Name: Wo schneiden Sie Angelegenheiten: Eine Dissektion und Analyse-Leitfaden für die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus von okulären Sehenswürdigkeiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Lernen Sie die Dissektion und Orientierung der Mäusenetzhaut mit anatomischen Landmarken wie S-Opsin-Gradient und Choroidalfissur. Diese Methode ermöglicht präzise Identifikation dorsaler, ventraler, nasaler und temporaler Pole für zuverlässige neurobiologische Analysen.

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Wir möchte Bretagne Tag und Jessica Onyak für ihre technische Unterstützung und Dr. Liu für bitte lassen Sie uns seine Epifluorescent Mikroskop benutzen. Danksagung des Supports: NIH-R15EY026255-01 und Karl Kirchgessner Stiftung.

<ol><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
<li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li>
<li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites%3A+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li>
<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
<li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li>
<li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice%3A+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131(2014).</li>
<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
<li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+selectivity+in+the+retina%3A+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li>
<li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Ikbkap+causes+slow%2C+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938(2013).</li>
<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612(2015).</li>
<li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li>
<li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+the+M4+cell%2C+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+Rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+type%2C+size%2C+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
<li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li>
<li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+eye%3A+Opsins%2C+photoreceptors%2C+retina+and+eye+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li>
<li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina%3A+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Keine umfassende, standardisierte Protokoll für die Bestimmung und Kennzeichnung der Ausrichtung der isolierten Maus Netzhaut im anatomischen Raum stattgefunden hat. Das Protokoll detailliert hier versucht, diese Lücke durch die Standardisierung und Detaillierung tief anatomische Landmarken Verwendung als Referenz verweist auf zuverlässig identifizieren retinalen Orientierung. Es hat sich gezeigt, dass die tief anatomischen Landmarken in diesem Protokoll eine genauere und zuverlässigere Methode für die Orientierung der Maus Netzhaut als oberflächliche Sehenswürdigkeiten wie Hornhaut Verbrennungen22bieten. So können Studien, die auf die Hornhaut Verbrennungen zur Netzhaut Orientierung verlassen haben größere Fehler in der Ausrichtung als Studien gehabt haben, die auf Sehenswürdigkeiten wie dem Rectus Muskeln und choroid Fissur verlassen haben. Diese Diskrepanz unterstreicht die Notwendigkeit und Bedeutung dieses standardisierten Protokolls in Bezug auf die Interpretation der Ergebnisse und Vergleiche zwischen den Studien, die von genau retinalen Orientierung abhängen. Insgesamt wird ein standardisiertes Protokoll eine gängige Methode zur Vision Forscher zu folgen, bieten wodurch das Vorhandensein einer konfundierenden Variablen in der Datenerfassung, die auftreten können mit der Verwendung von nicht-standardisierten Methoden zur Identifizierung von retinalen Orientierung.
Die hier vorgestellten Methoden sind leicht wiederholbar und für viele Arten von experimentelle Protokolle. In der Tat ist einer der größten Vorteile dieses Protokolls seine Anpassungsfähigkeit. Weil die Aderhaut Fissur, s-Opsin Ausdruck und Rectus Muskeln Sehenswürdigkeiten alle gefunden wurden, um retinale Orientierung22 zuverlässig zu identifizieren ist das Wahrzeichen, die am besten die Versuchsparameter wählbar, Datenerfassung (Tabelle zu optimieren 1). Darüber hinaus können Methoden der Dissektion kombiniert werden, um die Ausrichtung der Netzhaut weiter zu klären. Beispielsweise können choroid Fissur Schnitten mit s-Opsin Immunohistochemistry kombiniert werden, um alle vier Stangen der Netzhaut zu orientieren: nasale und Temporale Hemisphären durch die Aderhaut Fissur Kürzungen identifiziert werden können, und s-Opsin Immunohistochemistry erkennen Ventrale und dorsale Halbkugeln. Jedoch kann die Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls durch den zeitkritischen Charakter der Physiologie Experimente abhängig gemacht werden. Da die Zeit, die es braucht, um ein Wahrzeichen zu identifizieren, machen eine Hornhaut brennen und ausführen einen Linderung Schnitt erhebliche Gewebe Tod in ex Vivo Experimenten führen könnten, möglicherweise einige dieser Methoden Dissektion suboptimal. Zum Glück, sobald ein Sezierer mit der Aderhaut Fissur oder überlegener Rectus Muskeln Dissektion Methode vertraut geworden ist, erkennen die tiefen Wahrzeichen und die Linderung von Kürzungen schnell werden Sie ein Teil der Dissektion Routine und nicht deutlich hinzufügen auf die Länge der Dissektion. Obwohl wir anerkennen, dass die hier beschriebenen Schritte auf Zeit extrem zeitkritische Experimente hinzufügen können, empfehlen wir die Verwendung der s-Opsin-Gradient für post-Hoc retinalen Ausrichtung wird die Lebensfähigkeit des Gewebes nicht mehr ein Problem (Abbildung 3 ). Färbung der Netzhaut für s-Opsin ist ein wirksames Mittel die Netzhaut zu orientieren, wie es alle vier Pole identifizieren kann: s-Opsin Färbung teilt die Netzhaut in dorsalen und ventralen Pole und ermöglicht eine Identifikation der nasalen und temporalen je nachdem, ob Pole die Netzhaut wird von einem rechten oder linken Auge (Abbildung 3). Daher glauben wir, dass dieses Protokoll liefert einen zuverlässigen und wiederholbaren Satz von Methoden für die präzise Ausrichtung der Netzhaut, die experimentellen Parameter erfüllen kann.
