Fluoreszenz Live Cell Imaging der komplette Vegetative Zellzyklus von langsam wachsenden sozialen Bakterium Myxococcus xanthus

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der bakteriellen Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie Zellen ihre DNA replizieren, wie sie wachsen und wie sie sich teilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass lebende Bakterienzellen mindestens 24 Stunden lang unter dem Mikroskop überwacht werden können und die Technik keine spezielle Ausrüstung erfordert. Obwohl diese Methode einen Einblick in das Wachstum und die Teilung von Myxococcus xanthus geben kann, kann sie auch leicht auf andere langsam wachsende Bakterien angewendet werden.

Zu Beginn wird eine einzelne M.xanthus-Kolonie in 500 Mikrolitern 1%CTT, ergänzt mit Antibiotika, in einem sterilen Röhrchen resuspendiert und die gesamte Suspension in einen 50-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit fünf Millilitern 1%CTT überführt. Bereiten Sie eine 1%Agarose-Mikroskopielösung mit 0,2%CTT vor, indem Sie ein Gramm Agarose mit 80 Millilitern TPM-Puffer und 20 Millilitern 1%CTT-Medium mischen. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen, bis die Agarose geschmolzen ist.

Füllen Sie eine Petrischale mit ca. 60 Millilitern geschmolzener Agarose und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Erwärmen Sie das Agarose-Pad vor der Verwendung mindestens 15 Minuten lang bei 32 Grad Celsius. Lege als Nächstes ein steriles Glasdeckglas auf einen Kunststoff- oder Metallrahmen, der in der Mitte ein Loch hat, und befestige das Deckglas dann mit Klebeband am Rahmen.

Geben Sie 10 bis 20 Mikroliter exponentiell gewachsene M.xanthus-Zellen auf das Deckglas. Um fluoreszierende Mikrosphären als Referenzmarker der Zellen hinzuzufügen, verwenden Sie TPM-Puffer, um die Mikrosphären auf 1:100 zu verdünnen. Schütteln Sie die Bead-Suspension gründlich und geben Sie fünf bis 10 Mikroliter in die Zellen.

Schneiden Sie aus dem großen, vorgewärmten 1%Agarose-Pad ein kleines Pad aus, das etwa so groß wie der Deckglas ist, und legen Sie es auf die Zellen. Legen Sie dann einen Überzug auf das Pad, um Verdunstung zu verhindern und die Zellen in einer feuchten Umgebung zu halten. Inkubieren Sie die Mikroskopieprobe 15 bis 20 Minuten lang bei 32 Grad Celsius, damit sich die Zellen vor den Zeitraffer-Mikroskopieaufnahmen an der Unterseite des Agarose-Pads festsetzen können.

Um Zeitraffermikroskopie durchzuführen, schalten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die Mikroskopsteuerungssoftware. Wählen Sie das richtige Objektiv und die richtigen Spiegel und Filter aus, um Phasenkontrastbilder sowie Bilder von grün fluoreszierenden, rot fluoreszierenden oder gelb fluoreszierenden Proteinen aufzunehmen. Geben Sie einen Tropfen hochwertiges Immersionsöl auf die Linse des Objektivs und auf den Boden der bei 32 Grad Celsius vorinkubierten Probe.

Platzieren Sie den Metallrahmen mit der Probe mit der Probe mit der Lochseite auf dem Mikroskoptisch und befestigen Sie die Probe sicher in der Tischhalterung. Fokussieren Sie sich auf die Zellen, indem Sie den Tisch in Z-Richtung näher an das Ziel heranrücken. Wenn das Öl auf dem Objektiv und der Probe in Kontakt kommt, bewegen Sie den Tisch in X/Y-Richtung.

Wechseln Sie zur Metamorph-Software und öffnen Sie das Acquire-Werkzeug. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Einstellung die Option Phasenkontrast und stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden ein. Klicken Sie auf Live anzeigen, Zelle in Fokusebene bringen und bewegen Sie die Bühne in X/Y-Richtung, bis mehrere einzelne Zellen im Sichtfeld sichtbar sind.

