Name: In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie die In-vitro-Aufzucht von Solitärbienenlarven zur Bewertung von Risikofaktoren durch Fungizide und mikrobielle Symbionten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Stressoren für den Bienenschutz.

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Die Autoren danken Kimball Clark und Tim Krogh für die Bereitstellung von Osmia Verschachtelung Schilf, Meredith Nesbitt und Molly Bidwell für Hilfe im Labor, DRS. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter und drei anonymen Gutachtern für Ihre nützliche Kommentare, die das Manuskript verbessert. Diese Arbeit wurde von USDA-Agricultural Research Service angeeignet Mittel (aktuelle Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin Ministerium für Landwirtschaft, Handel und Verbraucherschutz (#197199), National Science Foundation (unter unterstützt. Grant Nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494).

1. bereiten Sie Propiconazolhaltige Lösungen für Fungizid Belichtung Experimente
<ol><li>Bereiten Sie 0,1 x Fungizid-Lösung durch entsprechende Mengen von im Handel erworbenen propiconazolhaltige 14,3 % in sterilem Wasser am Tag des Experiments auflösen. Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereitete Fungizid-Lösung für alle Anwendungen verwendet wird.</li>
	<li>Fügen Sie 23 µL 0.1 x Fungizid-Lösung pro Gramm Pollen Bestimmung, die maximale Konzentration des propiconazolhaltige bereits berichtet von Bienen gesammelte Pollen24 (0,361 PPM oder µg Wirkstoff g-1 von Pollen) zu erhalten.</li>
</ol>2. ernten Sie Eier und Host-Pollen-Bestimmungen von Osmia Schilf
<ol><li>Mit einem sterilen Skalpell, sezieren Sie, frisch angeschlossen nisten Schilf von Osmia, Aufteilung in zwei Teile entlang der Länge des Blattes, die einzelnen Kammern verfügbar zu machen. Hinweis: Jedes Nest kann zwischen 8 bis 14 Kammern und ein einziges Ei innerhalb einer Kammer enthalten.</li>
	<li>Inspizieren Sie Schilf visuell um die Kammern männliche Eier anhand der bisher veröffentlichten Richtlinien77zu identifizieren. Verwendung einer sterilisierten gebogene Nadel entfernen jede Pollen Bestimmung zusammen mit dem zugehörigen Ei aus der Verschachtelung Schilf, und in einem sauberen wiegen Boot.</li>
	<li>Sanft die Bereitstellung mit einem sauberen feinen Pinsel das Ei trennen und das Frischgewicht der Pollen Bestimmung aufzunehmen und Ei mit einer standard-Labor-Waage. Das durchschnittliche Gewicht der männlichen Pollen Bestimmungen zu berechnen.</li>
	<li>Führen Sie die nachfolgenden Schritte mit einer minimalen Verzögerung die Gefahr eines Schadens zum Ei vor Übertemperatur und Austrocknung zu reduzieren.</li>
</ol>3. bereiten Sie Host Pflanze Pollen Bestimmungen
<ol><li>Sichtkontrolle des mütterlich gesammelten Wirtspflanze Pollens aus der Verschachtelung Kammern um sicherzustellen, dass keine Parasiten vorhanden78ausgegraben. Um jede mögliche mütterliche Bias zu reduzieren, kombinieren Sie die Pollen-Bestimmungen zu einer einheitlichen Masse in eine sterile Petrischale und mischen Sie gut mit einer sterilisierten Nadel.</li>
	<li>Teilen Sie die kombinierte Masse in Pollen Neuregelungen, um sicherzustellen, dass das Gewicht jedes rekonstituierte Bestimmung etwa gleich auf das durchschnittliche Gewicht einer natürlich zugewiesenen männlichen Bestimmung ist (meine ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42). Hinweis: Da Osmia sp. weist kleinere Pollen Bestimmungen an die männlichen Nachkommen, dies führt zu geringeren Körpergewicht der männlichen Larven im Vergleich zu Frauen77. Um eine solche Voreingenommenheit durch geschlechtsspezifische Unterschiede zu vermeiden, verwenden Sie nur männliche Eier in den Experimenten.</li>
</ol>4. bereiten Sie-Wirtspflanze Pollen Bestimmung vor
<ol><li>Pulverisieren Sie kommerziell gekauften Honig Bienen gesammelte Pollen zu einem feinen Pulver mit einer standard-Labor-Kugelmühle.</li>
	<li>Basierend auf den Feuchtigkeitsgehalt der mütterlich gesammelt Host Pollen Bestimmungen (~ 20 %), Hydrat der Pollen Pulver mit entsprechenden Volumes von 40 % sterilisiert Zucker Lösung79 und Mischung gründlich um zu eine Teig-Konsistenz zu bilden.</li>
