Langfristig In Vivo Verfolgung von entzündlichen Zelldynamik in Drosophila Puppen

Durch die Ausnutzung des langfristigen Bildgebungspotenzials dieses neuen Puppenmodells in Verbindung mit der genetischen Rückverfolgbarkeit von Drosophila kann diese Methode uns helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Wundheilung und angeborene Immunität zu beantworten. Das Puppenstadium bietet einige deutliche Vorteile für die Live-Bildgebung gegenüber herkömmlichen Drosophila-Wundheilungsmodellen. Zum Beispiel können Puppen über viel längere Zeiträume abgebildet werden, mehr Gewebefläche steht für experimentelle Manipulationen zur Verfügung, und in diesem Stadium sind mehr Hämozyten vorhanden.

Darüber hinaus wird die Effizienz der RNAi-vermittelten Geninaktivierung während dieser Puppenstadien erheblich verbessert, so dass viele Gene gewebe- oder zeitspezifisch ausgeschaltet werden können. Um die Puppensammlung einzurichten, stellen Sie Fläschchen mit 20 jungfräulichen Weibchen und 20 Rüden auf. Entnehmen Sie dann 18 Stunden vor der Bildgebung mindestens 10 neu gebildete weiße Vorpuppen aus den Fläschchen.

Um eine Puppe zu sammeln, verwenden Sie eine Pinzette oder einen feinen Pinsel, um sie von der inneren Oberfläche des Fläschchens zu lösen, und legen Sie sie vorsichtig an die Seite eines neuen Fliegenfläschchens. Nachdem sich die Puppen zum gewünschten Zeitpunkt entwickelt haben, übertragen Sie sie auf ein Stück doppelseitiges Klebeband, das auf einem Objektträger befestigt ist. Entfernen Sie nun unter einem Hellfeld-Dissektionsmikroskop vorsichtig die Puppen aus ihren Hüllen.

Positionieren Sie die Puppen so, dass ihre Bauchseiten fest mit dem Band verbunden sind. Machen Sie den ersten Schnitt im vordersten Bereich des Puppes mit der Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Puppenhülle in diesem Bereich hohl und frei von Puppengewebe ist, da die Puppen während der frühen Puppenentwicklung innerhalb der Hülle geschrumpft sind.

Anschließend die Puppenhülle vorsichtig von vorne nach hinten mit einer Pinzette oder Mikroschere aufreißen oder aufschneiden, bis die Puppe vollständig von der braunen, undurchsichtigen, spröden Hülle befreit ist. Seien Sie vorsichtig, diese Puppen sind sehr zerbrechlich. Nun ist es entscheidend, dass die Pinzette und die Mikroschere bei diesem Schritt die Puppenoberfläche nicht durchstechen.

Versuche, die Puppe selbst nicht zu berühren, wenn du die umgebende Hülle entfernst. Montieren Sie nun die unbeschädigten Puppen mit Heptankleber in eine Glasbodenschale. Tragen Sie zunächst eine Linie vorbereiteten Heptankleber von einem 10-Mikroliter-Aliquot auf.

Nach fünf Sekunden des Trocknens die präparierten Puppen vorsichtig mit einer Pinzette auf den Kleber übertragen. Stellen Sie beim Lernen bis zu fünf Puppen auf. Mit den gesammelten Erfahrungen kann mehr vorbereitet werden.

Rollen Sie die Puppen mit einer Pinzette, um die Puppen so zu befestigen, dass der Flügel flach auf dem Deckglas liegt und der größte Teil der Flügeloberfläche in direktem Kontakt mit dem Deckglas steht. Um eine Austrocknung zu verhindern, legen Sie ein Stück saugfähiges Filterpapier, das in destilliertem Wasser getränkt ist, an die Seite der Glasbodenschale. Decken Sie dann die Schale ab und fahren Sie mit dem laserinduzierten Verwundungsverfahren fort.

Übertragen Sie die montierten Puppen in ein Weitfeldmikroskop, das mit einem abstimmbaren Laserablationssystem ausgestattet ist. Stimmen Sie den luftgekühlten, stickstoffgepumpten Ablationslaser mit gepulstem UV mit der entsprechenden Farbstoffzelle auf die gewünschte Wellenlänge ab. Für eine optimale Wicklung stellen Sie die Impulswiederholrate auf 40 Hertz ein.

Mit 40- oder 63-fachen Objektiven und Hellfeld können Sie nun die Regler des Mikroskoptisches so einstellen, dass der Puppenflügel der ersten zu verwundenden Puppe lokalisiert wird. Fokussieren Sie sich auf die Ebene des Puppenflügelepithels, die dem Glasdeckglas am nächsten liegt. Richten Sie den zu verletzenden Bereich an dem bekannten Zielbereich des Ablationslasers aus.

Nutzen Sie dazu den Fadenkreuzmarker im Mikroskopokular. Stellen Sie als Nächstes die Leistung des Lasers ein, indem Sie den Objektträger des Energiedichtedämpfungsglieds im Mikroskop einstellen. Nutzen Sie die Klick-Stopps, um die Einstellung reproduzierbar zu machen.

Um nun eine Wunde zu erzeugen, aktivieren Sie den Ablationslaser mit einem schnellen Klick der manuellen Steuerung. Überprüfen Sie dann, ob die vorübergehende Luftblase an der Ablationsstelle auftritt, was bei Verletzungen normal ist. Wenn die Verwundung nicht erfolgreich ist, versuchen Sie, die Brennebene zu variieren.