Stellen Sie sicher, dass sich mindestens eine fluoreszierende Mikrosphäre im sichtbaren Bereich befindet, um die aufgenommenen Bilder später ausrichten zu können. Öffnen Sie als Nächstes den Assistenten für die mehrdimensionale Erfassung der Mikroskopsteuerungssoftware, um ein Zeitrafferexperiment einzurichten, das es dem Mikroskop ermöglicht, bei Bedarf Bilder bei mehreren Wellenlängen und Tischpositionen aufzunehmen. Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Haupt" die Optionen "Zeitraffer" und "Mehrere Wellenlängen".

Zusätzliche Registerkarten werden auf der linken Seite des Fensters angezeigt. Klicken Sie auf die Registerkarte Speichern und wählen Sie Verzeichnis, um einen leeren Ordner auf der Festplatte des Computers auszuwählen, in dem die erfassten Bilder gespeichert werden sollen, und aktivieren Sie dann Basisname inkrementieren, wenn Datei vorhanden ist, um sicherzustellen, dass die aufeinanderfolgenden Datensätze frühere Datensätze nicht überschreiben. Geben Sie dem Experiment einen Namen mit Datum und dem Stammnamen oder Titel des Experiments.

Klicken Sie auf die Registerkarte Zeitraffer, um die Zeitrafferparameter anzupassen, und stellen Sie dann das Zeitintervall auf 20 Minuten und die Dauer auf 24 Stunden ein. Die Anzahl der Zeitpunkte ändert sich automatisch. Klicken Sie nun auf die Registerkarte Wellenlängen.

Wählen Sie die Anzahl der Wellenlängen aus, die für jedes Bild zu jedem Zeitpunkt erfasst werden sollen, indem Sie die Anzahl ändern. Wählen Sie "Separate von der Hardware gespeicherte AF-Position für jede Wellenlänge zulassen". Klicken Sie oben auf die Registerkarte Erste Wellenlänge.

Wählen Sie in der Dropdown-Liste Beleuchtung die Option Phasenkontrast aus. Wählen Sie 100 Millisekunden für die Belichtung und wählen Sie in der Dropdown-Liste "Erfassen" die Option "Jeder Zeitpunkt" aus. Deaktivieren Sie die automatische Belichtung in der Dropdown-Liste, indem Sie Nie auswählen und in der Dropdown-Liste für Autofokus Die Option Jede Aufnahme auswählen.

Stellen Sie die Belichtung für jede Wellenlänge ein, wie gerade mit den folgenden Parametern gezeigt. Um dann Bilder von mehreren Bühnenpositionen aufzunehmen, aktivieren Sie auf der Registerkarte "Haupt" die Option "Mehrere Bühnenpositionen". Klicken Sie auf die Registerkarte Bühne und dann auf die Schaltfläche Live, um das Sichtfeld zu betrachten.

Verschieben Sie die Bühne in X/Y-Richtung, bis sich ein ROI im Sichtfeld befindet. Speichern Sie die X- und Y-Koordinaten auf der Registerkarte Bühne, indem Sie auf das Pluszeichen klicken. Verschieben Sie die Bühne erneut in X/Y-Richtung, bis ein neuer ROI gefunden wird, und speichern Sie die Koordinaten erneut, indem Sie auf das Pluszeichen klicken.

Fahren Sie fort, bis die gewünschte Anzahl von Regionen gespeichert wurde. Überprüfen Sie noch einmal, ob die Zellen scharf sind, indem Sie auf die verschiedenen gespeicherten X- und Y-Positionen klicken, und starten Sie den Hardware-Autofokus mit AFC hold, um die gespeicherte Z-Position im Verlauf des Experiments konstant zu halten. Starten Sie die Zeitrafferaufnahme im Assistenten für die mehrdimensionale Erfassung der Mikroskopsteuerungssoftware, indem Sie auf "Erfassen" klicken.

Überprüfen Sie, ob die Zellen nach den ersten Zeitpunkten in den Zeitrafferaufnahmen noch scharf sind, um die Qualität der Bilder zu maximieren und bei Bedarf neu zu fokussieren. Um Zeitrafferfilme zu generieren und die Bildausrichtung durchzuführen, starten Sie die Bildanalyse- und -verarbeitungssoftware. Öffnen Sie die Bilder als Stapel, indem Sie auf Mehrdimensionale Daten überprüfen, Basisdatei auswählen, Verzeichnis auswählen klicken und dann den Ordner mit den mehrdimensionalen Daten öffnen.