	<li>Teilen Sie in einzelnen Pollen Massen, jeweils mit einem Gewicht von ungefähr das gleiche wie das durchschnittliche Gewicht einer natürlich zugewiesenen männlichen Bestimmung. Hinweis: Feuchtigkeitsgehalt der mütterlich gesammelten Host Pollen, die Bestimmungen in vor standardisiert werden können, durch den Vergleich der frischen und trockenen Gewichts Pollen Bestimmungen von 30 zufällig ausgewählten männlichen Kammern80. Um das Trockengewicht zu erhalten, sollten Pollen Bestimmungen werden gefriergetrocknet in ein Gefriertrockner (1,5 Pa 72 h).</li>
</ol>5. bereiten Sie Multiwell Zellplatten Kultur
<ol><li>Linie individuelle Vertiefungen der sterilen 48-Well Kultur Teller mit autoklaviert Zinn Tassen (5 × 9 cm). Verwenden sterile Pinzetten, sanft Flair aus dem oberen Rand der Kapsel, so dass es die Pollen Bereitstellung unterbringen kann.</li>
	<li>Legen Sie eine einzelne Masse der Host oder nicht-Host Pollen Bestimmung in die blechtasse mit sterilen Werkzeugen basierend auf der behandelten Gruppe. Hinweis: Zur Vermeidung von Kreuzkontamination verwenden Sie separate Platten für Behandlungs- und Kontrollgruppen.</li>
</ol>6. Fügen Sie Fungizide
<ol><li>Machen Sie eine zentral platzierte Depression innerhalb der Pollen-Masse mit einem sterilen Holzstab. Verwenden Sie einen neuen Stick für jede Erbringung von Pollen.</li>
	<li>Fügen Sie entsprechende Mengen Fungizid-Lösung (zur Behandlung) oder sterilem Wasser (für Steuerelemente) in die Depression. Klemmen Sie die Eröffnung der Depression mit sterilen Pinzette zur Minimierung der Kontaktfläche zwischen das Fungizid / sterile Wasser und das Ei.</li>
	<li>Sicherzustellen, dass der Faktorielle Aufbau des experimentellen Designs, die ausgerichtet in der schematischen Darstellung (Abb. 4) dargestellt.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> Abbildung 4. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Das Experiment ist ein vollständig gekreuzt 2 × 2 Faktorielle Setups. Faktor 1 stellt Fungizid Exposition und besteht aus 2 Ebenen: (i) kein Fungizid (N = 10), und (Ii) Fungizid (N = 10). Faktor 2 Pollen als Finanzierungsquelle und besteht aus 2 Ebenen: (i) Host Pollen (N = 8), und (Ii) nicht-Host Pollen (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
(7) hinten und Larven zu beobachten
<ol><li>Legen Sie eine zufällig gewählte männliche Ei auf der Oberseite der Pollen Bestimmung mit einem sauberen feinen Pinsel. Sobald Eier auf alle Bestimmungen gestellt worden sind, setzen Sie den Deckel der Kultur Zellplatte, befestigen Sie es mit Klebeband an den Ecken beschriften.</li>
	<li>Legen Sie die well-Platten auf einem sauberen Tablett und bedecken Sie es mit einem dunklen Tuch, Kontakt mit direktem Licht zu behindern. Platz 6 Brunnen Platte mit 30 mL steriles Wasser in das Fach, um Austrocknung zu verhindern. Lassen Sie Inkubation Tabletts ungestört in einem Inkubator bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Beobachten Sie well-Platten täglich unter dem sezierenden Mikroskop ohne Abnehmen des Deckels von der well-Platten. Stellen Sie sicher, dass die Larven lebendig sind, indem für die Bewegung. Wenn keine Bewegung erkannt wird, verwerfen Sie die blechtasse, die Toten Larven und die restlichen Blütenstaub-Bereitstellung enthalten. Lassen Sie alle Überlebende Larven innerhalb der well-Platten ungestört entwickeln, bis sie die prepupal Stadium zu erreichen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Larve aus der blechtasse, sobald es die prepupal Stufe41erreicht. Verwendung einer Bürste zu reinigen Stuhldrang aus dem Silk Kokon. Sorgfältig die Silk Cocoon sezierenden Mikroskop durchtrennt und Extrahieren der Prepupa mit Kautschuk-Zangen.</li>
	<li>Behandeln Sie die Prepupa vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Tools nicht den weichen Körper durchbohren zu tun. Notieren Sie das Frischgewicht des Prepupa (prepupal Biomasse) und die Entwicklungszeit vom Ei in die prepupal Phase (Larvale Entwicklungszeit). Hinweis: Jeder Tote Larve sollte sofort verworfen, um unerwünschten mikrobiellen Wachstums auf den Kadaver und übrig gebliebene Pollen zu verhindern. Dies reduziert das Risiko einer Infektion für die verbleibenden gesunden Larven.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Aufzucht von Bienen außerhalb ihrer natürlichen Verschachtelung Schilf unter Laborbedingungen ermöglicht die Prüfung von mehreren Hypothesen, die im Zusammenhang mit Larven Fitness. In dem Maße, in dem nicht identifizierte Faktoren weiterhin Bienensterben führen, riskieren Studien können in-vitro- Experimente mit Hilfe identifizieren möglicher Bedrohungen und Management-Praktiken zu informieren, für diese artenreichen Gruppe der wilden Bestäuber 12 ,38<...

