Histotypische Gewebekulturen

Die histotypische Gewebekultur ermöglicht es, Zellen dreidimensional zu züchten, wodurch In-vitro-Gewebemorphologien entstehen, die die realistische Gewebefunktion genau nachahmen und als tragfähige Konstrukte für die Gewebereparatur verwendet werden können. Bei diesen Kulturen handelt es sich in der Regel um dreidimensionale Strukturen, die aus einem einzigen Zelltyp bestehen, der in hoher Dichte gezüchtet wird. Die dreidimensionale Struktur, auch Gerüst genannt, ahmt die natürliche extrazelluläre Matrix nach. Je nach verwendetem Zelltyp können Scaffolds für eine bestimmte Anwendung konzipiert werden und dienen in der Regel als Vorlage für biomimetisches Gewebe. In diesem Video werden die Grundlagen histotypischer Gewebekulturen, ein Verfahren zur Isolierung von Zellen sowie die Herstellung und Zellularisierung eines porösen Seidengewebegerüsts zur Nachahmung von Herzgewebe vorgestellt.

Alle Gewebe bestehen aus zwei grundlegenden Komponenten, der extrazellulären Matrix und den gewebespezifischen Zellen, die sie bewohnen. Die extrazelluläre Matrix ist ein Netzwerk von Strukturproteinen, die eine dreidimensionale Umgebung für Zellen schaffen, und die Zellen darin sollen die nativen physiologischen Prozesse des Gewebes rekapitulieren. Derzeit ist eine gängige Technik zur Modellierung von Gewebe die zweidimensionale Gewebekultur, bei der Zellen auf ein flaches Substrat aufgetragen und einen dünnen Film gebildet werden. Im Allgemeinen ist diese Methode nicht zuverlässig für die Aufrechterhaltung eines in vivo-Phänotyps, organspezifischer Funktionen und kontextueller Wechselwirkungen von Zelle zu Zelle oder von Zelle zu Substrat. Die histotypische Gewebekultur mildert diese Einschränkungen, indem sie ein 3D-Gerüst für das Wachstum der Zellen bereitstellt, was zu einem dichten Zellnetzwerk führt, das die nativen Zellmorphologien besser nachahmt und die Entwicklung realistischer interzellulärer Netzwerke und Kommunikationswege erleichtert. Eine Vielzahl von 3D-Polymernetzwerken, darunter Hydrogele und elektrogesponnene Seidenmatten, bieten bequeme Möglichkeiten, gewebespezifische Zellen in drei Dimensionen zu kultivieren. Um diese Gerüste zu bestücken, müssen Zellen isoliert werden. Die in diesem Video verwendeten Primärzellen werden aus lebendem Gewebe gewonnen, das zerkleinert und dann in einer Enzymlösung verdaut wird, um die Zielzellen von der extrazellulären Matrix zu trennen. Sobald die Zellen isoliert sind, gibt es zwei Techniken, um die Gerüste zu säen. Bei der Tröpfchentechnik wird eine Lösung von Zellen mit einer langsamen und konstanten Geschwindigkeit auf das Gerüst pipettiert. Bei der zweiten Technik, der Zellsuspensionstechnik, wird das Gerüst in eine Zellsuspension getaucht. Oft werden das Gerüst und die Suspension geschüttelt, um die Zellmigration in die Matrix zu fördern. Beide Techniken führen zu biotechnologisch hergestellten Konstrukten mit hohen Zelldichten. Die folgenden Verfahren umfassen die Isolierung von Herzzellen und die Zellsuspensionstechnik, um ein kardialzellspezifisches Gerüst zu schaffen, da es die native Morphologie des Herzgewebes beibehält.

Um mit der Isolierung von Zellen aus Spendergewebe zu beginnen, stellen Sie zunächst sicher, dass der Arbeitsbereich und die Präparierinstrumente sterilisiert sind. Legen Sie dann ein steriles Tuch auf die Arbeitsfläche in der Biosicherheitswerkbank. Legen Sie die sterilen chirurgischen Instrumente auf das Abdecktuch, ohne sie zu berühren, und öffnen Sie dann eine sterile Skalpellklinge mit der Nummer 20. Nachdem Sie die Probe eingeschläfert haben, sterilisieren Sie den Operationsbereich mit einem Betadin-getränkten Mullkissen. Wenn Sie fertig sind, sichern Sie die Probe und beginnen Sie mit dem chirurgischen Eingriff, um das gewünschte Gewebe zu isolieren. In diesem Fall wird es das Herz sein. Legen Sie das Gewebe nach dem Ausschneiden auf Eis in die Petrischale, die PBS-Glukose enthält. Entfernen Sie jegliches restliche Blut oder Bindegewebe und geben Sie das Gewebe dann mit frischer PBS-Glukose in eine Petrischale. Anschließend werden die Gewebeproben mit einer sterilen Mikroschere und einer Pinzette vorsichtig in etwa 1 Kubikmillimeter große Stücke zerkleinert. Übertragen Sie die Stücke und den Puffer mit einer Pipette in ein konisches Röhrchen. Entfernen Sie dann alle bis auf 10 Milliliter Puffer. Fügen Sie 7 Milliliter Kollagenaselösung hinzu und schütteln Sie die Mischung dann 7 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie dann vorsichtig 10 Mal, um die Gewebestücke aufzubrechen. Lassen Sie die Stücke absetzen, saugen Sie dann die Flüssigkeit ab und entsorgen Sie sie. Wiederholen Sie anschließend den Aufschluss und pipettieren Sie die Lösung vorsichtig, um die Gewebestücke aufzubrechen. Nachdem sich die Stücke abgesetzt haben, ziehen Sie den Überstand ab und sammeln Sie ihn in einem separaten konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 10 Milliliter STOP-Lösung in jedes konische Röhrchen, das den Überstand enthält, um den Aufschluss zu stoppen.

