Name: Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Lernen Sie die Kultur und Transfektion von Primärzellen aus Zebrafisch-Embryonen und adultem Gehirn. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Live-Cell-Imaging-Analysen zellulärer Dynamiken.

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Wir danken T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde und S.-M. Tokarski für ausgezeichnete Tierpflege und technischen Support. Wir sind dankbar für alle Mitglieder des Köster Lab für intensive und hilfreiche Diskussionen. Wir erkennen dankbar, Finanzierung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) und des Bundeslandes Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

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<li>Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+primary+cell+culture+for+transfection+and+live+cellular+and+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging.</a> Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).</li>
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<li>Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+neither+persistently+leads+migration+nor+determines+the+site+of+axonogenesis+in+migrating+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).</li>
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<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132, 5069-5079 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+expressed+transiently+in+all+types+of+amacrine+cells+in+the+embryonic+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina.</a> Neural Development. 4, 34(2009).</li>
<li>Kani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+gene-linked+neurogenesis+in+zebrafish+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum.</a> Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir Ihnen zwei verschiedene Protokolle zur primären Zellkulturen aus 2 Dpf Zebrafisch-Embryonen oder Erwachsenen Zebrafisch Gehirn.
Die Vorbereitung der primären Zellkulturen aus 2 Dpf Zebrafisch ist relativ einfach für jemanden mit Erfahrung in der Keimzelle Kulturtechniken durchzuführen. Um gute und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ist jedoch eine ausreichende Anzahl von Embryonen als Ausgangsmaterial entscheidend (100 ist das Minimum). Während der Anhebung der Embry...

Der Zebrabärbling (Danio Rerio, D. Rerio) ist ein beliebtes Modell für zahlreiche Anwendungsfelder Grundlagen- und biomedizinischen Forschung1Wirbeltier. Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich rasch ex Utero, sind transparent und unter dem Mikroskop, so bietet hervorragende Voraussetzungen für das Studium vertebrate Entwicklung in einem lebenden Organismus Fit. Aufgrund der genetischen Lenkbarkeit der Zebrafisch2wurden viele stabile transgenen Reporter Linien mit Zelle Typ-spezifischen Ausdruck der verschiedenen fluoreszierenden Marker ermöglichen die Beobachtung von bestimmten Zellpopulationen gegründet. Die Zebrafisch-Community bietet eine breite Palette von so genannten Gal4-Fahrer-Linien, die eine Transgene Ausdruck der synthetischen Kal4TA4 (oder KalTA3-Äquivalent GalFF) tragen gen mit Gal4-DNA-bindende Domäne von Hefe verschmolzen zu einer viralen transkriptionelle Aktivierung Domains unter der Kontrolle der Zelle typspezifische Enhancer. Diese Treiber-Linien sind Effektor Linien durchzogen, die transgene bestehend aus einer definierten vorgelagerten aktivierenden Reihenfolge (UAS) verschmolzen zu einem Reportergen tragen. Das Kal4TA4-Protein bindet an die FH-Element, und aktiviert die Zelle Typ-selektiven Ausdruck des Reporter-gen3,4. Dieser Ansatz ermöglicht für unterschiedlichste kombinatorische Studien über fast aller verfügbaren Enhancer und Reporter Elemente bei Doppel-transgenen Tieren.
Allerdings ist eingehende live Bildgebung mit Schwerpunkt auf einzelne Zellen oder deren subzelluläre Inhalt im ganzen und sich ständig verändernden Embryo begrenzt. Um bestimmte Zelle biologische Fragestellungen mit der höchsten Auflösung zu begegnen, ist die Verwendung von Zellkulturen oft vorzuziehen. Einige Zelllinien Zebrafisch vorhanden, aber sie gelten als stark ausgewählten5,6,7 und ihre Vermehrung ist oft zeitaufwendig. Darüber hinaus sind alle verfügbaren Zelllinien Fibroblasten abgeleitet, Experimente mit Zellkultur auf eine Art von Zellen zu begrenzen. Daher gründeten wir eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll um primäre Zellen direkt von Zebrafisch-Embryonen und Erwachsenen Zebrafisch Gehirn zusammen mit Ansätzen, die Langlebigkeit der Kultur zu erhöhen und die Vielfalt der kultivierten erweitern vorzubereiten Zelltypen. Darüber hinaus präsentieren wir ein Verfahren zur embryonalen Primärzellen mit Ausdruck Konstrukte für fluoreszierende Organelle Marker transfizieren. So können Morphologien zellulärer und subzellulärer Strukturen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in verschiedene Zelltypen analysiert werden die ihre Hauptmerkmale zu behalten.