Als mit jedem veränderten retinalen Dissektion, die Gültigkeit der Dissektion Methode begrenzt durch die Genauigkeit der Sezierer und die Qualität des Gewebes, die isoliert wurde. Wenn jedes Gewebe verloren bei Dissektion oder die Netzhaut ist auch für genaue Rekonstruktion verstümmelt, werden Retistruct und das MATLAB-Programm nicht in der Lage, zuverlässig zu rekonstruieren oder die Netzhaut zu orientieren. Es ist daher wichtig, die Dissektion Methode üben, bevor zum Sammeln von Daten mittels Experimenten. Während die Arten von Dissektionen hier sind nicht schwer erklärt, müssen sie geübt werden, um die Wiederholbarkeit der Identifizierung von retinalen Orientierung ein besonderes Wahrzeichen zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Sezierer Praxis optisch identifizieren die anatomischen Landmarken vor Beginn der Datenerhebung zu sicher, dass das richtige Wahrzeichen verwendet wird. Eine Möglichkeit zur Überprüfung der Richtigkeit einer bestimmten Sezierer ist entweder choroid Fissur zu machen schneidet oder überlegener Rectus Muskel schneidet und dann den Speicherort der die Kürzungen bei den s-Opsin Farbverlauf zu vergleichen, da es eine feste Markierung und somit nicht abhängig von der Genauigkeit der Dissectio ist n. potenzielle Dissectors können auch vergleichen ihre rekonstruierten Netzhaut zu den Beispielen der rekonstruierten Netzhaut mit genauen Wahrzeichen Kürzungen sind in Abbildung 1 dargestellte und Abbildung 2. Im Wesentlichen eine potenzielle Sezierer sollten die Schritte in diesem Protokoll für einen bestimmten Dissektion Typ durchführen, sei es überlegener Rectus Muskeln oder Aderhaut Rissbildung Methode, und vergleichen Sie die Ergebnisse auf den s-Opsin Farbverlauf herzustellen die Gültigkeit einer bestimmten Sezierer. Denn wenn der Sezierer unsicher über den Standort des Wahrzeichens ist, es eine ungenaue Ausrichtung der Netzhaut führen kann, dass wird standardmäßig beeinflussen Datenerhebung und Auswertung.

Ein wichtiger und manchmal übersehener Aspekt der Netzhaut Neurowissenschaften ist die korrekte Ausrichtung und Analyse der isolierten ganze-Mount Netzhaut, sei es die Ausrichtung der Netzhaut in einer Elektrophysiologie Aufnahme Kammer oder auf einer histologischen Folie. Dies ist besonders wichtig für Studien mit der Maus Netzhaut, die derzeit das am weitesten verbreitete Modell für Untersuchungen des Säugetier-visuellen Systems. Die jüngsten Entdeckungen zeigen, dass die Maus Netzhaut nicht räumlich einheitlich ist sondern Dichte und Größe Gradienten der Netzhaut funktionell unterschiedliche Zelltypen, wie Ganglienzellen Melanopsin, transiente OFF-Alpha Ganglienzellen und Kegel Opsins1,2 hat ,3,4,5. Infolgedessen die Methode zur Ermittlung die Ausrichtung der Netzhaut beeinträchtigen die experimentellen Ergebnisse mit Zelle Typ oder Opsin Distributionen2,3,6, Richtung der Richtung-selektiven tuning Ganglion Zellen7,8,9und topografische Muster von Netzhautdegeneration10,11,12,13,14 . In der Tat kann nicht Berichterstattung wie Netzhaut Orientierung gemeldet wird Abweichungen in der Literatur und Verwirrung verursachen beim Versuch, Daten zwischen den Studien zu vergleichen. Es ist daher wichtig, dass Forscher berichten die Methode für die Ausrichtung der Netzhaut zu identifizieren, so dass die Ergebnisse solcher Studien genau interpretiert werden können.
Netzhaut Orientierung wird häufig durch scoring die dorsale, ventrale, nasale oder zeitliche Hornhaut vor dem Okular Enukleation1,3,12,15,16,17 identifiziert ,18,19 oder der Aderhaut Rissbildung durch Schneiden oder färben tief anatomische Auge Sehenswürdigkeiten wie die extraokularen Muskeln6,7,20,21, oder die s-Opsin gradient2,3. Rectus Muskeln können verwendet werden, um die dorsale, ventrale, Nasal und temporal Netzhaut indem man einem tief entspannenden Schnitt, der die Anlage die entweder halbiert überlegene Rectus, minderwertige Rectus, mediale Rectus oder seitlichen Rectus Muskeln, bzw. zu identifizieren. Jedoch ist für die meisten Experimente mit Rectus Muskeln ausreichend für die Orientierung der Netzhaut22. Die Aderhaut Fissur, die ein Überrest der Augenentwicklung ist, kann als eine schwache horizontale Linie auf der Rückseite des Auges betrachtet. Beiden Enden dieser Linie endet an der Nasal oder der zeitlichen Pole der Erde23. Zu guter Letzt s-Opsin Ausdruck ist asymmetrisch verteilt an der ventralen Netzhaut in Mäusen und s-Opsin Antikörper können verwendet werden, um die ventralen Netzhaut in immunhistochemischen Experimente1zeigen.