Nachdem die Primärzellen isoliert wurden, stellen wir ein poröses Seidengewebegerüst her. Gießen Sie zunächst 30 Milliliter der Seidenlösung in eine Form. Streuen Sie anschließend 60 Gramm gesiebtes Natriumchlorid gleichmäßig über die Lösung. Lassen Sie die Seide dann 48 Stunden lang ungestört bei Raumtemperatur polymerisieren. Stellen Sie die Form dann für 1 Stunde in einen 60-Grad-Ofen, um die Vernetzung abzuschließen und die restliche Flüssigkeit zu verdampfen. Tauchen Sie die Form nach der Polymerisation 48 Stunden lang in ein Becherglas mit destilliertem Wasser, um das Salz herauszusaugen. Nehmen Sie dann das Gerüst aus der Form und schneiden Sie kleine Scheiben mit einem 5-Millimeter-Biopsiestanzer. Schneiden Sie die Scheiben auf eine Höhe von 2 Millimetern ab und entfernen Sie schließlich die Zentren jedes Stücks mit einem 2-Millimeter-Biopsierstanzer, um einen Ring zu erstellen. Zum Schluss autoklavieren Sie die Gerüste in einem Nasszyklus für 20 Minuten.

Nachdem wir das Gerüst vorbereitet haben, beginnen wir mit dem Aussaatprozess der Zellen. Platzieren Sie zunächst ein steriles Gerüst pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie dann Zellkulturmedium hinzu, um die Gerüste einzutauchen, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator, um sie mindestens 30 Minuten lang auszugleichen. Nach der Inkubation wird das überschüssige Medium aspiriert und dann die isolierte Primärzellsuspension in die Gerüste gegeben. Stellen Sie die Platte dann wieder in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht stehen, damit sich die Zellen an den Gerüsten befestigen können. Am nächsten Morgen aspirieren Sie die nicht anhaftenden Zellen vorsichtig und ersetzen sie durch 200 Mikroliter frisches Zellkulturmedium pro Well. Das resultierende Gerüst ist ein poröses Konstrukt mit einer hohen Zelldichte, das sofort verwendet werden kann.

Nachdem Sie nun gelernt haben, wie man histotypische Gewebekulturen durchführt, schauen wir uns einige praktische Anwendungen dieser Materialien an. Histotypische Gewebekulturen können zelluläre Mikroumgebungen schaffen, die natives Gewebe nachahmen, und können daher ein geeignetes Modell für die Untersuchung des zellulären Verhaltens in Bezug auf einen einzelnen Zelltyp liefern. Zum Beispiel können 3D-Fasern in Gerüsten, die die in vivo gefundene Stammzellnische genauer nachahmen, mit pluripotenten Stammzellen besiedelt werden, um nach biologischen Hinweisen zu suchen und deren Auswirkungen auf die Stammzelldifferenzierung zu bestimmen. Diese Arbeit kann letztendlich zu einem besseren Verständnis der Differenzierung von Stammzellen führen und Einblicke in die Verbesserung der Zelldifferenzierung und -regeneration für Tissue-Engineering-Anwendungen bieten. Wie dynamische Kulturen kann auch die mechanische Konditionierung das 3D-Gewebegerüst verbessern, indem es verschiedenen mechanischen Belastungen ausgesetzt wird, denen natürliches Gewebe in vivo ausgesetzt sein kann. Durch das Anlegen von Kompression und biaxialen Lasten während des Zellwachstums wird die Zellmorphologie und die extrazelluläre Matrix verändert, um diese mechanischen Belastungen widerzuspiegeln. Das Ergebnis ist ein vorkonditioniertes, biotechnologisch hergestelltes Gewebegerüst mit einer zellulären Struktur, die dem nativen Gewebe ähnelt, was es ideal für die Implantation in Bereichen macht, die ähnlichen mechanischen Kräften ausgesetzt sein können. Schließlich können künstlich hergestellte Gewebekonstrukte auch verwendet werden, um Gewebedefekte zu ersetzen oder zu reparieren. Um dies zu erreichen, muss das Gewebegerüst zunächst vaskularisiert werden, wodurch sich das Blut frei durch das Konstrukt bewegen kann. Nach der Vaskularisierung kann das Gerüst übertragen und in den Gewebedefekt implantiert werden, um die Reparatur einzuleiten. Die erfolgreiche Transplantation kann später durch die Histologie bestätigt werden, die zeigt, ob das Gewebekonstrukt den beschädigten Bereich vollständig repariert hat oder nicht.

Sie haben gerade Joves Einführung in die histotypische Gewebekultur gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie einfache 3D-Strukturen hergestellt werden, wie Primärzellen isoliert und auf ein Gerüst gesetzt werden und welche verschiedenen Anwendungen diese Kulturen im Bereich der Biotechnik haben. Danke fürs Zuschauen.