Name: In Vivo Mikrodialyse-Methode, um große extrazellulären Proteine Sammeln von Gehirn interstitielle Flüssigkeit mit hochmolekularen Gewicht Cut-Off-Sonden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Mikrodialyse zur Sammlung großer extrazellulärer Proteine aus der Gehirn-Interstitialflüssigkeit bei wachen, frei beweglichen Mäusen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen neuronaler Signalwege.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt von '' Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Gehirn Protein Altern und Demenz Control)(15H01552) aus MEXT und Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (16K 20969). Der Autor dankt Dr. David M. Holtzman und Dr. John R. Cirrito für die technische Beratung bei der Entwicklung dieser Methode.

Alle Tierversuche wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Use Committee der Graduate School of Medicine an der University of Tokyo.
1. präoperative Verfahren
<ol><li>Wischen Sie vor Beginn der Operation alles mit 70 % Ethanol, sterile Bedingungen beizubehalten. Thermischen Unterstützung mit einem Heizkissen wird empfohlen.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Chloral Hydrate (400 mg/kg). Anesthetization durch Ausführen einer Zehe Klemme zu bestätigen. Meloxicam SR auf Induktion und Buprenorphin bei Wiederherstellung Gebot wird für mindestens 24 Stunden empfohlen.</li>
	<li>Rasieren Sie die Haare mit einem chirurgischen Clipper. Befestigen Sie eine Maus in der Maus und der neonatalen Ratte Adapter mit Ohr-Bars und eine Nase Klammer. Hinweis: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass Maus-Kopf ist zu diesem Zeitpunkt gesichert und bewegt sich nicht Side-by-Side.</li>
	<li>Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.</li>
</ol>(2) stereotaktischen Chirurgie für Guide Kanüle Implantation
<ol><li>Legen Sie die Maus und neonatalen Ratte-Adapter auf dem stereotaktischen Gerät. Machen Sie einen Schnitt sagittal auf der Haut über den Schädel mit einem Skalpell.　Blut und das Bindegewebe auf den Schädel mit einem feuchten Wattestäbchen abwischen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Koordinate für die Region des Gehirns mit Gehirn-Atlas. Messungen, vergewissern Sie sich vor dieser Mittellinie ist gerade, so dass die Bohrkrone A / P verschoben und bleiben auf der Mittellinie Naht die ganze Zeit. Hinweis: Dieser Artikel verwendet die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/V:-1,20 mm, 12 Grad) hinteren Hippocampus ausrichten.</li>
	<li>Ebene Schädel A-P<ol>
<li>Legen Sie eine Bohrmaschine auf einen Manipulator stereotaktischen Rahmen. Senken Sie den Bohrer zu, bis er sanft Lambda berührt und notieren Sie ihre ventralen Koordinate. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Bregma. Hinweis: Wenn der Schädel abgeglichen wird, ist die vertikale Messung der Bregma gleich der Lambda. Wenn nicht, passen Sie die Höhe der Nase Klemme entsprechend an. Nachdem der Schädel nivelliert wird, zeichnen Sie die vorderen/hinteren, seitlichen Koordinate des Bregma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ebene Schädel links-rechts<ol>
<li>Verschieben Sie den Bohrer aus Bregma in die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), den Bohrer an den Schädel zu senken und die vertikale Koordinate aufzeichnen. Dann wiederholen Sie diesen Vorgang für die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm). Hinweis: Wenn der Schädel abgeglichen wird, entsprechen diese vertikale Messungen von zwei äquidistanten Punkten von der Mittellinie. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Höhe der Ohr-Bars.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bohren Sie vorsichtig an den Ziel-Koordinaten Grat (A / P:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm), eine Führer-Kanüle zu implantieren. Wenn der Durchmesser eines Bohrlochs nicht groß genug für eine Anleitung Kanüle Implantation ist, Bohren Sie ein weiteres Loch, das mit dem ersten überlappt. Bohren Sie ein weiteres Loch am rechten (kontralateralen Seite) Parietal Knochen und einsetzen Sie eine Knochenschraube, die hilft, um dental Zement in 1.10 (siehe Abbildung 1 b) zu sichern.</li>