<table><tbody><tr><td>Fish lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB (Wildtyp)</td><td></td><td></td><td>etabliert von Streisinger und Kollegen, verfügbar vom Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td></tr><tr><td>Tg(ptf1a:eGFP)jh1</td><td></td><td></td><td>stabile transgene Linie, in der der Enhancer des Zebrafisch-Gens ptf1a die Expression des fluoreszierenden Proteins EGFP (Parsons et al., 2007)</td></tr><tr><td>Tg(XITubb:DsRed)zf148</td><td></td><td></td><td>stabile transgene Linie, in der der Xenopus neural-spezifischer Beta-Tubulin-Promotor die Expression des fluoreszierenden Proteins DsRed steuert&nbsp; (Peri und N&uuml; sslein-Volhard, 2008)</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modell 5804 R</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Bildgebungssystem</td><td>BioRad</td><td></td><td>Modell XRS+, zur Aufnahme von Schwarz-Weiß-Bildern von Petrischalen mit 1 da Embryonen</td></tr><tr><td>konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Modell SP8, ausgestattet mit 28 &//; C-Temperaturbox und ein 63-fach-Objektiv-Epifluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Modell DM5500B, ausgestattet mit 28 > C Temperaturbox und ein 40X Objektiv</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell mit Kapazitätsextender</td><td>BioRad</td><td>1652661</td><td>Elektroporationsgerät</td></tr><tr><td>Horizontaler Shaker</td><td>GFL</td><td></td><td>Modell 3011</td></tr><tr><td>Inkubator für Zellkultur (28 &Grad; C)</td><td>Memmert</td><td></td><td>Modellbrutator I</td></tr><tr><td>Brutapparat für Embryonen (28 Grad; C)</td><td>Heraeus</td><td></td> Typ <td>B6120</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Modell TELAVAL 31</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterile Werkbank</td><td>Bio Base</td><td></td><td>mit Laminar Flow und UV-Licht</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td></td><td>Style 5, Inox</td></tr><tr><td>vertikaler Rohrrotator</td><td>Labinco B.V.</td><td></td><td>Modell LD-79</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>BioRad</td><td></td><td>für das ChemiDoc MP Bildgebungssystem von BioRad</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Gesundheit</td><td></td><td>, die für die Zählung von 1-dph-Embryonen verwendet wird, indem das Werkzeug "Partikel zählen" auf die jeweiligen Schwarz-Weiß-Bilder angewendet wird; Rasband, W.S., ImageJ, U.S. Nationale Institute für Gesundheit, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>für Konfokal- und Epifluoreszenzmikroskope von Leica Microsystems</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-DCX-tdTomato</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1599</td><td>basierend auf dem Rückgrat pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-eGFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 7</td><td>basierend auf dem Backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-H2B-mseCFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2379</td><td>basierend auf dem Rückgrat pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-mClover</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 3865</td><td>basierend auf dem Rückgrat pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-MitoTag-YFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2199</td><td>basierend auf dem Rückgrat pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-ss-RFP-KDEL</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 4330</td><td>basierend auf dem Rückgrat pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-VAMP1-mCitrin</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2291</td><td>basierend auf dem Rückgrat pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pSK-UAS:mCherry</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1062</td><td>basierend auf dem pBluescript-Rückgrat von Stratagene</td></tr><tr><td>Plasmidnummern beziehen sich auf die Datenbankeinträge des K&ouml; STER Labor. Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Kunststoff- und Glaswaren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer (40 & Mikro; m)</td><td>FALCON</td><td>REF 352340</td><td>vertrieben von BD Bioscience, verwendet als " Kescher" um deyolkierte Embryonen in Ethanol zu tauchen und schnell in frisches Zellkulturmedium zu überführen</td></tr><tr><td>1,5 mL Reaktionsröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falknisches Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924.005</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer (40 & Mikro; m)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542 040</td><td>mit Entlüftungsschlitzen; zur Filterung von Zellen nach Kollagenase-vermittelter Dissoziations-Elektroporationsküvette</td></tr><tr><td>(0,4 cm)</td><td>Kisker</td><td>4905022</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051201</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel Gl&auml; ser)</td><td>631-0845</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Kammer</td><td>Henneberg-Sander GmbH</td><td>9020-01</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (Kunststoff; 3 mL)</td><td>A. Hartenstein</td><td>PP05</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (Kunststoff; Durchmesser 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>821473</td><td>für Zebrafischembryonen</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Sarstedt</td><td>Blau (1000 & Mikro; l): 70762; Gelb (200 & Mikro; l): 70760002; Weiß (10 & Mikro; L): 701116</td><td></td></tr><tr><td>sterile Zellkulturschalen (Kunststoff; Durchmesser 3 cm)</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>sterile Zellkulturschalen (Kunststoff; Durchmesser 6 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>sterile Petrischalen (Kunststoff; Durchmesser 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>für die Dissektion des Gehirns</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</strong</td><td>><>Kommentare</td></tr><tr><td>Chemikalien und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Roth</td><td>0601.1</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd in 1x PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Calciumnitrat-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol p.a. 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>Ziege &alpha;-Maus IgG (Fc-spezifisch) FITC konjugiert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31547</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>DOW CORNING</td><td>3826-50</td><td>Silikonfett für selbstgemachte Glasbodenschalen</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Serva</td><td>29198.01</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-Tubulin, acetylierter Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount (Eindeckmedium)</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Biochrom</td><td>L 7240</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Merck</td><td>104938</td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td>Roth</td><td>68514-61-4</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Synonym: Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</strong</td><td>><>Kommentare</td></tr><tr><td>Enzyme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase (Typ 2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>Pulver in Zellkulturmedium (8 mg/ml) auflösen und die Lösung sterilfiltrieren, Aliquote bei -20 & deg lagern; </td></tr><tr><td>C-Pronase (aus Streptomyces griseus)</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>von Sigma-Aldrich vertrieben, löst sich in 30% Danieau (10 mg/ml) auf und lagert Aliquote bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Medium und Lösungen für die Zellkultur1x</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>14190-169</td><td>vertrieben von Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>CO2-unabhängiges Medium</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>18045054</td><td>vertrieben von Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>filtriertes Rinderserum (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td></td><td>Einzelcharge</td></tr><tr><td>Glutamin 100x</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>25030081</td><td>vertrieben von Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Leibovitz' L-15-Medium</td><td>Gibco von Life Technologien</td><td>11415049</td><td>vertrieben von Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000 U/ml)</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>15140148</td><td>vertrieben von Thermo Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

