Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Diagnose von myeloiden Erkrankungen wie Myelodysplasie-Syndrome oder andere hämatologische Erkrankungen zu beantworten, die sich mit Reifeanomalien in myeloiden Zelllinien entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Subjektivität des Prüfers bei dieser Analyse und Interpretation verringert. Diese Methode kann Einen Einblick geben, welche die diskriminierendsten Parameter für Myelodysplasie sind.

Es ermöglicht die Quantifizierung der Unterschiede zu normalen myeloischen Zellpopulationen. Demonstriert wird das Verfahren von Tiphanie Picot, einem Postdoktoranden aus unserem Labor. Beginnen Sie mit dem Mischen von 600 Mikrolitern der primären Zellprobe mit 10 Milliliter Waschpuffer in einem 15 Milliliter Konustube für zwei Zentrifugationen und 10 Milliliter frischer Waschpuffer pro Waschgang.

Nach der zweiten Wäsche das Pellet in 400 Mikroliter frischer Waschpuffer wieder aufhängen und 350 Mikroliter der Zellsuspension in ein fünf Milliliter Polypropylen-FACS-Rohr übertragen, das die gesamte Platte von Backbone-Antikörpern enthält. Nach gründlichem Mischen der Zellen, Pipette gleiche Volumen der Zellantikörperlösung in drei neue Polypropylen-Röhren, und bringen Sie das endgültige Volumen in jedem Rohr bis zu 200 Mikroliter mit frischem Waschpuffer bei Bedarf. Als nächstes fügen Sie das entsprechende Volumen von Antikörpern gegen die Zelloberflächenmarker von Interesse mit Mischen, für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.

Am Ende der Inkubation zwei Milliliter Lysing-Lösung mit Mischen hinzufügen, für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Sammeln Sie die lysierten Zellen durch Zentrifugation, und entsorgen Sie alle bis auf die letzten 50 Mikroliter Überstand in jedem Rohr, ohne das Pellet zu stören. Die Pellets im verbleibenden Überstand mit sanftem Mischen wieder aufhängen und jeder Probe zwei Milliliter frischen Waschpuffer hinzufügen.

Nach der zweiten Wäsche, entsorgen Sie den Überstand, so dass etwa 50 Mikroliter Restvolumen in jedem Rohr, ohne das Pellet stören. Das Pellet in 200 Mikroliter PBS mit Mischen wieder aufhängen, zur sofortigen Analyse. Um die Proben auf einem Durchflusszytometer zu lesen, öffnen Sie zunächst ein neues Experiment in der Durchflusszytometer-Software, und benennen Sie das Experiment entsprechend dem Namen, dem Probentyp und dem Datum um.

Erstellen Sie eine neue Probe für drei Röhren, und geben Sie die Antikörper an, die in jedem Rohr im Experimentlayout verwendet werden. Öffnen Sie die Zytometereinstellungen, und wählen Sie Anwendungseinstellungen aus, um die in der monatlichen Einrichtung erhaltenen Werte anzuwenden. Öffnen Sie ein neues globales Arbeitsblatt, und erstellen Sie die entsprechenden Punktdiagramme zum Gating der Singlet-Zellen sowie für die Populationen Granulozyt, Monozyten, Explosion und Lymphozyten.

Erstellen Sie ein neues globales Arbeitsblatt für die Vergütungssteuerelemente. Erwerben Sie dann 500.000 Ereignisse aus jeder Röhre, mit einer mittleren Erfassungsrate, und exportieren Sie die Daten nach ihrer technischen Validierung als fcs 3.0-Dateien. Laden Sie vor Beginn einer neuen Analyse die Cyt-Dateien mit den normalen Knochenmarkdaten für neutrophile, monozytäre und nukleierte rote Linien sowie die Analysedateien im Inp-Format herunter.

Speichern Sie dann die Daten auf Ihrem Desktop. Um die Neutrophilenreifung in der Datenbank zu speichern, öffnen Sie zuerst die Infinicyt-Software und dann die Cyt-Datei, die den Neutrophilen-Reifungsdaten entspricht. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm, und speichern Sie den Reifungspfad des Neutrophilen in der Datenbank.

Öffnen Sie die fcs-Datei für die neutrophile Abstammungsreifung, die analysiert werden muss. Laden Sie die Neutrophilen-Reifungs-Inp-Datei von der Registerkarte Profile hoch. Die Analyse für diese Abstammung ist in drei Schritte unterteilt.

Beginnen Sie mit der Auswahl der CD34-positiven, neutrophilen Sprengungen. Verwenden Sie dazu einen Schnittpunkt von sieben Gates, um die Auswahl der CD34-positiven, CD117-positiven, HLADR-tief, CD10-negativ, CD13-positiven, CD11 b-negativen Ereignisse zu ermöglichen. Setzen Sie die Analyse mit der Auswahl der CD117-positiven, CD34-negativen Neutrophilen-Vorstufen fort.

Setzen Sie die Analyse mit der Auswahl reiferer neutrophiler Zellen fort. Zeigen Sie als Nächstes die Analyse monozytierter Linienzellen. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm.

Stellen Sie sicher, dass der Pfeil, der den Reifungssinn angibt, von unreifen, monozytischen Zellen, CD14 negativ, IREM2 negativ, zu den reifen Monozyten, CD14 positiv, IREM2 positiv ausgerichtet ist. Speichern Sie den Reifungspfad für monozytäre Abstammung in der Datenbank. Öffnen Sie die fcs-Datei für monozytische Linienreifung, die analysiert werden muss.