	<li>Geschnitten Sie ein rundes Verriegelungs Stück von der Rückseite des Deckels eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen durch eine Rasierklinge und machen Sie eine '' Krone ''. Diese Krone wird verwendet, um dental Zement Ausbreitung auf der Haut zu verhindern. Legen Sie es auf den Schädel, so dass der Grat Löcher in Schritt 2.5 innerhalb des Kreises (siehe Abbildung 1 bleiben).</li>
	<li>Einrichten einer stereotaktischen Versammlung indem ein Leitfaden Kanüle auf den kürzeren Arm einer stereotaktischen Adapter und befestigen Sie es mit einer Hutmutter. Den längeren Arm des stereotaktischen Adapters auf die Elektrode Klammer gesetzt. Legen Sie es auf dem Manipulator des stereotaktischen Apparats (siehe Abbildung 1A).</li>
	<li>D-V Stereotax Montage auf den Greifarm durch 12 Grad (siehe Abbildung 1 b) drehen. Wechseln Sie die Führer-Kanüle an des Bohrlochs in 1.6 gemacht Setzen Sie die Guide-Kanüle langsam ins Gehirn von 1,2 mm Tieferlegung. Hinweis: Der Winkel der Sonde ist spezifisch für den Hippocampus; andere Regionen können überhaupt keine Winkel oder andere Winkel erforderlich. Einen Gehirn-Atlas für genaue Koordinaten zu konsultieren. Trocknen Sie die Oberfläche des Schädels, denn wenn nicht der Zement nicht haften und Zement GAP verdrängt werden kann</li>
	<li>Fügen Sie den dental Zement innerhalb der Krone voll decken das Metallteil der Führer-Kanüle und Knochenschraube genug um sie zu sichern. Gelten Sie zusätzliche dental Zement ist ein Teil des Schädels ausgesetzt.</li>
	<li>Warten Sie, bis dental Zement vollständig getrocknet ist (~ 12-20 min). Die Elektrode Klemme entfernen Sie den stereotaktischen Adapter. Entfernen Sie die Überwurfmutter und Ersetzen des stereotaktischen Adapters mit einer Dummy-Sonde und die Hutmutter befestigen.</li>
	<li>Lassen Sie die Maustaste aus dem stereotaktischen Gerät und Haus der Maus allein in einen einzelnen Käfig. Hinweis: Die Maus sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Überprüfen Sie die Maus täglich bis zum Tag der Mikrodialyse. Die Maus erhält NSAIDs wie Carprofen, wenn es Schmerzen zu haben scheint. 2 Wochen zu warten ist für Schlaf-Wach-Studien notwendig, damit die Maus an die neue Umgebung10 gewöhnt, aber andere Arten von Studien kürzere Erholungszeiten (z. B. 1-2 Tage erfordern).</li>
</ol>(3) Mikrodialyse Setup
<ol><li>Qualitäts-Check der Sonden: Füllung eine Einweg-1ml-Spritze mit destilliertem Waterand schließen Sie es an die Steckdose (kürzere Port) einer Sonde mit einem Byton Rohr. Decken Sie die Lüftungsschlitze mit den Fingern, und drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig, um Wasser, um die Sonde einflößen. Prüfen Sie, ob Wasser von der Sonde Einlass erscheint und gibt es keine Leckage auf der Oberfläche einer Mikrodialyse-Membran.<ol>
<li>Aktivierung der Sonden: die Membranen der Sonde in Ethanol (70-100 %) für zwei Sekunden Tauchen. Dann die Infusion destillierten Wassers in die Sonde wieder mit einer Spritze wieder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Perfusion Puffer: um Haftung der Zielmoleküle für die Schläuche zu vermeiden, fügen Sie BSA durch Verdünnung 30 % BSA Lösung auf 4 % mit künstlichen CSF (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM Nahco33 , 122 mM NaCl, pH = 7,35), entspricht die Elektrolytkonzentration im CSF, unmittelbar vor dem Gebrauch. Filtern des Perfusion Puffers durch eine Spritze Filtereinheit mit 0,1 µm Porengröße. Hinweis: 4 % BSA verbessert die Erholung zum Aufkleben Proteine aber kann schränken Lieferung von Verbindungen, vor allem für Verbindungen, die hohe BSA-Bindung aufweisen. Dies ist ein Vorteil der Verwendung niedriger Konzentration von BSA (z. B. 0,15 %) in bestimmten Instanzen-3. Beachten Sie, dass die BSA kann sehr leicht zusammenfassen, wenn Wirbel oder rühren Platte bewegt. Diese Aggregate können Sonden oder Membranporen verstopfen. Seien Sie vorsichtig bei der Vorbereitung einer BSA-Lösung um diese Aggregation zu begrenzen</li>