Neuere Arbeiten von Stabio, Et al. 22 gezeigt, dass oberflächliche okuläre Wahrzeichen wie Hornhaut Verbrennungen eine weniger zuverlässige Methode sind für die Orientierung der Netzhaut im anatomischen Raum, sehr wahrscheinlich durch menschliches Versagen und Variabilität bei der Herstellung der Hornhaut brennen bei der Verwendung der zeitlichen und medialen Augenwinkel als Referenzpunkte. Im Gegensatz dazu haben tiefe Sehenswürdigkeiten wie überlegener Rectus Muskeln, choroid Riss und dem s-Opsin-Gefälle erwiesen zuverlässig und präzise Wahrzeichen für die Orientierung der Netzhaut-22. Allerdings erfordert die Ermittlung von diesen anatomischen Landmarken einzigartige Dissektion Schritte, die nicht in der Literatur ausführlich beschrieben werden. Ziel dieses Protokolls ist es daher, eine umfassende Anleitung, wie die überlegene Rectus Muskeln, choroid Fissur und s-Opsin Farbverlauf verwenden, um die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus genau zu identifizieren können. Darüber hinaus haben wir einen Vergleich der Wirksamkeit von zwei s-Opsin-Antikörper, sowie ein Protokoll für s-Opsin Immunohistochemistry aufgenommen.
Eine weitere Herausforderung Studien unter Berufung auf genaue Ausrichtung der Netzhaut ist die große Linderung Kürzungen erforderlich, um Wholemount Netzhaut auf einer Aufnahme Kammer, Schale oder Folie zu glätten. Dies kann führen, Herausforderungen für die Analyse dessen, was natürlich eine dreidimensionale Struktur ist, wenn es als eine flache zweidimensionale Struktur abgebildet wird. Ein Programm namens Retistruct24 lässt sich eine flache Wholemount Netzhaut seiner dreidimensionalen Struktur zurück, bevor die von ihm gesammelten Daten analysiert werden. So widmet ein Abschnitt dieses Protokolls Hervorhebung der Schritte, die notwendig sind für die Verwendung der Retistruct-Software s-Opsin Immunostained Maus Netzhaut zu rekonstruieren. Wir haben ebenfalls einen Abschnitt des Protokolls für die Verwendung unserer benutzerdefinierte MATLAB-Skript, das, um präzise drehen und orient Maus Netzhaut mit s-Opsin befleckt entwickelt wurde.

<table><tbody><tr><td>0,1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Klares Nagellackieren</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Low Speed Orbitalschüttler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC-behandelte 24-Well-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Esel-Anti-Ziege Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Normal Serum</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Anwendung bei 5,2% (52 &mu; L mit 86 &mu; L von 20% Triton X-100 und 863 &mu; L von 0,1 M PBS für 1 mL Blocklösung)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-S-Opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>Stand 2017 nicht kommerziell lieferbar</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ oder FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Frei verfügbare Software</td></tr><tr><td>Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Mindestens Version 2007b oder später</td></tr><tr><td>Micro Cover Brillen&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Objektträger-Tabletts</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Ultrafeine Pinzette</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>15714-S</td><td>Verwendung bei 4% (25 &mu; L und 875 &mu; L von 0,1 M PBS für 1 mL Fixiermittel)</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 20G (0,90 mm x 25 mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glas Petrischale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>Frei verfügbare Software; Version 3.4.3 oder höher</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Mikroskop Kamera</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Frei verfügbare Software&nbsp; kompatibel mit Windows 7 oder Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Slide Montagemedien</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Verbrauch 1,7% (86 &mu; L von 20% Triton-X mit 52 &mu; L von Donkey Normal Serum und 863 &mu; L von 0,1 M PBS für 1 mL Blocklösung)</td></tr><tr><td>Vannas Feder-Dissektionschere&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP USB Mikroskop Digitalkamera</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>Zur Verwendung mit dem Olympus Dissektionsmikroskop</td></tr></tbody></table>

wo schneiden sie angelegenheiten: eine dissektion und analyse-leitfaden für die räumliche orientierung der netzhaut maus von okulären sehenswürdigkeiten

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Präzise und zuverlässig identifizieren räumlichen Orientierung der isolierten Maus Netzhaut ist wichtig für viele Studien in den visuellen Neurowissenschaften, einschließlich der Analyse von Dichte und Größe Steigungen von retinalen Zelltypen, die Richtung Stimmung der Richtung-selektive Ganglienzellen, und die Prüfung der topographischen Degeneration Muster in einigen Netzhauterkrankungen. Allerdings gibt es viele verschiedene augenfällige Dissektion-Methoden in der Literatur beschrieben, die verwendet werden, zu identifizieren und kennzeichnen retinalen Orientierung in der Netzhaut Maus. Während die Methode der Ausrichtung verwendet in solchen Studien oft übersehen wird, kann keine Berichterstattung wie Netzhaut Ausrichtung bestimmt ist Abweichungen in der Literatur und Verwirrung verursachen beim Versuch, Daten zwischen den Studien zu vergleichen. Oberflächliche okuläre Sehenswürdigkeiten wie Hornhaut Verbrennungen werden häufig verwendet, aber haben vor kurzem gezeigt, dass weniger zuverlässig als tiefer Sehenswürdigkeiten wie die Rectus Muskeln, der Aderhaut Fissur oder der s-Opsin-Gradient. Hier bieten wir einen umfassenden Leitfaden für die Verwendung von tief okuläre Sehenswürdigkeiten genau untersuchen und dokumentieren die räumliche Orientierung der Netzhaut eine isolierte Maus. Wir haben auch verglichen die Wirksamkeit von zwei s-Opsin-Antikörpern und enthalten ein Protokoll für s-Opsin Immunohistochemistry. Da Orientierung der Netzhaut nach der s-Opsin-Gradient retinalen Rekonstruktion mit Retistruct Software und Rotation mit benutzerdefiniertem Code erforderlich ist, haben wir die wichtigen Schritte erforderlich, um beide Programme verwenden vorgestellt. Insgesamt ist das Ziel dieses Protokolls einen zuverlässigen und wiederholbaren Satz von Methoden für die präzise Ausrichtung der Netzhaut zu liefern, die an die experimentelle Protokolle anpassbar ist. Ein übergeordnetes Ziel dieser Arbeit ist es, retinale Ausrichtung Methoden für zukünftige Studien zu standardisieren.