Laden Sie das Profil für die monozytische Abstammungsanalyse hoch. Um die monozytäre Abstammungszellen zu identifizieren, verwenden Sie einen Schnittpunkt von vier Gates, der die Auswahl von CD64-positiven, CD117-positiven, CD117-positiven, HLADR-positiven Ereignissen ermöglicht. Weisen Sie diese Ereignisse der monozytischen Registerkarte in der Bevölkerungshierarchiestruktur zu.

Öffnen Sie die NRC-Cyt-Datei, die in der NRC-Datenbank gespeichert werden muss. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm, und speichern Sie den Nukleated Red Cells-Reifungspfad in der Datenbank. Öffnen Sie die fcs-Datei, die analysiert werden muss.

Laden Sie aus den Profilen die Vorlage für die Analyse für nukleierte rote Zellen hoch. Die Analyse für diese Abstammung ist in zwei Schritte unterteilt. Beginnend mit der Auswahl der CD34 positive, erythroid begangen Explosionen.

Verwenden Sie hier einen Schnittpunkt von sieben Gates, um die Auswahl der CD34-positiven, CD117-positiven, HLADR-tief, CD105-positiven, CD33-negativen, CD36-positiven, CD71-positiven Ereignisse zu ermöglichen. Weisen Sie diese Ereignisse der Registerkarte NRC in der Bevölkerungshierarchie zu. Entfernen Sie die CD34 positive Erythroid begangen Eblasten aus der Sichtbarkeit.

Um reifere Erythroidzellen zu identifizieren, verwenden Sie einen Schnittpunkt von vier Gates, die die Diskriminierung von CD45-Negativ und CD45-positivem Tief, Side-Scatter-Tief, CD36-positiv-hoch und CD71-positiv hoch ermöglichen. Entfernen Sie dann die CD36-Hochseite, die niedrige Thrombozyten aus den nukleierten roten Zellen streuen, und weisen Sie diese Grundgesamtheit der Registerkarte NRC zu. Um die myeloische Reifung im Knochenmarkfach zu beurteilen, öffnen Sie die Zyt-Datei entsprechend der Interessenlinie aus dem zu bewertenden Fall.

Halten Sie nur die Ereignisse sichtbar, die der Registerkarte Neutrophil in der Bevölkerungshierarchie zugewiesen sind. Zeichnen Sie den Reifungsweg auf dem APS-Diagramm, und laden Sie die Datenbank, die der Reifung des Neutrophilen im normalen Knochenmark entspricht, und vergleichen Sie Die Daten. Wenn die Daten zumindest teilweise kompatibel sind, erstellt die Software ein normalisiertes Reifungsdifferenzdiagramm und ein Parameterband, um die Reifungsunterschiede zu visualisieren.

Um die Monozytenreifung im Knochenmarkfach zu vergleichen, öffnen Sie für einen neuen Fall mit Daten aus normalen Knochenmarken, einschließlich in der Monozytendatenbank, die Cyt-Datei, die der monozytigen Zelllinie entspricht. Halten Sie nur die Ereignisse, die der Registerkarte Monozyten in der Hierarchiestruktur der Basishaben zugewiesen sind, sichtbar, und zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm. Laden Sie die Datenbank, die der Monozytenreifung in normalen Knochenmarkierungen entspricht, und vergleichen Sie Daten.

Um die Nukleated Red Cells Reifung im Knochenmarkfach zu vergleichen, für einen neuen Fall, mit Daten aus den normalen Knochenmark, die in der NRC-Datenbank enthalten sind, öffnen Sie die Cyt-Datei entsprechend der NRC-Linie. Halten Sie nur die Ereignisse sichtbar, die der Registerkarte NRC in der Bevölkerungshierarchie zugeordnet sind. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm.

Laden Sie die Datenbank, die der NRC-Reifung entspricht, in normale Knochenmarkren, und vergleichen Sie Daten. Um dann die Bedeutung der Unterschiede zwischen der neuen Datei und den in der Datenbank enthaltenen Daten zu visualisieren, klicken Sie auf normalisierte Reifungsunterschiede und Zoomen. Denken Sie daran, dass Methoden, die die hierarchischen Klassifizierungsalgorithmen in der Flusszytometrischen Datenanalyse verwenden, sehr subjektiv und von Natur aus ungenau sind, da sie für die Überlappung der Zellpopulation nicht zählen.

Die Bewertung neuer Fälle von Zytopenie, bei denen der Verdacht besteht, mdS zu sein, anhand der myeloischen Normalreifungsdatenbanken, ermöglicht die Identifizierung von anormal exprimierten Reifungsantigenen von Neutrophilen-, Monozyten- und NRC-Linien, selbst in Fällen ohne zytologische oder zytogene Anomalien. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die zytometrischen Daten des Durchflusses in standardisierter Weise zu erfassen, um monatliche Zytometereinstellungen, tägliche Kontrollen durchzuführen, den Antikörper vor gebrauchen rigoros zu pipetten und die Färbezeiten einzuhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Kompass durchgeführt werden, um die verschiedenen Gruppen von Fällen zu vergleichen und zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. was der endgültige typische Abdruck für eine bestimmte Gruppe von Fällen ist.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher, die an der Erforschung myeloischer Zellreifungsmuster interessiert waren, in Fällen klonaler Hämatopoese unbestimmten Potenzials, um die endgültigen typischen Veränderungen zu identifizieren, die zuverlässig mit dysplastischen Verfahren zusammenhängen. Bitte beachten Sie, dass die Aktualisierung der Datenbank mit einer erhöhten Anzahl von Daten von gesunden Spendern die Robustheit der Analyse verbessern kann.