	<li>Bereiten Sie zwei getrennte Leitungen für Einlass und Auslass (siehe Abbildung 1) und verbinden Sie beide Linien mit einer Verbindung Nadel. Füllen Sie eine Einweg-3 mL Spritze mit Perfusion Puffer gefüllt und verbinden Sie es mit dem Einlass-Ende des Schlauches mit einer stumpfen Ende Nadel. Füllen Sie das gesamte Rohr mit Perfusion Puffer durch die Spritzenpumpe läuft.</li>
	<li>Stoppen Sie die Spritzenpumpe und ersetzen Sie die Anschluss-Nadel zwischen Einlass und Auslass-Linie mit einem aktivierten Mikrodialyse-Sonde aus Schritt 3.3 (siehe Abbildung 1). Diese Ersetzung vorgelegt die Überwurfmutter an der Sonde.</li>
	<li>Die Tuchwelle in den Auslass-Schlauch auf der Walze-Pumpe zu montieren. Starten Sie die Spritzenpumpe mit 10 µL/min und dann die Walze Pumpe etwas langsamer Durchfluss (9.5-9,8 µL/min). Achten Sie darauf, alle Luftblasen in den gesamten Schlauch entfernen, die die Erholung beeinflussen können, wenn sie die Sonde in Kraft.</li>
	<li>Die Maus von Schritt 1.12 auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.2 zu betäuben. Legen Sie das Maus-Halsband um den Hals. Entfernen Sie die Überwurfmutter und Dummy-Sonde und langsam eine Mikrodialyse-Sonde von 3.4 durch die Führer-Kanüle und befestigen Sie die Hutmutter.</li>
	<li>Statt der Maus in den Käfig zu einem frei beweglichen System und die Maus mit dem Halsband Leine verbunden. Spritzenpumpe und Walze Pumpe mit der angegebenen Volumenstrom in 3.5 für mindestens 1 h Schritt läuft weiter. Hinweis: Um ISF Sammlung von Tieren, wach zu erreichen, verwendet dieser Artikel eine frei bewegliches System, wo ein Tier Bewegung Schläuche verdrehen halten der Käfig selbst entspricht. Alternativ können auch flüssige Wirbel von verschiedenen Firmen verwendet werden.</li>
	<li>Stop die Walze Pumpen zuerst und dann die Spritzenpumpe. Legen Sie die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit. Führen Sie die Spritze Pumpe 20 % schneller als die Roller-Pumpe. Hinweis: zum Beispiel, wenn Sie mit 1 µL/min laufen, betreiben die Spritzenpumpe bei 1,2 µL/min. optimale Durchflussmenge sollte für jedes Molekül empirisch ermittelt werden.</li>
	<li>ISF Proben: Legen Sie das freie Ende des Auslass-Schlauch auf den gekühlten Fraktionssammler. Hinweis: Geeignete Probenvolumen variiert je nach Assays für die Analyse verwendet.</li>
	<li>Nach Abschluss des Experiments Entfernen der Sonde. (Zu betäuben die Maus je nach Bedarf.)  Behandeln Sie Maus Erholung genauso wie in Schritt 2.11. Analysieren Sie die gesammelten ISF durch Methoden wie HPLC oder ELISA.</li>
	<li>Um das gesamte Rohr nach Mikrodialyse waschen, verbinden Sie Einlass und Auslass Schläuche wieder, indem Sie die Sonde mit der Verbindung Nadel und verdünnte Bleichmittel in das gesamte Rohr laufen und dann mit Wasser spülen. Trocknen Sie und bewahren Sie es für eine wiederholte Verwendung. Hinweis: Andere Schläuche sind akzeptabel, jedoch BSA in Perfusion Puffer kann die Schläuche mit kleinem Durchmesser verstopfen, so gelten diese Schläuche als Einweg. Die Schläuche können abgenutzt oder verstopft nach mehreren Verwendungen, so stellen Sie sicher, dass der Durchfluss konsequent vor jeder Inbetriebnahme ist.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