Angesichts ihrer Rolle als die dominierende Gruppe von Bestäubern1, stellt der weltweite Rückgang der Bienenvölker eine Bedrohung für Ernährungssicherheit und Ökosystem Stabilität2,3,4,5,6 ,7. Die rückläufigen Trends in beiden verwaltet und wilde Bienenvölker werden mehrere gemeinsame Risikofaktoren einschließlich Habitatfragmentierung, neue Parasiten und Krankheitserreger, Verlust der genetischen Vielfalt und die Einführung invasiver Arten3 zugeschrieben ,4,7,8,9,10,11,12. Insbesondere ist der dramatische Anstieg der Verwendung von Pestiziden, (z. B. Neonicotinoide) direkt zu negativen Auswirkungen bei den Bienen13,14,15verbunden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass der Synergismus zwischen Neonicotinoide und Ergosterol-Biosynthese-Hemmung (EBI) Fungizide über mehrere Biene Arten16,17,18 , hohe Mortalität führen kann , 19 , 20 , 21 , 22. dennoch Fungizide, lange Zeit als "Biene-Safe", weiterhin auf-Blüte ernten ohne viel Kontrolle23gesprüht werden. Sammlerbienen sind dokumentiert worden, um routinemäßig wieder Pollen Lasten mit Fungizid Rückstände24,25,26kontaminiert. Der Verzehr von solchen Fungizid-Ladenpollen kann dazu führen, dass hohe Mortalität unter larval Bienen27,28,29,30und eine Palette subletale Effekte unter Erwachsenen Bienen16 , 31 , 32 , 33 , 34. eine aktuelle Studie legt nahe, dass Fungizide Biene Verluste verursachen, durch die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft im Bienenstock gespeichert Pollen, dabei stören die kritische Symbiosen zwischen Bienen und Pollen-borne Mikroben35.
Obwohl solitäre Bienen für die Bestäubung von mehreren wild und landwirtschaftliche Pflanzen36,37,von entscheidender Bedeutung sind hat38, diese heterogene Gruppe der Bestäuber in Pestizid Überwachung Studien viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Das Nest einer erwachsenfrau einsame enthält ca. 5-10 versiegelte Brut Kammern, jeweils bestückt mit einer endlichen Masse von mütterlich gesammelten Pollen und Nektar und ein einzelnes Ei-39. Nach dem Schlüpfen verlassen die Larven auf die zugewiesenen Pollen-Bereitstellung und die zugeordneten Pollen getragen Mikrobiota, angemessene Ernährung40,41zu erhalten. Weil sie die Vorteile eines sozialen Lebensstils fehlt, möglicherweise solitäre Bienen anfälliger für Pestizid Exposition42. Zum Beispiel während der Defizite im sozialen Bienen nach einem Spray kompensiert werden kann einige verlängern von Arbeitern und neu entstehende Brut, der Tod eines einzigen einsamen erwachsenfrau endet alle Vermehrungstätigkeit43. Solche Unterschiede in der Empfindlichkeit unterstreichen die Notwendigkeit, diverse Biene Taxa in Ökotoxikologische Untersuchungen ausreichend Schutz für verwaltete und wilde Bienen gleichermaßen zu integrieren. Aber abgesehen von einer Handvoll Studien, Untersuchungen über die Auswirkungen der Fungizid-Exposition in erster Linie konzentriert sich auf soziale Bienen18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.
Solitäre Bienen gehören zur Gattung Osmia (Abbildung 1) sind weltweit als effiziente Bestäuber mehrere wichtige Obst-und Nuss Pflanzen39,50,51,53, benutzt worden 53. Gruppen mit anderen verwalteten Bestäuber24,54,55,56,57,58, Osmia Bienen sind routinemäßig Fungizide in voller Blüte ernten44aufgesprüht ausgesetzt. Adulte Weibchen auf Nahrungssuche auf vor kurzem gespritzten Pflanzen sammeln und lagern ihre Brut Kammern mit Fungizid-beladenen Pollen, die später die alleinige Ernährung für die entwickelnden Larven bildet. Verzehr von kontaminierten Pollen Bestimmungen kann anschließend die Larven zu Fungizid Rückstände42verfügbar. Das Risiko eines möglicherweise höhere unter monophyletische Arten, die nur auf wenige eng verwandte Host Pflanzen59,60,61Futter. Zum Beispiel scheinen bestimmte Megachilid Bienen, bevorzugt für minderwertige Asteraceae Pollen, als ein Mittel zur Verringerung von Parasitismus62Futter. Jedoch wurde das Ausmaß auf dem Fungizide Larven Fitness unter monophyletische solitäre Bienen auswirken empirisch nicht quantifiziert. Das Ziel dieser Studie ist es, ein Protokoll, um die wichtigsten test entwickeln und interaktive Effekte von Fungizid Exposition und Pollen Quelle auf die Fitness der in-vitro- aufgezogen Solitärbienen. Um zu untersuchen, können Eier von O. Ribifloris Sensu Lato (s.l.) im Handel bezogen werden (Table of Materials). Diese Population eignet sich wegen seiner Bedeutung als eine native Bestäuber und seine starke Vorliebe für die nektarreichen Mahonia Aquifolium (Mahonie) gefunden in der Region53,63,64 (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> Abbildung 1: Ein hochauflösendes Foto von einem Erwachsenen Osmia Ribifloris. Photo credit Dr. Jim Cane, Forschung Entomologe, USDA-ARS <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> Abbildung 2: Phragmite nisten Schilf von Osmia Ribifloris (s.l.) mit einem brütenden Weibchen im Vordergrund. Kammer-Partitionen und Klemme Stecker für die Stimmzungen sind aus vorgekaute Blättern gefertigt. Bildnachweis: Herr Kimball Clark, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