kultur und transfektion von primärzellen zebrafisch

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafisch-Embryonen sind durchsichtig und entwickeln sich rasch außerhalb der Mutter, wodurch ausgezeichnete in-Vivo Bildgebung der dynamischen biologischen Prozesse in einer intakten und Entwicklungsländern Wirbeltier. Allerdings ist die detaillierte Darstellung der Morphologien von verschiedenen Zelltypen und subzelluläre Strukturen in ganzen Halterungen begrenzt. Daher gründeten wir eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll zur Kultur live Primärzellen von Zebrafisch-Embryonen und Erwachsenen Gewebe.
In Kürze sind 2 Dpf Zebrafisch-Embryonen Dechorionated, Deyolked, sterilisiert und auf einzelne Zellen mit Kollagenase dissoziiert. Nach einem Filtrationsschritt sind Primärzellen vergoldet auf unteren Glasschalen und für mehrere Tage kultiviert. Neue Kulturen, wie lange Begriff differenziert sind, können für hochauflösende konfokale bildgebenden Studien verwendet werden. Die Kultur enthält verschiedene Zelltypen mit gekerbten Myozyten und Neuronen Prominenten auf Poly-L-Lysin-Beschichtung. Speziell Label subzelluläre Strukturen von fluoreszierenden Marker-Proteine haben wir auch eine Elektroporation-Protokoll ermöglicht die Transfektion von Plasmid DNA in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen. So kann in Gegenwart von Bediener definierte Reize, komplexe Zelle Verhalten und intrazellulären Dynamik der primären Zebrafisch Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung beurteilt werden. Darüber hinaus mithilfe von Erwachsenen Zebrafisch Gehirn zeigen wir, dass die beschriebenen Dissoziation-Technik sowie die Kultivierung Rahmenbedingungen auch für Erwachsene Zebrafisch Gewebe.