Der Autor hat nichts preisgeben.

Mikrodialyse mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten hat von einem Push-Pull-Modus betrieben werden, so ist es wichtig, dass die Durchflussmenge genau und konstant sind. Die Ungenauigkeit in der Durchflussmengen kann die Ursache der Luftblase Generation und Inkonsistenz in der probenkonzentration sein. Wenn der Fluss inkonsistent ist, prüfen Sie alle Anschlüsse auf Dichtheit. Wenn das Problem weiterhin besteht, kann es mit neuen Sonden und Schläuche Neustart erforderlich.
Microdilay...

ISF umfasst 15-20 % der gesamten Hirnvolumen und bietet eine Mikroumgebung für Signaltransduktion, substrattransport und Abfälle Clearance1von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Möglichkeit des Sammelns ISF von lebenden Tieren größere Auswirkungen für verschiedene biologische Prozesse sowie Krankheitsmechanismus bieten. In Vivo Mikrodialyse ist eine der wenigen Methoden, die Probe und extrazelluläre Moleküle von ISF von Wachen, frei beweglichen Tieren zu quantifizieren und dient damit als ein nützliches Werkzeug in der neurowissenschaftlichen Forschung Feld2,3. Bei dieser Methode werden Mikrodialyse Sonden mit halbdurchlässigen Membranen im Gehirn und mit Perfusion Puffer auf die relativ langsame Fließgeschwindigkeit durchströmt (0,1-5 µL/min). Während dieser Perfusion extrazelluläre Moleküle im ISF passiv in die Sonde nach dem Konzentrationsgefälle diffundieren und sammeln Sie wie ein Dialysat. Obwohl dieser Artikel konzentriert sich auf die Methode zum Beispiel ISF im Gehirn, können das Prinzip und die Methode auf andere Organe durch entsprechende Modifikation bei Bedarf angewendet werden.
Mikrodialyse arbeitete zuerst in den frühen 1960er Jahren, und seit dann es ausgiebig verwendet wurde, um kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter im Gehirn zu sammeln. Aktuelle kommerzielle Verfügbarkeit der Mikrodialyse Sonden mit hochmolekularen Gewicht Membranen (100 kDa-3 MDa) abgeschnitten hat jedoch seine Anwendung auf relativ größere Proteine in ISF sowie4,5,6 erweitert. ,7. Die Studien mit diesen Sonden führte zu der Feststellung, dass Proteine wie Tau oder α-Synuclein, die lange werden exklusive zytoplasmatischen sind auch physiologisch in ISF4,5,8.
Eines der Probleme mit Mikrodialyse Sonden mit großen Cut-off-Membranen (in der Regel mehr als 1.000 kDa) ist, dass sie anfälliger für Ultrafiltration Flüssigkeitsverlust durch den inneren Druck in den Sonden angesammelt. Mikrodialyse Sonden verwendet hier haben eine einzigartige Struktur, um dieses Problem zu vermeiden. Der Druck wird nicht durch diese Struktur aufgebaut werden, so sollten Mikrodialyse mit diesen Sonden betrieben werden, in eine "Push-Pull"-Modus über eine Spritzenpumpe zum durchspülen von Sonden (= Push) und eine Walze/Peristaltikpumpe, das Dialysat kommen aus der Sonde Steckdose zu sammeln (= ziehen) 9 (obwohl es sowohl Push-als auch Pumpen, durch Druck abbrechen Luftlöcher vorhanden in den Sonden braucht der technisch nur Antrieb erfolgt durch die Pull-Pumpe). Dieser Artikel beginnt mit der stereotaktischen Operation ein Leitfaden Kanüle Implantation und beschreibt, wie Mikrodialyse Zeilen einrichten, um ISF durch Mikrodialyse Sonden mit 1.000 kDa Cutoff Membranen zu sammeln.