Das erste Ziel dieser Studie ist die Wirkung des Verzehrs von Fungizid behandelt Pollen auf Larven Fitness (gemessen an der Entwicklungszeit und prepupal Biomasse) bewerten. Während der Exposition gegenüber der allgemein angewandten Fungizid-propiconazolhaltige mit erhöhter Mortalität unter Erwachsenen Bienen über mehrere Arten 23,24,32,44,45, verbunden worden ist 54,55,56,57,58,65,66,67, ihre Auswirkungen auf die larval Bienen ist weniger bekannt. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Bewertung der Auswirkungen des Konsums von nicht-Host Pollen auf Larven Fitness. Bisherige Studien zeigen, dass Larven der monophyletische Bienen nicht weiterentwickeln, wenn gezwungen, nicht-Host Pollen68verbrauchen. Solche Ergebnisse können Schwankungen der Biene Physiologie69, Pollen Biochemie70und die wohltuende Microbiome verbunden mit natürlichen Pollen Bestimmungen71zugeschrieben werden. Das dritte Ziel dieser Studie ist es, die interaktiven Effekte der Fungizidbehandlung und diätetische Pollen auf Larven Fitness zu bewerten.
Zahlreiche biologische Merkmale, einschließlich mütterlichen Körpergröße, sind Bereitstellung Rate, Futtersuche Strategie und Pollen Menge72,73,74,75 bekannt, larval Fitness unter solitäre Bienen beeinflussen. Diese Faktoren können erhebliche Variabilität zwischen Schilf, die eine Herausforderung vertretbar experimentellen Designs zu entwickeln, bei der Beurteilung der Larven Gesundheit darstellt einführen. Darüber hinaus da die Larvalentwicklung in versiegelten Verschachtelung Schilf auftritt, sind der Auswirkungen von solchen Variabilität auf die Nachkommen schwierig zu visualisieren und quantifizierte ohne Verwendung von nicht-tödlichen Techniken (Abbildung 3). Um diese Herausforderung zu meistern, sind alle Hypothesen im Rahmen dieser Studie mit Larven aufgezogen außerhalb ihre Verschachtelung Schilf getestet. Das experimentelle Design stellt eine vollständig gekreuzte 2 × 2 Faktorielle Set-ups, mit jeder Faktor bestehend aus 2 Ebenen; Faktor 1: Fungizid Exposition (Fungizid; Kein Fungizid); Faktor 2: Pollen Quelle (Host Pollen, Non-Host Pollen). Bienen werden aus dem Ei in die prepupal Phase im sterilen multiwell Kultur Zellplatten unter kontrollierten Laborbedingungen ausgelöst. Jeder ist gut individuell bestückt mit einer standardisierten Menge Blütenstaub und ein einziges Ei. Nach dem Schlupf der Larve ernährt sich von den zugewiesenen Pollen in den Brunnen, vervollständigt Larvalentwicklung und Verpuppung initiiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass unerklärliche Sterblichkeit bei den Bienen innerhalb dieser künstliche Aufzucht Umgebung als in die wilde49,76aufgetretenen geringer ist. Die Verwendung von in-Vitro-gezüchteten Bienen hat mehrere Vorteile gegenüber feldbasierte Untersuchungen: 1) es minimiert die verwirrende Wirkung der natürlichen Variabilität und unkontrollierte Faktoren, die in der Regel mit Feld-Studien; (2) Es kann mehrere Ebenen von Manipulation für jedes Risiko von Interesse über Behandlungsgruppen gleichzeitig getestet werden; (3) die Anzahl der Wiederholungen kann vorgegeben werden, und experimentelle Faktoren für jede replizieren können individuell bearbeitet werden; (4) Larven Antwortvariablen problemlos visualisiert und unabhängig ohne störende neben Larven aufgenommen; (5) das Protokoll kann geändert werden, um komplexere experimentellen Designs mit mehreren Faktoren und Zielgrößen zu berücksichtigen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> Abbildung 3. Inhalte in eine natürliche Nistplätze Schilf von Osmia Ribifloris (s.l.). Nahaufnahme von (A) ein seziert Schilfrohr mit einzelnen Kammern, Pollen Bestimmungen und Partitionen, und (B) frisch Pollen Bestimmungen und die damit verbundenen Eier (gekennzeichnet mit einem schwarzen Kreis) geerntet. <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Eier von O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td></tr><tr><td>Osmia Schilfrohr</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>Frisch gestecktes Schilf</td></tr><tr><td>Dissektionsset</td><td>VWR</td><td>89259-964</td> Vor <td>Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>Langzange</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Steril versiegelt</td></tr><tr><td>48-Well-Kulturplatten</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>Steril versiegelte</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>25373100</td><td>Steril versiegelte</td></tr><tr><td>quadratische Wiegeschiffchen</td><td>VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>Kamelhaarbürste</td><td>Bioquip</td><td>1153A</td><td></td></tr><tr><td>Zinnkapseln</td><td>EA Verbrauchsmaterialien</td><td>D1021</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazol 14,3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazol 14,3%</td></tr><tr><td>Honigbienenpollen</td><td>Bienenenerregt 897098001244</td><td></td><td>Unbehandelter, natürlicher, roher Pollen</td></tr><tr><td>Mikrowaage</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td></td><td></td>30334913</tr><tr><td>Holzstäbchen</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>Dichtband</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>Pflanzschale</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospritze</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>Gummipinzette</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadeln</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>Statistiksoftware</td><td>SPSS</td><td>Version 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro- aufzucht von solitärbienen: ein werkzeug für die beurteilung der larven risikofaktoren