Abbildung 1 zeigt ein übertragene Licht Bild einer typischen Kultur aus Wildtyp-Embryonen mit gekerbten Myozyten und Trauben von Neuron-ähnliche Zellen werden am häufigsten vorkommende gewonnen. Um bestimmte Zelltypen leichter zu identifizieren, eine transgene Linie mit Zelle Typ-spezifischen Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins werden kann (Abbildung 1 H) verwendet.
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Wir präsentieren Ihnen eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll für die Zubereitung von primären Zellkulturen von Zebrafisch-Embryonen zu Transfektion und live Cell Imaging sowie ein Protokoll Primärzellen von Erwachsenen Zebrafisch Gehirn vorzubereiten.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Diese Methode gibt den Zebrafischen ein Werkzeug zur Analyse der interzellulären Dynamik mit einer in vivo unerreichten Auflösung an die Hand. Und es ermöglicht auch, den Mangel an Zebrafisch-Zelllinien auszugleichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie diese Primärzellen direkt aus dem ursprünglichen Gewebe isolieren und transfizieren, so dass Sie keine Zelllinien aufbewahren müssen.Zu Beginn des Protokolls bereiten Sie die Zebrafischembryonen zwei Tage nach der Befruchtung (dpf) vor. Am ersten Tag wurden mehrere Kreuzungen des Zebrafischstammes der Wahl durchgeführt. Am zweiten Tag paaren Sie sich mit den Fischen und sammeln die Eier direkt nach dem Laichen in einer 10 Zentimeter großen Petrischale aus Plastik.Entfernen Sie die abgestorbenen und kontaminierten Eier mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff. Die Eier einmal mit Danieau 30% mit 0.0001%Gewicht pro Volumen Methylenblau waschen. Ersetzen Sie dann das Medium durch frischen Danieau 30% ohne Methylenblau und brüten Sie die Eier über Nacht bei 28 Grad Celsius aus.Am dritten Tag entfernen Sie die toten und kontaminierten Embryonen und tauschen Sie das Medium gegen Danieau 30% aus. Dann inkubieren Sie die

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Das Video demonstriert eine Methode zur Kultivierung primärer retinaler Ganglienzellen aus Zebrafischembryonen. Embryonen im Frühstadium werden dissektioniert, um die Augen zu isolieren, die anschließend mechanisch in eine Suspension aus retinalen Ganglienzellen dissoziiert werden. Diese Zellsuspension wird auf Deckgläsern kultiviert, die mit Klebeproteinen beschichtet sind, um die Axonentwicklung zu erleichtern.

Erzeugung von primären retinalen Ganglienzellkulturen aus Zebrafischembryonen

Hier stellen wir ein reproduzierbares Verfahren adulte Neurogenese zu untersuchen, aus dem gesamten Gehirn stamm eine Neurosphäre Assay verwendet oder von entweder dem telencephalic, tectal oder cerebellar Regionen des adulten Gehirns Zebrabärbling. Zusätzlich beschreiben wir das Verfahren der Genexpression in Zebrabärbling Neurosphären zu manipulieren.

Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Embryologische Manipulationen wie Exstirpation und Transplantation von Zellen sind wichtige Werkzeuge, um die frühe Entwicklung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches und effektives Transplantationsgerät, um diese Manipulationen in Zebrafischembryonen durchzuführen.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für das modulare Tol2-Transgenese-System, eine Gateway-basierte Klonierungsmethode zur Herstellung und Injektion transgener Konstrukte in Zebrafischembryonen.

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

Hier stellen wir ein effektives, einfaches und schnelles 3D-Kulturprotokoll für die Bildung von Sphäroiden von zwei Zebrafisch-Zelllinien (Danio rerio) vor: ZEM2S (Embryo) und ZFL (normaler Hepatozyten).

Eine 3D-Kultivierungsmethode von Sphäroiden embryonaler und Leberzebrafischzelllinien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Transplantation von Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in Zebrafischembryonen und -larven in jedem Stadium zwischen mindestens 1 und 7 Tagen nach der Befruchtung vor.

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Lernen Sie die Kultur und Transfektion von Primärzellen aus Zebrafisch-Embryonen und adultem Gehirn. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Live-Cell-Imaging-Analysen zellulärer Dynamiken.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

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