<table><tbody><tr><td>Der Univentor 820 Mikroprobensammler</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Kühlfraktionssammler</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Rollenpumpe</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn Stand-Alone-System</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>Freibewegliches System</td></tr><tr><td>Käfig-Kit für zwei Spezies</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>AtmosLM Mikrodialysesonde (Schaftlänge 8 mm, Membranlänge 2 mm)</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>PEP-8-02</td><td>Die Schaftlänge für eine Sonde, eine Führung, eine Dumy-Sonde und einen stereotaktischen Adapter sollte identisch sein.</td></tr><tr><td>Mikrodialyse-Schablone (Schaftlänge 8 mm)</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse-Dummy-Sonde (Schaftlänge 8 mm)</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>Knochenschraube</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C& B-Set</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Zahnzement</td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument für Kleintiere mit digitaler Anzeigekonsole</td><td>Kopf</td><td>Modell 940</td><td>Stereotaktisches Gerät</td></tr><tr><td>Adapter für Maus und Neugeborenenratte</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Ohrbügel und Gummispitzen für Maus Stereotaxisches</td><td>Stoelting</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Albuminlösung aus Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td><td>30% BSA-Lösung</td></tr><tr><td>FEP-Schlauch (70 cm)</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>JF-10-70</td><td>Innenvolumen = 0,5 & Mikro; L/cm</td></tr><tr><td>Teflonschlauch (50 cm)</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>JT-10-50</td><td>Innenvolumen = 0,08 & Mikro; L/cm</td></tr><tr><td>Byton-Röhrchen</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Luer-Stab-Adapter 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Nadel mit stumpfem Ende</td></tr><tr><td>Rollenschlauch</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>RT-5S</td><td>Innenvolumen = 4 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Hutmutter</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0,25 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Kappe</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Röhrchen für Fraktionssammler</td></tr><tr><td>Sterotaxischer Adapter (Schaftlänge 8 mm)</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Verbindungsnadel</td><td>Eicom Mikrodialyse</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>Maus Tierhalsband</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Bohrer</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Schraubendreher für Knochenschrauben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgischer Haarschneider</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo mikrodialyse-methode, um große extrazellulären proteine sammeln von gehirn interstitielle flüssigkeit mit hochmolekularen gewicht cut-off-sonden

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Mikrodialyse ist eine leistungsstarke Technik, ISF von wach, frei Verhalten Tieren basiert auf einem Prinzip der Dialyse zu sammeln. Während Mikrodialyse eine etablierte Methode, die relativ kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter misst ist, wurde es vor kurzem zur Dynamik von größeren Molekülen in ISF mit Sonden mit hohem Molekulargewicht abgeschnitten bewerten Membranen. Bei Verwendung solcher Sonden, muss Mikrodialyse in einem Push-Pull-Modus zu Druck im Inneren der Sonden angesammelt ausgeführt werden. Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle einschließlich stereotaktischen Chirurgie und Mikrodialyse Linien einrichten, um Proteine von ISF zu sammeln. Während Mikrodialyse können Medikamente systemisch oder durch direkte Infusion in ISF verabreicht werden. Umgekehrte Mikrodialyse ist eine Technik, um direkt Verbindungen in ISF einfließen. Aufnahme von Medikamenten in der Mikrodialyse Perfusion Puffer ermöglicht es ihnen, durch die Sonden in ISF diffundieren, während gleichzeitig die ISF zu sammeln. Durch die Messung von Tau-Protein als Beispiel, zeigt der Autor, wie die Ebenen auf anregende neuronaler Aktivität durch umgekehrte Mikrodialyse Picrotoxin verändert werden. Vorteile und Grenzen der Mikrodialyse werden zusammen mit dem erweiterten Programm beschrieben, durch die Kombination von anderen in-Vivo -Methoden.