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Obwohl Solitärbienen entscheidend Bestäubung wild und verwalteten Kulturen erbringen, hat dieser artenreichen Gruppe weitgehend in Schädlingsbekämpfungsmitteln Verordnung Studien übersehen worden. Das Risiko einer Exposition gegenüber Fungizid Rückstände ist wahrscheinlich zu hoch sein, insbesondere wenn das Spray auf oder in der Nähe von Wirtspflanzen auftritt, während die Bienen sammeln Pollen ihre Nester bereitstellen. Arten von Osmia , die Pollen von einer ausgewählten Gruppe von Pflanzen (Oligolecty) zu konsumieren, kann die Unfähigkeit zur Nutzung der Pollen von nicht-Wirtspflanzen ihre Risikofaktor für Fungizid-bezogene Toxizität erhöhen. Dieses Manuskript beschreibt Protokolle verwendet, monophyletische Mauerbienen, Osmia Ribifloris Sensu Lato, vom Ei bis zum prepupal Stadium in Kultur Zellplatten unter standardisierten Laborbedingungen erfolgreich aufzuziehen. Die in-Vitro-gezüchteten Bienen werden anschließend verwendet, um Belichtung und Pollen Quelle Fungizid auf Biene Fitness auswirkt. Basierend auf einem 2 × 2 vollständig gekreuzt faktoriellen Design, untersucht das Experiment die Haupt- und interaktive Auswirkungen von Fungizid Exposition und Pollen Quelle an Larven Fitness, durch prepupal Biomasse, Larvale Entwicklungszeit und Survivorship quantifiziert. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, die Verwendung von in-Vitro-gezüchteten Bienen natürlichen Hintergrund Variabilität reduziert und ermöglicht die gleichzeitige Manipulation von mehreren experimentellen Parameter. Das beschriebene Protokoll präsentiert ein vielseitiges Werkzeug für Hypothesen Tests, an denen die Suite von Faktoren, die Gesundheit der Bienen. Für Erhaltung Bemühungen mit erheblichen und dauerhaften Erfolg erfüllt werden werden solche Einblicke in das komplexe Zusammenspiel von physiologischen und ökologischen Faktoren, die Biene Rückgänge erweisen sich als kritisch.

