wach ist. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass die Kabel nicht verdreht sind. Wenn die Stimulation abgeschlossen ist, trennen Sie vorsichtig den Elektrodenstift vom Elektrodenhalter im Anschluss des Aufnahmesystems.

Für das CFAS und die Kerbe einer Färbung, etwa drei Stunden nach dem letzten HFDBS, betäuben Sie die Mäuse durch Injektion von Pentobarbital, um eine chirurgische Anästhesieebene zu erreichen. Für die BrdU-Markierung etwa 12 Stunden nach der letzten HFDBS-Stimulation werden der Kontroll- und den stimulierten Mäusen im Abstand von zwei Stunden sechs Injektionen BrdU verabreicht. 36 Stunden nach der letzten Injektion betäuben Sie die Mäuse tief mit Pentobarbital und transkardial mit 50 Millilitern kaltem PBS, gefolgt von 50 Millilitern kaltem 4%-Paraformaldehyd.

Entferne seinen Kopf und mache einen Schnitt in die Haut, um die Fertigkeit freizulegen. Schlagen Sie mit einer Pinzette den Schädel leicht ab und entfernen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn. Dann wird das Gehirn für weitere zwei Tage mit 4 % Paraformaldehyd versorgt und über Nacht in eine 30 %ige Saccharoselösung bei vier Grad Celsius überführt.

Schneiden Sie das Gehirn mit einem Kryostaten in 20 Mikrometer große koronale Schnitte. Übertragen und montieren Sie die Abschnitte mit einer Bürste auf den Glasträger und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Übertragen Sie anschließend die Objektträger in normales PBS, das kein Fixiermittel enthält.

Waschen Sie die Abschnitte drei- bis viermal jeweils fünf Minuten lang mit PBS, um überschüssiges Fixiermittel zu entfernen. Für die BrdU-markierte Gruppe inkubieren Sie die Abschnitte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in zwei molaren HCL und spülen Sie sie in einem 0,1 molaren Boratpuffer. Waschen Sie die Abschnitte nach 10 Minuten zweimal jeweils fünf Minuten lang in PBS.

Anschließend werden die Abschnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Blockierlösung inkubiert. Inkubieren Sie dann die Schnitte mit polyklonalen Anti-CFAS-Antikörpern, Anti-Notch-One-Antikörpern oder Anti-BrdU-Antikörpern in einer Blockierungslösung bei vier Grad Celsius über Nacht. Wurden die Abschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in PBS inkubiert, dann inkubierten sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 568 konjugiertem Anti-Rabiat, Alexa Fluor 488 konjugiertem Anti-Ziegen-Antikörper oder Alexa Fluor 488 konjugiertem Anti-Ratten-Sekundärantikörper.

War die Sektionen dreimal in PBS für jeweils 10 Minuten. Decken Sie anschließend die immunmarkierten Hirnabschnitte mit einem Antifading-Reagenz-Einbettmedium ab, das DAPI enthält. Lassen Sie die Abschnitte an der Luft trocknen und lagern Sie sie lichtgeschützt bei vier Grad Celsius.

Hier ist ein experimentelles Paradigma für die HFS-Behandlung bei der Erzeugung von BrdU-markierten proliferierenden Neuronen in der DG dargestellt. Die Tiere wurden in eine akute und eine chronische Gruppe eingeteilt, um unterschiedliche Stimulationsmuster zu erhalten. Danach wurde den Tieren beider Gruppen am sechsten Tag BrdU injiziert. Am achten Tag wurden die Tiere betäubt und für die Vorbereitung von Kryostatenschnitten aufgegossen.

Hier sind die Bilder der BrdU-Immunfluoreszenzfärbung nach HFDBS in der DG. Eine quantitative Analyse der neuronalen Produktion deutete darauf hin, dass die akute Stimulation in der DG die Neurogenese nicht fördern konnte. Während die chronische Stimulation in der DG die Neurogenese deutlich nach oben regulierte. Im Vergleich zur Kontrollgruppe stieg die Anzahl der BrdU-Markierungszellen in der chronischen Gruppe signifikant an, sowohl in der ipsilateralen als auch in der kontralateralen Hemisphäre.

Dies sind die Bilder der BrdU-Immunfluoreszenzfärbung nach HFDBS in der PP-Subregion. Eine quantitative Analyse der neuronalen Produktion zeigte, dass weder die akute noch die chronische Stimulation im PP die Neurogenese signifikant steigern konnte. Die Anzahl der BrdU-markierenden Zellen war mit oder ohne HFS-Behandlung relativ stabil.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Elektrode richtig zu positionieren und die Stimulation erfolgreich durchzuführen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der neurowissenschaftlichen Hochfrequenzstimulation, die in die Modelle aufgenommen wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den tiefen Hirnkern mit hochfrequenter Stimulation versorgen können.