Um zu stimulieren oder hemmen neuronalen Aktivität in umgekehrter Mikrodialyse11,12,13, Picrotoxin, GABA-A -Rezeptor-Antagonisten oder Tetrodotoxin, Na+ -Kanal-Blocker verwendet wurden. Es hat sich gezeigt, dass Tau Freigabe durch Erhöhung der neuronalen Aktivität13,14angeregt wird. Einklang mit diesen frühere Beobac...

In Vivo Mikrodialyse ermöglichte Ansammlung von Molekülen im Gehirn interstitielle Flüssigkeit (ISF) von wach, frei Verhalten Tieren vorhanden. Um relativ große Moleküle in ISF zu analysieren, der aktuelle Artikel konzentriert sich speziell auf der Mikrodialyse-Protokoll mit Sonden mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten.

In Vivo Mikrodialyse-Methode, um große extrazellulären Proteine Sammeln von Gehirn interstitielle Flüssigkeit mit hochmolekularen Gewicht Cut-Off-Sonden

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im neurowissenschaftlichen Forschungsbereich zu beantworten, wie Signaltransduktionssubstrattransport und eine Abfallentsorgung in den extrazellulären Räumen des Gehirns auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Probenahme und Quantifizierung großer extrazellulärer Moleküle in der Interstitial Fluid oder ISF von wachen, frei beweglichen Tieren ermöglicht. Nach der Bestätigung einer fehlenden Reaktion auf Zehenstich, entfernen Sie das Haar aus dem Schädel einer anästhesierten Maus und verwenden Sie die Ohrstangen und eine Nasenklammer, um das fixe Tier sicher auf einen Adapter zu bringen.Tragen Sie salbe auf die Augen des Tieres auf und legen Sie den Adapter auf das stereotaxic-Gerät. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Hautschnitt sagittal über den Schädel zu machen und befestigen Sie einen Bohrer auf dem Manipulator des stereotaxic Rahmens. Senken Sie den Bohrer, bis er sanft Lambda berührt, und setzen Sie die DV-Koordinate des Bohrers auf Null zurück.Verschieben Sie dann den Drill auf Bregma, um die AP- und ML-Koordinaten auf Null zurücksetzen zu können. Verschieben Sie den Bohrer von Bregma auf die vertikale Koordinate. Senken Sie den Bohrer auf den Schädel und stellen Sie die DV-Koordinate wieder auf Null.Nach der Wiederholung des Verfahrens für eine dritte Koordinate, bohren Sie ein Gratloch sorgfältig an der Zielkoordinate, gefolgt von einem zweiten Loch auf der kontralateralen Seite des parietalen Knochens. Legen Sie eine Knochenschraube in das zweite Loch ein und legen Sie das Verriegelungsstück aus einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohrdeckel auf den Schädel, so dass sich die Gratlöcher innerhalb des Kreises befinden. Als nächstes legen Sie eine Führungskanüle auf den kürzeren Arm des stereotaxic Adapters und befestigen Sie die Kanüle mit einer Kappenmutter.Stellen Sie den längeren Arm des stereotaxic-Adapters auf die Elektrodenklemme und befestigen Sie den Arm am Manipulator des stereotaxic-Geräts. Drehen Sie die DV-Stereotaxic-Baugruppe am Manipulatorarm um 12 Grad und bewegen Sie die Führungskanüle in das Gratloch. Dann senken Sie langsam die Führungskanüle 1,2 Millimeter in das Gehirn.Fügen Sie Zahnzement in die Krone, bis der Metallteil der Führungskanüle, die Knochenschraube und alle freiliegenden Schädel bedeckt und gesichert sind und den Zement trocknen lassen. Nach 12 bis 20 Minuten den Stereotaxienadapter aus der Elektrodenklemme entfernen, die Kappenmutter entfernen und den Stereotaxienadapter durch eine Dummy-Sonde ersetzen. Dann befestigen Sie die