Alternativ können Sie die Laserleistung mit dem Abschwächerschieber schrittweise erhöhen, bis die gewünschten Wundgrößen erreicht sind. Nachdem Sie die Puppenflügelränder verwunden haben, übertragen Sie die Schale mit Glasboden schnell in ein geeignetes Mikroskop für die Zeitrafferaufnahme. Öffnen Sie dann die entsprechende Bildaufnahmesoftware.

Schalten Sie in der Software die entsprechenden Laser ein und passen Sie deren Leistung und Verstärkung/Offset an, um ein ausreichendes Fluoreszenzsignal ohne Pixelsättigung zu erhalten. Im Allgemeinen eignet sich die geringstmögliche Laserleistung im Bereich von fünf bis 20 % am besten, um Photobleaching zu minimieren. Fokussieren Sie sich bei geringer Vergrößerung auf den gesamten Puppenflügel oder bei starker Vergrößerung auf die Wunde, um die Wundheilung zu untersuchen.

Um sowohl das reparierende Epithel als auch die Rekrutierung von Entzündungszellen zu erfassen, stellen Sie das Mikroskop zunächst so ein, dass es mit der Feinfokuseinstellung auf dem Bedienfeld einen Z-Stapel aufzeichnet. Scannen Sie vom verwundeten Epithel bis zum extrazellulären Raum darunter, in dem sich wandernde Hämozyten befinden. Stellen Sie als Nächstes die Software so ein, dass Z-Schnitte durch den Puppenflügel alle drei Mikrometer oder in noch engeren Abständen aufgezeichnet werden.

Zeichnen Sie für die Zeitraffer-Bildgebung Z-Stapel mindestens alle 30 Sekunden für mindestens eine Stunde auf. Wenn Sie die fotokonvertierbaren Sonden verwenden, um eine Teilmenge von Zellen während der Bildgebung selektiv zu photokonvertieren und zu markieren, öffnen Sie die entsprechenden Module in der Bildgebungssoftware, um die Fotokonvertierung durchzuführen und den 405-Nanometer-Laser zu aktivieren. Wählen Sie dann die Zellen aus, die in der FRAP-Software mit einem Auswahlwerkzeug fotokonvertiert werden sollen.

Legen Sie als Nächstes den Zeitverlauf für die Fotokonvertierung auf einen einzelnen Iterationsframe fest und stellen Sie den 405-Nanometer-Laser auf 20 % Laserleistung ein. Klicken Sie dann auf Experiment starten, um die Fotokonvertierung durchzuführen. Beenden Sie nach Abschluss des Vorgangs das FRAP-Modul und kehren Sie zum ursprünglichen Bildbildschirm zurück.

Dort werden die Laser auf die verwendeten Fluorophore abgestimmt und die photokonvertierten und nicht photokonvertierten Zellen mithilfe von Zeitrafferaufnahmen abgebildet. Die verwundeten Flügel von Drosophila-Puppen 18 Stunden nach der Puppenbildung wurden mit Hilfe der konfokalen Zeitraffermikroskopie abgebildet. Eine laserinduzierte Schädigung des Epithels der Puppenflügel stimulierte eine schnelle Wanderung von Drosophila-Zellen des angeborenen Immunsystems, den Hämozyten, zur Wundstelle.

Die Hämozyten wurden sowohl mit einem nukleären Marker als auch mit einem zytoplasmatischen oder zytoskelettalen Marker markiert, um eine Nachverfolgung bzw. einen Blick auf ihre Morphologie zu ermöglichen. Die Verfolgung der nuklearen Trajektorien der Hämozyten zeigt die komplexe räumlich-zeitliche Dynamik der Entzündungsreaktion. Innerhalb von 30 Minuten nach der Verletzung haben die Hämozyten, die sich am nächsten an der Verletzungsstelle befinden, mit der gerichteten Wanderung zur Wunde begonnen.

Schließlich beginnen Hämozyten, die sich immer weiter von der Verletzung entfernt befinden, in Richtung der Wunde zu wandern. Mit Hilfe des photokonvertierbaren Fluorophors Kaede wurden Subpopulationen dieser wandernden Flügelhämozyten selektiv markiert. Diese Methode wurde verwendet, um zu zeigen, dass Hämozyten, die für eine erste Wunde rekrutiert wurden, vorübergehend für eine zweite Wunde desensibilisiert werden, die 90 Minuten später erzeugt wird.

Durch die Markierung des E-Cadherins innerhalb der zellulären Adhärensübergänge mit GFP ist der Wundrand leicht identifizierbar und ermöglicht eine Analyse der Wundheilungsdynamik. Die meisten Wunden beginnen innerhalb einer Stunde nach der Verletzung wieder zu epithelialisieren. Der Wundrand rückt nach innen vor und die Wunden heilen schließlich innerhalb von drei Stunden.

Sobald diese Technik beherrscht wird, können mehrere Puppen innerhalb von nur 10 Minuten für die Live-Bildgebung vorbereitet werden, aber beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass Drosophila-Puppen, sobald sie aus ihrer Puppenhülle dispariert werden, extrem anfällig für Schäden und Austrocknung sind. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der angeborenen Immunität geebnet, mit Computerbiologen zusammenzuarbeiten und ausgefeiltere mathematische Modelle anzuwenden, um das Verhalten der Wundlockstoffsignale zu untersuchen, die für die Rekrutierung von Entzündungszellen verantwortlich sind. Und in jüngerer Zeit wurden auch alternative Zelltypen markiert, um ihre Reaktion auf laserinduzierte Verletzungen zu verfolgen, und dies hat gezeigt, dass Adipozytenzellen, die Fett-Körper-Zellen der Drosophila, auch auf Wunden innerhalb dieses Systems reagieren.