Ein einziger Linderung Schnitt, der die überlegene Rectus Muskel genau und zuverlässig halbiert identifiziert die dorsale Netzhaut (Abbildung 1). Die Aderhaut Spalt identifiziert genau und zuverlässig die nasale und Temporale Retina mit Tiefe Linderung Einschnitte entlang der zeitliche und nasale choroid Fissur (Abbildung 2). In diesem Beispiel worden ein Linderung Schnitt auch in der dorsalen Netzhaut erzielt um die dorsale/ventrale Achse der Netzhaut (Abbildung 2D, vertikale Pfeil) zu erkennen. Die Schritte dieser Prozesse werden zum Zweck der Replikation durch zukünftige Dissectors gezeigt. Eine Kombination aus s-Opsin Immunohistochemistry (Abbildung 3A und 3D), Rekonstruktion mit Retistruct Software (3 b, 3E) und genaue Drehung mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Code (3 C, 3F) ermöglicht die Kennung der ventralen und dorsalen Hälften der Netzhaut sowie die nasalen und temporalen Pole wenn es bekannt ist, ob die Netzhaut von einem rechten oder linken Auge (Abbildung 3 ist). Wir haben auch zwei häufig verwendete s-Opsin Primärantikörper für Effizienz in der Kennzeichnung s-Opsin Kegel (Abbildung 4A-D) verglichen: beide die Ziege Anti-s-Opsin Primärantikörper und die Kaninchen Anti-s-Opsin Primärantikörper effektiv zu beschriften s-Opsin Kegel (Abbildung 4E) in der gleichen Maus.
Linderung Kürzungen auf s-Opsin Immunostained rekonstruiert Netzhaut identifiziert wurden und ihre Standorte wurden im Vergleich zu der Orientierung durch die s-Opsin Steigung bestimmt. Mit unseren kundenspezifischen MATLAB-code (siehe Zusatzmaterialien), Netzhaut waren genau so gedreht, dass die höchste Konzentration von s-Opsin Färbung setzt damit wahre ventral, liegt dorsal bei 90° (für überlegene Rectus), wahre Nasal bei 0° (für Nasal Choroid Fissur) und bei 180 ° (für zeitliche choroid Fissur) zeitliche wahr. Der Wert jedes einzelnen Linderung Schnittwinkel war bestimmt mit dem Winkel-Tool in ImageJ, nachdem die Netzhaut nach der s-Opsin-Gradient gedreht wurden. Ein durchschnittlichen Winkel wurde für jede Linderung Schnitt Art berechnet und der Mittelwert der einzelnen Linderung einschnittart wurde dann auf einem polaren Grundstück (Abbildung 6) aufgetragen. Im Durchschnitt überlegener Rectus Muskeln Schnitten identifiziert den dorsalen Pol auf 96,3 ± 4,3 ° (n = 11) (Abbildung 6). Die nasale choroide Fissur die nasale Pol bei 6,7 ± 5,8 ° und zeitliche choroide Fissur gekennzeichnet der temporalen Pole bei 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; ( Abbildung 6).