Kappenmutter, lassen Sie die Maus aus dem stereotaxic Apparat, und hausieren Sie die Maus allein in einem einzelnen Käfig.Vor dem Einrichten der Mikrodialyse eine Einweg-Einweg-Ein-Milliliter-Spritze mit destilliertem Wasser füllen und eine Viton-Röhre verwenden, um die Spritze an den Ausgang einer Mikrodialysesonde anzuschließen. Bedecken Sie die Entlüftungslöcher manuell und drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig, um die Sonde mit Wasser zu gießen. Bestätigen Sie, dass Wasser im Sondeneinlass auftaucht und dass auf der Oberfläche der Mikrodialysemembran Leckagen vorhanden sind.Um die Sonde zu aktivieren, tauchen Sie die Sondenmembranen zwei Sekunden lang in 70-100%Ethanol ein, gefolgt von einer zweiten destillierten Wasserinfusion. Befestigen Sie eine Anschlussnadel an einer Einlass- und einer Auslassleitung und beladen Sie eine Einwegspritze mit drei Millilitern mit frisch zubereitetem Perfusionspuffer. Schließen Sie eine Spritze mit einer stumpfen Nadel an das Einlassende des Schlauches an und füllen Sie mit einer Spritzenpumpe den gesamten Schlauch mit Einemfusionspuffer.Wenn das Rohr voll ist, ersetzen Sie die Verbindungsnadel zwischen den Ein- und Auslassleitungen durch die aktivierte Mikrodialysesonde und die Kappenmutter und montieren Sie ein Rollenrohr in den Auslassschlauch an einer Rollenpumpe. Starten Sie die Spritzenpumpe mit 10 Mikroliter pro Minute und die Walzenpumpe mit 9,5-9,8 Mikroliter pro Minute. Legen Sie nun den Kragen um den Hals der anästhesierten Führungskanüle implantierten Tier und entfernen Sie die Kappe Nuss und Dummy Sonde.Legen Sie die Mikrodialysesonde langsam durch die Führungskanüle und befestigen Sie die Kappenmutter. Legen Sie dann die Maus in einen Käfig, der mit einem freibeweglichen System verbunden ist, und halten Sie die Maus mit dem Kragen an. Nach mindestens einer Stunde die Rollenpumpe und die Spritzenpumpe sequenziell anhalten, die Pumpen mit der Spritzenpumpe auf 20 % schneller als die Walzenpumpe einstellen und das freie Ende des Auslassschlauchs auf einen Kühlbruchkollektor legen, um das Gehirn ISF zu sammeln.Wenn das entsprechende Versuchsvolumen erreicht wurde, entfernen Sie die Sonde und behandeln Sie die Mauswiederherstellung, wie gerade gezeigt. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen wird bei der Verabreichung von 50 Mikromolaren Picrotoxin mittels umgekehrter Mikrodialyse, wie sie bei wachen C57B6J-Mäusen nachgewiesen wurden, ein Anstieg der interstitiellen endogenen Tau-Spiegel im Vergleich zu Den werten Tieren beobachtet, die mit einer Fahrzeugkontrolle behandelt wurden. Zusätzlich zu den Arzneimittelverabreichungen kann die Mikrodialyse mit anderen In-vivo-Methoden wie EEG-Aufzeichnung oder Optogenetik kombiniert werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie neuronale Aktivität die Substratkonzentration in ISF beeinflusst.

in-vivo-microdialysis-method-to-collect-large-extracellular-proteins

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Überwachung der extrazellulären Neurotransmitter Ebenen in verschiedenen Hirnregionen der frei beweglichen Tieren bietet Einblicke über den Zusammenhang zwischen Neurotransmittern und Verhalten. In-vivo-Mikrodialyse mit elektrochemischer Detektion gekoppelt bietet eine hervorragende anatomische und chemische Auflösung, und Informationen darüber, wie basale Neurotransmission wird durch pharmakologische oder physiologische Manipulationen verändert.