Larval Fitness wurde mit drei Metriken (i) Larvale Entwicklungszeit, (Ii) prepupal Biomasse und (Iii) Prozent Survivorship quantifiziert. Eine zwei-Wege-ANOVA wurde mit Fungizid Exposition durchgeführt (zwei Ebenen: kein Fungizid, Fungizid) und Pollen Quelle (zwei Ebenen: Host Pollen, Non-Host Pollen) als die unabhängigen Variablen und Larvale Entwicklungszeit als abhängige Variable. Der Haupteffekt für Fungizid Exposition (F1,28 = 1.24, P = 0,28) war nicht si...

Fungizid-Sprays auf Blütenpflanzen können solitäre Bienen gegenüber hohen Konzentrationen von Pollen getragen Fungizid Rückstände aussetzen. Mit Labor-basierten Experimente mit in-Vitro-gezüchteten Bienenlarven, diese Studie untersucht die Wechselwirkungen des Verzehrs von Fungizid behandelt Pollen aus Host und nicht-Host Pflanzen gewonnen.

In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Solitäre Bienenarten stellen die vielfältigste Bienengruppe auf dem Planeten dar, aber es kann ziemlich schwierig sein, die Larven unter streng kontrollierten Bedingungen erfolgreich aufzuziehen. Wir haben eine Methode für die In-vitro-Kultivierung von Solitärbienenarten entwickelt, die es uns ermöglicht, Risikofaktoren, die mit ihren mikrobiellen Symbionten verbunden sind, zu isolieren und zu messen. Bei bestimmten stengelbrütenden Solitärbienenarten ist es entscheidend, dass die Kultivierungstechniken sowohl auf die jungen Larven als auch auf ihre durch Pollen übertragenen mikrobiellen Symbionten abgestimmt sind.Hier haben wir die wichtigsten und interaktiven Effekte mehrerer Stressoren beleuchtet, so dass wir erkennen können, ob die Stressoren weitgehend allein oder gemeinsam wirken. Das Verfahren wird von Molly Bidwell und Prarthana Dharampal, beide aus meinem Labor, vorgeführt. Präparieren Sie mit einem sterilisierten Skalpell frisch gestopftes Osmia-Nistrohr.Teilen Sie die Blätter der Länge nach in zwei Teile, um die einzelnen Kammern freizulegen. Nester enthalten typischerweise acht bis 14 Kammern mit einem Ei pro Kammer. Identifiziere die männlichen Eier mit der Standardmethode.In diesem Experiment werden aufgrund der geschlechtsspezifischen Verzerrung bei der Pollenvorratsgröße nur männliche Eier verwendet. Männliche Provisionen sind in der Regel kleiner als weibliche Provisionen. Entfernen Sie dann mit einem sterilisierten Instrument alle Pollenvorräte zusammen mit dem zugehörigen Ei und legen Sie sie in ein sauberes Waagscherchen.Trennen Sie in der Waage vorsichtig das Ei vom Vorrat. Wiegen Sie dann den Pollenvorrat und das Ei getrennt ab. Arbeiten Sie schnell mit den Osmia-Eiern, um die Zeit ohne Pollen zu minimieren.Für die Vorbereitung der Wirtspollenversorgung ist zunächst der mütterlich gesammelte Wirtspflanzenpollen, der aus den Nistkammern ausgegraben wurde, visuell auf Parasiten zu untersuchen. Um eine mögliche maternale Verzerrung zu reduzieren, kombinieren Sie dann die Pollenprodukte zu einer einzigen Masse und mischen Sie sie mit einer sterilisierten Nadel. Als nächstes teilen Sie den Wirtspollen in neue Vorräte mit Standardmasse auf.Zur Aufbereitung von Pollen, die keine Wirtspflanzen sind, pulverisieren Sie kommerziell gekauften, von Honigbienen gesammelten Pollen mit einer Standard-Laborknochenmühle zu einem feinen Pulver. Hydratisieren Sie dann das Pollenpulver basierend auf dem Feuchtigkeitsgehalt der Wirtspollenvorräte mit einer sterilisierten 40%igen Zuckerlösung. Das Ganze zu einer teigartigen Konsistenz verrühren.Stellen Sie dann Pollenvorräte für Nichtwirte her, die das gleiche Gewicht haben wie der von der Mutter gesammelte Vorrat. Für die Behandlungsplatte legen Sie die einzelnen Vertiefungen einer 48-Well-Kulturplatte mit autoklavierten Zinnbechern aus. Bereiten Sie separate Platten für die Behandlungs- und Kontrollgruppe vor.Dann wird mit einer sterilen Pinzette der obere Rand der Becher vorsichtig aufgeweitet, damit sie den Pollenvorrat aufnehmen können. Als nächstes füllst du einzelne Pollenvorräte in die Blechbecher. Machen Sie nun innerhalb jeder Pollenmasse mit einem sterilen Holzstab eine mittig platzierte Vertiefung.Für jede Pollenversorgung ein neues Stäbchen verwenden. Geben Sie in die Vertiefung die entsprechenden Mengen an Behandlungslösung, wie