<img alt="Mikroskopische Analyse der Augenstruktur; dorsaler Verbrennungseffekt; Neuroanatomie-Diagramme; Meßergebnis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: mit der überlegenen Rectus-Muskel, um die dorsale Netzhaut des rechten Auges genau zu identifizieren. (A) ein Beispiel für eine dorsale Hornhaut brennen nahe der Hornhaut skleralen Grenze mit einem Filzstift Cautery (weißer Pfeil) gemacht. Die überlegene Rectus Muskel ist auch in dieser Ansicht (weißer Pfeil) angezeigt. (B) ein Beispiel eines ganzen montierten Netzhaut mit einer Entlastung schneiden in der dorsalen Netzhaut durch halbiert überlegene Rectus Muskeln gemacht. Pfeil zeigt die tiefen Schnitt in der dorsalen Netzhaut durch halbiert überlegene Rectus Muskeln entlasten. Die Netzhaut ist gefärbt mit Primärantikörper Ziege Anti-s-Opsin (siehe Tabelle der Materialien) und Sekundärantikörper Esel anti-Ziege Alexa 594 (siehe Tabelle der Materialien; Erregung: 590 nm, Emission: 620 nm) (Cyan). Netzhaut wurde mit einem Epifluorescent-Mikroskop mit einem Texas Red Filter abgebildet (595 nm). (C) eine Netzhaut in Retistruct rekonstruiert und mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Code gedreht (siehe Zusatzmaterialien) mit der überlegenen Rectus Muskel entlasten schneiden sichtbar (weißen Pfeils). D: dorsal, V: ventralen, T: temporal, N: Nasal. Skalieren von Balken = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Analyse der Augenentwicklung; dorsale Verbrennung und Aderhautfissur; Mikroskop-Bild; Anatomisches Diagramm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Verwendung der Aderhaut Fissur, um die nasalen und temporalen Pole der Netzhaut des rechten Auges genau zu identifizieren. (A) ein Beispiel für eine dorsale Hornhaut brennen nahe der Hornhaut skleralen Grenze mit einem Filzstift Cautery gemacht. (B) der Aderhaut Spalt sichtbar auf der Rückseite des Auges auf der Sklera (weißer Pfeil). Die dorsale Hornhaut brennen ist auch in dieser Ansicht befindet sich etwa 90° aus der zeitlichen Aderhaut Spalt sichtbar. (C) der Aderhaut Spalt sichtbar auf der Rückseite des Auges auf die Lederhaut, von des Sehnervs bis zur Hornhaut skleralen Grenze Reisen. (D) eine Netzhaut gebeizt mit Ziege Anti-s-Opsin (siehe Tabelle der Materialien) und sekundäre Antikörper Esel anti-Ziege Alexa 594 (siehe Tabelle der Materialien; Erregung: 590 nm, Emission: 620 nm) (Cyan) mit choroid Fissur Schnitten (Horizontal Pfeile) und die dorsale Entlastung (vertikale Pfeil) schneiden. Netzhaut wurde mit einem Epifluorescent-Mikroskop mit einem Texas Red Filter abgebildet (595 nm). (E) die Netzhaut im Retistruct rekonstruiert und mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Code (siehe Zusatzmaterialien) mit der dorsalen Linderung Schnitt und den nasalen und temporalen choroid Fissur Schnitten sichtbar (weisse Pfeile) gedreht. D: dorsal, V: ventralen, T: temporal, N: Nasal. Skalieren von Balken = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Retina-Mapping-Diagramm; Analyse der rechten und linken Netzhaut; Ungedrehte und gedrehte Visualisierung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: mit der s-Opsin-Farbverlauf, um alle vier Stangen der Netzhaut zu identifizieren. (A) ein Beispiel für eine Netzhaut seziert aus einer rechten Auge, die mit einem Epifluorescent-Mikroskop mit einem Texas Red Filter abgebildet und wurde Immunostained s-Opsin beschriften (595 nm). Die Kürzungen in diesem Netzhaut sind willkürlich, da die topographische Orientierung durch die s-Opsin-Verlauf bestimmt wird. (B) die Ergebnisse der Rekonstruktion der Netzhaut in A mit Retistruct. Beachten Sie, dass die s-Opsin-Gradienten nicht richtig ausgerichtet ist, weil die Netzhaut durch die benutzerdefinierte MATLAB-Code (siehe Zusatzmaterialien) nicht ausgeführt wurde. (C) die Ergebnisse der Drehung der Netzhaut in A mit den benutzerdefinierten Code. Die Netzhaut wurde gedreht, so dass die höchste Konzentration von s-Opsin Färbung an der Unterseite befindet und als die ventralen Retinal identifiziert. Weil die Netzhaut aus einer rechten Auge ist, der zeitliche Pol ist befindet sich 90° gegen den Uhrzeigersinn vom dorsalen Pol und der nasale Pol ist befindet sich 90° im Uhrzeigersinn von der dorsalen Pol. (D) ein Beispiel für eine Netzhaut seziert von einem linken Auge, die mit einem Texas Red Filter abgebildet und wurde Immunostained s-Opsin beschriften (595 nm). Die Kürzungen in diesem Netzhaut sind willkürlich, da die topographische Orientierung durch die s-Opsin-Verlauf bestimmt wird. (E) die Ergebnisse die Netzhaut in D mit Retistruct Digital zu rekonstruieren. Beachten Sie, dass die s-Opsin-Gradienten nicht richtig ausgerichtet ist, weil die Netzhaut nicht durch den benutzerdefinierten Code gedreht wurde. (F) die Ergebnisse der Drehung der Netzhaut in D mit den benutzerdefinierten Code. Die Netzhaut wurde gedreht, so dass die höchste Konzentration von s-Opsin Färbung an der Unterseite befindet und als die ventralen Retinal identifiziert. Da die Netzhaut von einem linken Auge ist, der nasale Pol ist befindet sich 90° gegen den Uhrzeigersinn vom dorsalen Pol und die Temporale Pole ist befindet sich 90° im Uhrzeigersinn von der dorsalen Pol. D: dorsal, V: ventralen, T: temporal, N: Nasal. Skalieren von Balken = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Ziegenkaninchen Anti-S-Opsin-Immunfärbemikroskopbilder; Histologie-Querschnitte; Datendiagramm" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4: Vergleich von zwei primäre s-Opsin-Antikörper in der Kennzeichnung s-Opsin Zapfen. (A) A Netzhaut mit der Ziege Anti-s-Opsin Primärantikörper befleckt (siehe Tabelle der Materialien). (B) die anderen Netzhaut der gleichen Maus gebeizt mit Kaninchen Anti-s-Opsin Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien). (C) eine repräsentative Region (0,1 x 0,1 mm2) von der Netzhaut mit der Ziege Anti-s-Opsin Primärantikörper befleckt. Aufnahme auf ein Epifluorescent Mikroskop bei 40 X Vergrößerung. (D) eine repräsentative Region (0,1 x 0,1 mm2) von der Netzhaut mit Kaninchen Anti-s-Opsin befleckt (siehe Tabelle der Materialien), eine Primärantikörper Alternative. Bild wurde auf ein Epifluorescent Mikroskop bei 40 X Vergrößerung aufgenommen. (E) beide Antikörper kennzeichnen die gleiche Anzahl von s-Kegel außensegmenten, da gibt es keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Immunopositive s-Zapfen, die Ziege Anti-s-Opsin und Kaninchen Anti-s-Opsin jederzeit von den getesteten Retinal gefärbt sind Exzentrizitäten (n = 2; ANOVA mit post Hoc Bonferroni-Test; p &gt; 0.05). Skalieren von Balken = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Statische Gleichgewichtsanalyse, Diagramm der Softwareschnittstelle mit Bilddaten, das Struktur und Ergebnisse zeigt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5: eine visuelle Anleitung zur Verwendung der Retistruct-Software, Netzhaut-Immunostained mit s-Opsin rekonstruieren. (A) A Netzhaut in Retistruct mit den Umriss sichtbar geöffnet und ein "reißen" hinzugefügt. Punkte von der "Träne" sind mit übereinander liegenden weißen Pfeile gekennzeichnet. Alle Kürzungen in diesem Netzhaut sind willkürlich, da kein besonderes Wahrzeichen verwendet wurde, um die Netzhaut Orientierung während der Präparation zu markieren. Wichtige Tasten sind rot hervorgehoben. (B) ein Netzhaut mit allen "Tears" hinzugefügt und der dorsalen Netzhaut identifizierte sich mit "D" am Rande der Netzhaut. Beachten Sie, dass die "Rekonstruieren Retina" Schaltfläche jetzt sichtbar ist. Wichtige Tasten sind rot hervorgehoben. (C) den Prozess des Wiederaufbaus der Netzhaut. Die polar Handlung der rekonstruierten Netzhaut erscheint auf der rechten Seite, zeigt, dass die Entlastung in Cyan (blaue Pfeile zur Klärung Schnitt Standorte überlagert) schneidet. (D) das endgültige Ergebnis der Netzhaut durch Retistruct laufen. Die ursprüngliche Wholemount Netzhaut bleibt auf der linken Seite und die rekonstruierte Netzhaut erscheint auf der rechten Seite. Die Linderung Kürzungen sind sichtbar in Cyan (weisse Pfeile zur Klärung Schnitt Standorte überlagert). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Radiales Diagramm mit den Richtungen der Augenmuskeln; Daten zu Rectus superior, Aderhautfissuren (nasal, temporal)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Abbildung 6: überlegener Rectus Muskeln und Aderhaut Fissur kann verwendet werden, um genau die Maus Netzhaut orientieren. Ein polar Plot der Winkel von entweder überlegener Rectus Muskeln entlasten Kürzungen oder Aderhaut Riss schneidet in der Netzhaut, die mit Retistruct rekonstruiert worden. Linderung Kürzungen auf s-Opsin Immunostained rekonstruiert Netzhaut identifiziert wurden und ihre Standorte wurden an die Stelle des s-Opsin Gradienten verglichen. Bei Verwendung des benutzerdefinierten MATLAB Codes genau die Netzhaut zu drehen, so dass die höchste Konzentration der s-Opsin Färbung ventral gelegen, wahre dorsal (90° für überlegene Rectus) ist true Nasal (0° für nasale choroid Fissur) und zeitliche (180° für zeitliche Aderhaut wahr Fissur) wurden für jede Netzhaut bestimmt. Der Wert jedes einzelnen entlasten Schnittwinkel ImageJ und einem durchschnittlichen Winkel festgestellt wurde war für jede Linderung Schnitt Art berechnet. Überlegener Rectus Muskeln Schnitten identifiziert den dorsalen Pol auf 96,3 ± 4,3 ° (n = 11). Die nasale choroide Fissur die nasale Pol bei 6,7 ± 5,8 ° und zeitliche choroide Fissur gekennzeichnet der temporalen Pole bei 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tiefen Wahrzeichen</td>
			<td>Hornhaut brennen Lage</td>
			<td>Pol der Netzhaut identifizierte</td>
			<td>Experimentelle Anwendung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Überlegener Rectus</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Live- oder feste</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nasale Choroid Fissur</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Nasal</td>
			<td>Live- oder feste</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeitliche Choroid Fissur</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Zeitliche</td>
			<td>Live- oder feste</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-Opsin Farbverlauf</td>
			<td>Keine</td>
			<td>Dorsal, Ventral, Nasal, zeitliche</td>
			<td>Behoben</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Tiefe Wahrzeichen, die Pole der Netzhaut erkennen sie und ob sie für Live- oder festen Gewebe Anwendung verwendet werden können.

Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Präparation und Analyse-Leitfaden für die Verwendung von tief okuläre Sehenswürdigkeiten, s-Opsin Immunohistochemistry, Retistruct und benutzerdefinierten Code, präzise und zuverlässig isoliert Maus Netzhaut im anatomischen Raum zu orientieren.

Wo schneiden Sie Angelegenheiten: Eine Dissektion und Analyse-Leitfaden für die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus von okulären Sehenswürdigkeiten

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Der Zweck dieses Dissektionsprotokolls besteht darin, eine standardisierte Methodik für die Verwendung von okulären anatomischen Orientierungspunkten, wie dem Rektusmuskel, der Aderhautfissur und dem S-Opsin-Gradienten, für die topographische Orientierung der Mausnetzhaut bereitzustellen. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie eine zuverlässige Möglichkeit bieten, die dorsalen, ventralen, nasalen und temporalen Pole einer isolierten Mausnetzhaut genau zu identifizieren. Beginnen Sie damit, einen Punkt auf der dorsalen Hornhaut in der Nähe der Grenze der Hornhaut und zwischen dem nasalen und temporalen Canthi zu identifizieren.Berühren Sie die Hornhaut mit einem erhitzten Kauterstift weniger als eine Sekunde lang, um eine Brandspur zur Orientierung zu erzeugen. Wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Auge. Das Vorhandensein einer dorsalen Verbrennung ermöglicht die Identifizierung des Musculus rectus superior (Musculus rectus superior).Für die Enukleation schiebst du das Auge mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig aus seiner Augenhöhle und greifst die Kugel von unten. Heben Sie dann die Kugel langsam aus ihrer Fassung und bewegen Sie sie gleichzeitig sanft von links nach rechts, bis die Kugel aus der Fassung gelöst wird. Übertragen Sie den Globus mit den daran befestigten Rektusmuskeln in eine Petrischale, die das Präpariermedium enthält.Wenn Sie mit beiden Augen arbeiten, achten Sie darauf, welches Auge das linke und welches das rechte Auge ist. Lokalisieren Sie im Dissektionsbereich visuell die dorsale Hornhautverbrennung und identifizieren Sie den Musculus rectus superior, mit dem er verbunden ist. Mit einer Präparierschere oder einer 20-Gauge-Nadel stechen Sie die Hornhaut an der Brandmarke.Machen Sie dann einen tiefen, entlastenden Schnitt in die Kugel in Richtung des Sehnervs, um den oberen Muskel zu halbieren. Hier ist eine isolierte Netzhaut mit diesem Schnitt zu sehen, und hier ist eine rekonstruierte Netzhaut mit diesem Schnitt zu sehen. Verwenden Sie zwei Pinzetten, um die Netzhaut zu isolieren, indem Sie das durch die Punktion entstandene Loch vorsichtig aufreißen, bis ein Teil der Netzhaut freigelegt ist.Ziehen Sie dann die Netzhaut von der Sklera auseinander, bis die Sklera vollständig entfernt wurde. Entfernen Sie die Iris, die Linse, den Glaskörper und alle verbleibenden Strukturen, bis die Netzhaut vollständig isoliert ist. Das Vorhandensein einer dorsalen Verbrennung ermöglicht die Identifizierung der nasalen und temporalen Aderhautfissur.Wenn mit dem rechten Auge gearbeitet wird, befindet sich die Aderhautfissur rechts von der Verbrennung und die Aderhautfissur links von der Verbrennung. Dies ist das Gegenteil der Arbeit mit dem linken Auge. Um den Orientierungspunkt der Aderhautfissur zur Identifizierung der Netzhautausrichtung zu verwenden, lokalisieren und identifizieren Sie die Aderhautfissur auf dem Augenhintergrund.Richten Sie den Globus so aus, dass sich die dorsale Brandmale am oberen Pol befindet, so wie es der Fall wäre, wenn sich das Auge noch in der Maus befände. Verwenden Sie dann eine Präparierschere oder eine 20-Gauge-Nadel, um eine Punktion in die Kugel zu machen, zuerst dort, wo sich die dorsale Verbrennung befindet. Machen Sie als Nächstes einen flachen, entlastenden Schnitt in Richtung des Sehnervs, wo sich die dorsale Hornhautverbrennung befindet.Machen Sie dann die folgenden zwei tiefen, entlastenden Schnitte in Richtung des Sehnervs. Zum einen, indem die Klingen der Präparierschere mit der Schläfenspalte auf dem Augenrücken ausgerichtet werden, und zum anderen, indem die Klingen der Präparierschere mit der Nasenspalte auf dem Augenhintergrund ausgerichtet werden. Diese Schnitte sind hier auf einer isolierten und rekonstruierten Netzhaut zu sehen.Nachdem Sie diese Schnitte gemacht haben, verwenden Sie zwei Pinzetten, um die Einstichlöcher vorsichtig wegzureißen, bis ein Teil der Netzhaut freigelegt ist. Machen Sie mit einer Präparierschere vier entlastende Schnitte in