Survivable stereotaktischen Chirurgie in Nagetiere

Modulation der hippocampally-abhängige räumliche Arbeitsgedächtnis durch direkte intrahippocampal Mikroinjektion, begleitet und gefolgt...

Hippocampus Insulin Mikroinjektion und<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialysis Während Spatial Memory Testing

Das Video zeigt den Prozess der Verwendung einer Mikrodialysesonde, um extrazelluläre Proteine aus der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) eines Mäusegehirns zu sammeln. Eine Mikrodialysesonde, ausgestattet mit einer semipermeablen Membran mit hohem Molekulargewicht, wird über eine implantierte Führungskanüle in das Gehirn einer anästhesierten Maus eingeführt. Die Sonde, die mit Pumpen verbunden ist, ermöglicht es einem physiologischen Puffer, das Hirngewebe zu durchdringen und sich mit dem ISF...

Mikrodialyse von interstitieller Flüssigkeit aus einem Mäusegehirn zur Isolierung extrazellulärer Proteine

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Mikrodialyse ist eine häufig verwendete Technik in neurowissenschaftlichen Forschung. Daher kommerziellen Sonden sind in der großen demand.In diese Arbeit eine Sondenanordnung ist detailliert, um eine zuverlässige, konzentrisch, maßgeschneiderte Mikrodialysesonde bauen für weniger als $ 10 erläutert.

Maßgeschneiderte Mikrodialysesonde Entwurf

Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

Hier beschreiben wir eine Methode zur in Vivo Mikrodialyse Aspartat- und Glutamat Freisetzung im ventralen Hippocampus von epileptischen und nicht-epileptischen Ratten, in Kombination mit EEG-Ableitungen zu analysieren. Extrazelluläre Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat können mit den verschiedenen Phasen der Erkrankung korreliert werden.

Mikrodialyse exzitatorischen Aminosäuren während der EEG-Ableitungen in Ratten frei beweglich

Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte dynamische Echtzeit-Probenahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus wacher Ratten unter Verwendung eines Mikrodialysesystems.

Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems

In vivo sind interzelluläre Kommunikationen, die vielen Erkrankungen des zentralen Nervensystems zugrunde liegen, wie etwa das Glioblastom (GBM), notorisch schwer zu messen und zu charakterisieren. Hier beschreiben wir Verfahren der zerebralen offenen Mikroperfusion (cOFM), die verwendet werden können, um interstitielle Flüssigkeitskomponenten in einem longitudinalen Tiermodell von GBM zu beproben.

Verwendung von zerebraler Offenfluss-Mikroperfusion zur longitudinalen Sammlung von Zwischenflüssigkeit in einem Tiermodell des Glioblastoms

Extrazelluläre Aufnahmen von neuronaler Aktivität unter Verwendung von Silizium-Sonden in der narkotisierten Ratte beschrieben. Diese Technik ermöglicht Auskünfte über mehrere Hirnareale aus mehr als 100 Neuronen gleichzeitig. Es stellt Informationen über einzelne Zelle Auflösung zu neuronalen Ensembles Dynamik in mehreren lokalen Schaltungen.

Recording Großflächige Neuronale Ensembles mit Silicon-Sonden in der narkotisierten Ratte

Lernen Sie die In-vivo-Mikrodialyse zur Sammlung großer extrazellulärer Proteine aus der Gehirn-Interstitialflüssigkeit bei wachen, frei beweglichen Mäusen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen neuronaler Signalwege.

In Vivo Mikrodialyse-Methode, um große extrazellulären Proteine Sammeln von Gehirn interstitielle Flüssigkeit mit hochmolekularen Gewicht Cut-Off-Sonden (Video) | JoVE Journal

In Vivo Mikrodialyse-Methode, um große extrazellulären Proteine Sammeln von Gehirn interstitielle Flüssigkeit mit hochmolekularen Gewicht Cut-Off-Sonden

Weitere Videos entdecken