z. B. Fungizid und steriles Wasser zur Kontrolle. Nach jeder Zugabe die Vertiefung mit einer sauberen sterilen Pinzette zudrücken.Füllen Sie zu Beginn jede Behandlungsplatte gut mit einer zufällig ausgewählten männlichen Eizelle. Lege ihn mit einem sauberen, feinen Pinsel auf den Pollenvorrat. Sobald die Eier platziert sind, befestige den Deckel mit Klebeband an den Ecken auf dem Teller.Stellen Sie dann jede vorbereitete Platte in einen Inkubator, der bei Raumtemperatur gehalten wird. Fügen Sie eine Sechs-Well-Platte hinzu, die mit sterilem Wasser beladen ist, um ein Austrocknen zu verhindern. Lassen Sie die Platten ungestört im Inkubator.Überprüfen Sie die Platte täglich unter einem Präpariermikroskop, ohne den Deckel zu entfernen. Wenn die Larven leben, bewegen sie sich. Wenn keine Bewegung festgestellt wird, entsorgen Sie den Blechbecher mit den toten Larven und dem restlichen Pollenvorrat.Wenn eine Larve das Präpuppenstadium erreicht, nehmen Sie sie aus dem Blechbecher und reinigen Sie den Seidenkokon mit einer Bürste von Frass. Schneiden Sie dann mit einem Präpariermikroskop vorsichtig durch den Seidenkokon und extrahieren Sie die Prepupa mit einer federleichten Pinzette. Behandeln Sie die Puppe vorsichtig, um Schäden am Körper zu vermeiden.Notieren Sie nun die Masse der Präpuppe und die Entwicklungszeit von der Eizelle bis zum Präpupalstadium. Die Fitness der Larven wurde anhand der Entwicklungszeit der Larven und der präpuppenden Biomasse quantifiziert. Es zeigte sich eine signifikante negative Korrelation zwischen der Entwicklungszeit der Larven und der präpupalen Biomasse zwischen fungizidbehandelten und unbehandelten Gruppen.Obwohl es eine signifikante negative Korrelation für Larven gab, die auf Nicht-Wirtspollen aufgezogen wurden, wurde keine solche Korrelation für Larven beobachtet, die auf Wirtspollen aufgezogen wurden. Die Pollenquelle hatte einen signifikanten Haupteffekt auf die Fitness der Bienen. Bei der Aufzucht von Nichtwirtspollen verlängerte sich die Entwicklungszeit der Larven signifikant, während die präpusale Biomasse sowohl in fungizidbehandelten als auch in unbehandelten Gruppen im Vergleich zu Larven, die auf Wirtspollen aufgezogen wurden, signifikant abnahm.Die Exposition gegenüber Fungiziden hatte keinen signifikanten Haupteffekt auf die Fitness. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Entwicklungszeit und der präpupalen Biomasse für Behandlungen, die auf Wirts- und Nichtwirtspollen aufgezogen wurden, zwischen fungizidbehandelten und unbehandelten Gruppen. Es gab keinen signifikanten interaktiven Effekt der Fungizidexposition und der Pollenquelle auf die Entwicklungszeit der Larven und die präpupale Biomasse.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Solitärbienenlarven unter In-vitro-Bedingungen erfolgreich aufzieht. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um Bienen unter In-vitro-Bedingungen vom Ei bis zum Puppenstadium aufzuziehen, während sie eine minimale Sterblichkeit durch den Umgang mit Stress verursacht. Bei der Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Eier oder sehr junge Larven zu verwenden.Dies stellt sicher, dass die Larven fast ausschließlich auf die beabsichtigte Manipulation von Diätbehandlungen aufgezogen werden. Dieses Protokoll kann auf mehrere andere Arten von Solitärbienen und Wespen ausgeweitet werden und kann leicht modifiziert werden, um die wichtigsten und interaktiven Auswirkungen mehrerer Risikofaktoren zu testen, die sich auf die Gesundheit von Bestäubern auswirken. Durch die Bereitstellung eines Mittels für die In-vitro-Kultivierung von Solitärbienenlarven kann diese Technik dazu beitragen, bisher unbekannte Risikofaktoren bei gefährdeten Bienenpopulationen zu identifizieren.Einige ihrer Experimente, die auf diesem Protokoll basieren, können beispielsweise dazu beitragen, die Rolle des Pollenmikrobioms bei der Übertragung unterschiedlicher Grade der Resistenz gegen xenobiotische Stressoren zu ermitteln. Als zugängliche und kostengünstige Technik stellt dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug für die Hypothesenprüfung dar, das von den Forschern leicht modifiziert werden kann, um ihre eigenen Forschungsziele zu erreichen.