die Netzhaut, so dass sie flach aufliegt. Befestigen Sie die Netzhaut mit der Ganglienzellseite nach oben auf der Nitrozellulosemembran, indem Sie jede Ecke der Netzhaut vorsichtig mit einer Pinzette auf die Membran drücken.Tauchen Sie dann die montierte Netzhaut mit einer Pinzette in einen Milliliter 4%igen Paraformaldehyds, der in der ersten Vertiefung einer 24-Well-Platte enthalten ist. Legen Sie die 24-Well-Platte bei Raumtemperatur auf einen Orbitalschüttler und fixieren Sie die Netzhaut genau 40 Minuten lang. Übertragen Sie die Netzhaut nach dem Fixieren in die zweite Vertiefung der Platte, die mit einem Milliliter 0,1 molaren PBS gefüllt ist, und waschen Sie die Netzhaut 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.Wenn der Waschvorgang abgeschlossen ist, übertragen Sie die montierte Netzhaut in die fünfte Vertiefung mit einem Milliliter Blockierungslösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag geben Sie den Kaninchen-Anti-S-Opsin-Primärantikörper in einer Konzentration von eins bis 500 in die Blockierungslösung und inkubieren Sie drei Tage lang bei vier Grad Celsius. Nach der dreitägigen Inkubation waschen Sie den überschüssigen Primärantikörper sechsmal von der Netzhaut, indem Sie ihn nacheinander für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in sechs Vertiefungen mit einem Milliliter PBS füllen.Legen Sie dann die gewaschene Netzhaut in eine Vertiefung mit frischer Blockierungslösung und fügen Sie den Esels-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper Alexa 594 hinzu. Inkubieren Sie die Netzhaut mit dem Sekundärantikörper über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Netzhaut nach der Inkubation wie zuvor sechsmal in PBS.Übertragen Sie die montierte Netzhaut mit einer Pinzette in eine Petrischale, die PBS enthält. Lösen Sie die Netzhaut von der Nitrozellulosemembran, indem Sie die Spitzen der Pinzette vorsichtig zwischen Netzhaut und Membran einführen, bis die Netzhaut nicht mehr befestigt ist. Tauchen Sie einen Objektträger aus Glas in das PBS und befestigen Sie die Netzhaut auf dem Objektträger, indem Sie ihn auf den Objektträger schweben lassen und ihn vorsichtig mit einer Pinzette anstoßen, bis die Netzhaut am Glas klebt.Decken Sie die Netzhaut auf dem Objektträger mit einem Eindeckmedium ab und legen Sie ein Deckglas 1,5 auf. Legen Sie den Objektträger in eine Objektträgerablage und lassen Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur ruhen. Stellen Sie die Schiebeschale nach einer Stunde auf vier Grad Celsius auf.Nachdem die Folie 24 Stunden lang abgedeckt wurde, verwenden Sie Nagellack, um die Seiten der Folie zu versiegeln, um ein Austrocknen zu verhindern. Dies ist ein Beispiel für eine Netzhaut, die aus dem rechten Auge isoliert wurde, immungefärbt wurde, um S-Opsin zu markieren, und mit einem Epifluoreszenzmikroskop abgebildet wurde. Es ist wichtig zu beachten, dass die Schnitte in dieser Netzhaut willkürlich sind, da die topographische Ausrichtung durch den S-Opsin-Gradienten identifiziert werden kann.Das aufgenommene Bild der Netzhaut kann dann mit der ReadiStruct-Software digital rekonstruiert werden. Die Originalschnitte sind in diesem Bild pseudorot gefärbt. Beachten Sie, dass die Ausgabedatei dieses Programms die Netzhaut nicht korrekt ausrichtet.Nachdem die Netzhaut den benutzerdefinierten Mattenlaborcode durchlaufen hat, wird die Netzhaut so gedreht, dass die höchste Konzentration der S-Opsin-Färbung am unteren Rand platziert und als ventrale Netzhaut identifiziert wird. Dieses Bild zeigt die Netzhaut eines linken Auges. Der Schläfenpol befindet sich in einem Winkel von 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn vom ventralen Pol und der Nasenpol befindet sich in einem Winkel von 90 Grad im Uhrzeigersinn vom ventralen Pol.Einmal gemeistert, können diese Seziertechniken ziemlich schnell in nur wenigen Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Netzhaut der Maus mit dem oberen Rektusmuskel, der Aderhautfissur oder dem S-Opsin-Gradienten als Orientierungspunkt genau und zuverlässig ausrichten können.

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Wo schneiden Sie Angelegenheiten: Eine Dissektion und Analyse-Leitfaden für die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus von okulären Sehenswürdigkeiten (Video) | JoVE Journal

Wo schneiden Sie Angelegenheiten: Eine Dissektion und Analyse-Leitfaden für die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus von okulären Sehenswürdigkeiten

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