Wo schneiden Sie Angelegenheiten: Eine Dissektion und Analyse-Leitfaden für die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus von okulären Sehenswürdigkeiten

Der Zweck dieses Dissektionsprotokolls besteht darin, eine standardisierte Methodik für die Verwendung von okulären anatomischen Orientierungspunkten, wie dem Rektusmuskel, der Aderhautfissur und dem S-Opsin-Gradienten, für die topographische Orientierung der Mausnetzhaut bereitzustellen. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie eine zuverlässige Möglichkeit bieten, die dorsalen, ventralen, nasalen und temporalen Pole einer isolierten Mausnetzhaut genau zu identifizieren. Beginnen Sie damit, einen Punkt auf der dorsalen Hornhaut in der Nähe der Grenze der Hornhaut und zwischen dem nasalen und temporalen Canthi zu identifizieren.

Berühren Sie die Hornhaut mit einem erhitzten Kauterstift weniger als eine Sekunde lang, um eine Brandspur zur Orientierung zu erzeugen. Wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Auge. Das Vorhandensein einer dorsalen Verbrennung ermöglicht die Identifizierung des Musculus rectus superior (Musculus rectus superior).

Für die Enukleation schiebst du das Auge mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig aus seiner Augenhöhle und greifst die Kugel von unten. Heben Sie dann die Kugel langsam aus ihrer Fassung und bewegen Sie sie gleichzeitig sanft von links nach rechts, bis die Kugel aus der Fassung gelöst wird. Übertragen Sie den Globus mit den daran befestigten Rektusmuskeln in eine Petrischale, die das Präpariermedium enthält.

Wenn Sie mit beiden Augen arbeiten, achten Sie darauf, welches Auge das linke und welches das rechte Auge ist. Lokalisieren Sie im Dissektionsbereich visuell die dorsale Hornhautverbrennung und identifizieren Sie den Musculus rectus superior, mit dem er verbunden ist. Mit einer Präparierschere oder einer 20-Gauge-Nadel stechen Sie die Hornhaut an der Brandmarke.

Machen Sie dann einen tiefen, entlastenden Schnitt in die Kugel in Richtung des Sehnervs, um den oberen Muskel zu halbieren. Hier ist eine isolierte Netzhaut mit diesem Schnitt zu sehen, und hier ist eine rekonstruierte Netzhaut mit diesem Schnitt zu sehen. Verwenden Sie zwei Pinzetten, um die Netzhaut zu isolieren, indem Sie das durch die Punktion entstandene Loch vorsichtig aufreißen, bis ein Teil der Netzhaut freigelegt ist.

Ziehen Sie dann die Netzhaut von der Sklera auseinander, bis die Sklera vollständig entfernt wurde. Entfernen Sie die Iris, die Linse, den Glaskörper und alle verbleibenden Strukturen, bis die Netzhaut vollständig isoliert ist. Das Vorhandensein einer dorsalen Verbrennung ermöglicht die Identifizierung der nasalen und temporalen Aderhautfissur.

Wenn mit dem rechten Auge gearbeitet wird, befindet sich die Aderhautfissur rechts von der Verbrennung und die Aderhautfissur links von der Verbrennung. Dies ist das Gegenteil der Arbeit mit dem linken Auge. Um den Orientierungspunkt der Aderhautfissur zur Identifizierung der Netzhautausrichtung zu verwenden, lokalisieren und identifizieren Sie die Aderhautfissur auf dem Augenhintergrund.

Richten Sie den Globus so aus, dass sich die dorsale Brandmale am oberen Pol befindet, so wie es der Fall wäre, wenn sich das Auge noch in der Maus befände. Verwenden Sie dann eine Präparierschere oder eine 20-Gauge-Nadel, um eine Punktion in die Kugel zu machen, zuerst dort, wo sich die dorsale Verbrennung befindet. Machen Sie als Nächstes einen flachen, entlastenden Schnitt in Richtung des Sehnervs, wo sich die dorsale Hornhautverbrennung befindet.

Machen Sie dann die folgenden zwei tiefen, entlastenden Schnitte in Richtung des Sehnervs. Zum einen, indem die Klingen der Präparierschere mit der Schläfenspalte auf dem Augenrücken ausgerichtet werden, und zum anderen, indem die Klingen der Präparierschere mit der Nasenspalte auf dem Augenhintergrund ausgerichtet werden. Diese Schnitte sind hier auf einer isolierten und rekonstruierten Netzhaut zu sehen.