in-vitro-rearing-solitary-bees-tool-for-assessing-larval-risk

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Forschung

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Eine Nasennebenschutz-Protokoll für die Untersuchung Verhaltensplastizität bei Insekten: Anwendung auf Grund, Biomedizinische und Agrarforschung

Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien.

In-vivo-und In-vitro-Aufzucht von Nematoden (Steinernematidae und Heterorhabditidae)

Hier präsentieren wir   ein Verfahren Pestizid kontaminierte Lebensmittel sowohl mit einer einzelnen Honigbiene und einer Bienenkolonie zu ernähren. Das Verfahren bewertet die Pestizid Auswirkungen auf die einzelnen Honigbienen durch in - vivo - Zufuhr von basischen Larven Ernährung und auch auf den natürlichen Zustand der Bienenkolonie.

Die Bewertung der Wirkung von Umweltchemikalien auf Honig-Bienen-Entwicklung von der Person zu Colony Ebene

In diesem Protokoll werden Methoden für die Durchführung von Inzucht Kreuze und zur Beurteilung des Erfolgs eines dieser Kreuze, die Ameise Vollenhovia Emeryibeschrieben. Diese Protokolle sind wichtig für Experimente zur Verständnis der genetischen Grundlagen von Geschlecht Bestimmung Systeme in Hymenoptera.

Induktion und Bewertung von Inzucht Kreuze mit Ant, Vollenhovia Emeryi

Hier stellen wir Protokolle für 1) die Laborvermehrung des bundesweit gefährdeten Miami-Blaufalters (Cyclargus thomasi bethunebakeri) und 2) zur Bewertung grundlegender lebensgeschichtliche Informationen wie unreife Entwicklungszeit und Anzahl der Larvenstadien vor. Beide Methoden können für den Einsatz mit anderen Ex-situ-Konservierungsprogrammen angepasst werden.

Risikogefährdete Programme zur Vermehrung von Schmetterlingen, um das Wissen um die Lebensgeschichte und effektive Ex-Situ-Konservierungstechniken zu verbessern

Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Verständnis dafür zu verbessern, wie Agrochemikalien die Reproduktion von Honigbienen (Apis mellifera) beeinflussen, indem Methoden etabliert werden, um Honigbienenköniginnen und ihre Arbeiterpfleger in einer kontrollierten Laborumgebung Agrochemikalien auszusetzen und ihre relevanten Reaktionen sorgfältig zu überwachen.

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Das vorliegende Protokoll erläutert eine Methode zur Verfütterung von mit Pestiziden kontaminierten Vorräten an die Larven der Solitärbienen, Osmia excavata. Das Verfahren untersucht die Ökotoxizität des Pestizids für die Larven der Solitärbienen.

Bewertung der Wirkung von Pestiziden auf die Larven der Solitärbienen

In diesem Artikel werden zwei Protokolle zur Beurteilung der Nahrungsquelle und der Eiablagepräferenzen bei Larven und Weibchen von Schmeißfliegen beschrieben. Diese umfassen vier Auswahlmöglichkeiten mit zwei interagierenden Faktoren: Substrattyp und Temperatur. Die Assays ermöglichen die Bestimmung der Nahrungsquellenpräferenz der Larven und der Eiablagepräferenz für die Weibchen.

Erforschung der Lebensgeschichte: Verwendung von Temperatur und Substrattyp als interagierende Faktoren für Schmeißfliegenlarven und weibliche Präferenzen

Wir demonstrieren eine erprobte Methode für den sicheren Umgang mit auf dem Feld gesammelten Bienen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Manipulation, Identifizierung, genetische Probenahme und Bestätigung von Pflanzen-Insekten-Interaktionen über Pollen, die während der Probenahme gesammelt werden. Dieser Ansatz ist leicht anpassbar und bietet ein kostengünstiges, nicht-tödliches Mittel zur Untersuchung seltener Insektengruppen.

Eine schnelle Methode, um Bienen auf dem Feld einzusperren und sicher zu handhaben

Erfahren Sie die In-vitro-Aufzucht von Solitärbienenlarven zur Bewertung von Risikofaktoren durch Fungizide und mikrobielle Symbionten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Stressoren für den Bienenschutz.

In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren

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