Überprüfen Sie das Dataset und klicken Sie auf Anzeigen. Der Datensatz wird als Einzelbild vom ersten Zeitpunkt bis zum Ende angezeigt. Aktivieren Sie die Wellenlänge zum Erstellen eines Stacks, wählen Sie dann alle Bilder aus, die sich im Stack befinden sollen, und klicken Sie auf Bilder laden.

Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Wellenlängen, und speichern Sie die fertigen Stapel. Aktivieren Sie den Stapel von Bildern, der auf Abweichung korrigiert werden muss. Öffnen Sie das Ausrichtungswerkzeug mit Apps, Automatisch ausrichten.

Aktivieren Sie Stapel als Quelle für die Bilder und Erste Ebene/Zeitpunkt als Referenzebene, wählen Sie dann den Stapel mit der Schaltfläche Quellstapel aus und klicken Sie auf Anwenden. Wenn die automatische Ausrichtung abgeschlossen ist, speichern Sie den ausgerichteten Stapel. Um einen Film im MOV- oder AVI-Format zu generieren, öffnen Sie die Funktion Film erstellen über Stapel, Film erstellen.

Wählen Sie die Zeitrafferaufnahmen mit der Taste "Quellstapel" aus, wählen Sie dann das Ausgabeformat, die Bildrate und die Anzahl der Bilder aus und klicken Sie auf "Speichern". In diesem Zeitraffer-Experiment mit beweglichen DK1622-Wildtyp-Zellen wurden 24 Stunden lang alle fünf Minuten Phasenkontrastbilder aufgenommen. Erwartungsgemäß waren die Zellen beweglich und bewegten sich überwiegend in Gruppen.

Im Phasenkontrast-Lebendzell-Imaging mit unbeweglichen Delta-mgIA-Zellen wurde das Wachstum und die Teilung einzelner Zellen während der Mikrokoloniebildung verfolgt. Wenn die Bilder 24 Stunden lang alle fünf Minuten aufgenommen wurden, war es möglich, die Interdivisionszeit von 235 plus oder minus 50 Minuten bei Einzelzellauflösung zu quantifizieren. Um zu untersuchen, ob Zellen normal wachsen, während sie YFP-markierte Proteine über lange Zeiträume verfolgen, wurden M.xanthus-Zellen, die ParB-YFP exprimieren, verfolgt.

ParB-YFP bildete zunächst einen einzelnen Cluster in der subpolaren Zellregion. Kurz vor oder nach der Zellteilung duplizierte sich der Cluster, wobei ein Cluster am alten Zellpol verblieb und der zweite zum neuen Zellpol translozierte. In diesem Experiment zeigten nicht-bewegliche Zellen, die FtsZ-gfp exprimieren, eine starke Akkumulation von FtsZ-gfp in der Mittelzelle, die die Position der Zellteilung bestimmt.

FtsZ-gfp bildete einen Cluster in der Zellmitte, überwiegend in längeren Zellen. Zwei Stunden nach der Zellteilung reicherte sich FtsZ-gfp in der Zellmitte in den Tochterzellen an. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie routinemäßig bei Myxococcus xanthus sowie bei jedem anderen langsam wachsenden Bakterium durchgeführt werden.

Bei der Einrichtung dieses Verfahrens für ein Bakterium ist es wichtig, die Zusammensetzung des Wachstumsmediums in der Agarplatte anzupassen, um den spezifischen Wachstumsanforderungen dieses Bakteriums gerecht zu werden. Für jedes Bakterium ist es wichtig, die optimalen Bildgebungsbedingungen wie Belichtungszeit, Lichtintensität und Bildgebungsfrequenz zu bestimmen, um Phototoxizität zu vermeiden. Außerdem müssen für jedes fluoreszenzmarkierte Protein die Bildgebungsbedingungen angepasst werden, um Phototoxizität und auch Photobleiche zu vermeiden.