Nachdem Sie diese Schnitte gemacht haben, verwenden Sie zwei Pinzetten, um die Einstichlöcher vorsichtig wegzureißen, bis ein Teil der Netzhaut freigelegt ist. Machen Sie mit einer Präparierschere vier entlastende Schnitte in die Netzhaut, so dass sie flach aufliegt. Befestigen Sie die Netzhaut mit der Ganglienzellseite nach oben auf der Nitrozellulosemembran, indem Sie jede Ecke der Netzhaut vorsichtig mit einer Pinzette auf die Membran drücken.

Tauchen Sie dann die montierte Netzhaut mit einer Pinzette in einen Milliliter 4%igen Paraformaldehyds, der in der ersten Vertiefung einer 24-Well-Platte enthalten ist. Legen Sie die 24-Well-Platte bei Raumtemperatur auf einen Orbitalschüttler und fixieren Sie die Netzhaut genau 40 Minuten lang. Übertragen Sie die Netzhaut nach dem Fixieren in die zweite Vertiefung der Platte, die mit einem Milliliter 0,1 molaren PBS gefüllt ist, und waschen Sie die Netzhaut 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Wenn der Waschvorgang abgeschlossen ist, übertragen Sie die montierte Netzhaut in die fünfte Vertiefung mit einem Milliliter Blockierungslösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag geben Sie den Kaninchen-Anti-S-Opsin-Primärantikörper in einer Konzentration von eins bis 500 in die Blockierungslösung und inkubieren Sie drei Tage lang bei vier Grad Celsius. Nach der dreitägigen Inkubation waschen Sie den überschüssigen Primärantikörper sechsmal von der Netzhaut, indem Sie ihn nacheinander für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in sechs Vertiefungen mit einem Milliliter PBS füllen.

Legen Sie dann die gewaschene Netzhaut in eine Vertiefung mit frischer Blockierungslösung und fügen Sie den Esels-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper Alexa 594 hinzu. Inkubieren Sie die Netzhaut mit dem Sekundärantikörper über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Netzhaut nach der Inkubation wie zuvor sechsmal in PBS.

Übertragen Sie die montierte Netzhaut mit einer Pinzette in eine Petrischale, die PBS enthält. Lösen Sie die Netzhaut von der Nitrozellulosemembran, indem Sie die Spitzen der Pinzette vorsichtig zwischen Netzhaut und Membran einführen, bis die Netzhaut nicht mehr befestigt ist. Tauchen Sie einen Objektträger aus Glas in das PBS und befestigen Sie die Netzhaut auf dem Objektträger, indem Sie ihn auf den Objektträger schweben lassen und ihn vorsichtig mit einer Pinzette anstoßen, bis die Netzhaut am Glas klebt.

Decken Sie die Netzhaut auf dem Objektträger mit einem Eindeckmedium ab und legen Sie ein Deckglas 1,5 auf. Legen Sie den Objektträger in eine Objektträgerablage und lassen Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur ruhen. Stellen Sie die Schiebeschale nach einer Stunde auf vier Grad Celsius auf.

Nachdem die Folie 24 Stunden lang abgedeckt wurde, verwenden Sie Nagellack, um die Seiten der Folie zu versiegeln, um ein Austrocknen zu verhindern. Dies ist ein Beispiel für eine Netzhaut, die aus dem rechten Auge isoliert wurde, immungefärbt wurde, um S-Opsin zu markieren, und mit einem Epifluoreszenzmikroskop abgebildet wurde. Es ist wichtig zu beachten, dass die Schnitte in dieser Netzhaut willkürlich sind, da die topographische Ausrichtung durch den S-Opsin-Gradienten identifiziert werden kann.

Das aufgenommene Bild der Netzhaut kann dann mit der ReadiStruct-Software digital rekonstruiert werden. Die Originalschnitte sind in diesem Bild pseudorot gefärbt. Beachten Sie, dass die Ausgabedatei dieses Programms die Netzhaut nicht korrekt ausrichtet.

Nachdem die Netzhaut den benutzerdefinierten Mattenlaborcode durchlaufen hat, wird die Netzhaut so gedreht, dass die höchste Konzentration der S-Opsin-Färbung am unteren Rand platziert und als ventrale Netzhaut identifiziert wird. Dieses Bild zeigt die Netzhaut eines linken Auges. Der Schläfenpol befindet sich in einem Winkel von 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn vom ventralen Pol und der Nasenpol befindet sich in einem Winkel von 90 Grad im Uhrzeigersinn vom ventralen Pol.

Einmal gemeistert, können diese Seziertechniken ziemlich schnell in nur wenigen Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Netzhaut der Maus mit dem oberen Rektusmuskel, der Aderhautfissur oder dem S-Opsin-Gradienten als Orientierungspunkt genau und zuverlässig ausrichten können.