Name: Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Lernen Sie die quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und dem Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in menschlichen Fibroblasten während der H-Ras-induzierten Seneszenz kennen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (2015R1D1A1A01060839) (zu jung Yeon Kim) und durch einen National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss von der Regierung von Korea (MSIT) finanziert (Nein 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (um Jeanho Yun).

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<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
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<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
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<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
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<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
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<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir Methoden für die Überwachung der intrazellulärer ROS Ebenen während H-Ras-induzierte Seneszenz in normalen menschlichen Fibroblasten WI-38 vorgestellt. Intrazellulären ROS in lebenden Zellen gemessen werden quantitativ mit der Zelle durchlässig Reagenz DCF-DA und flow Cytometry. Auf zelluläre Aufnahme ist DCF-DA deacetylated von intrazellulären Esterasen und anschließend oxidiert durch ROS stark fluoreszierende 2', 7'-dichlorofluoresceins (DCF) bilden. DCF-Fluoreszenz kann durch Durchflusszytometrie mit ei...

Mehr als 50 Jahren offenbarte Hayflick und Moorhead, dass normale Zellen irreversibel Wachstum Verhaftung auf die Erschöpfung der proliferativen entfalten nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen1eingeben. Dieses Phänomen ist heute bekannt als replikative Seneszenz und wird geglaubt, um mit organismal Altern2stark korrelieren. Obwohl die fortschreitende Erosion der Telomere als eine der Hauptursachen für replikative Seneszenz gilt, worden verschiedenen zelluläre Belastungen, wie DNA-Schäden, Onkogene Aktivierung und oxidativen Stress, berichtet, eine andere Art der zellulären Seneszenz induzieren "vorzeitige Seneszenz" oder "Stress-induzierte Seneszenz" genannt. Interessanterweise spielt vorzeitige Seneszenz eine potente Tumor-suppressive Rolle bei der Aktivierung der Onkogene wie H-Ras und BRAF. Studien an Mäusen und menschlichen Geweben haben starke Beweise hergestellt, die Biomarker der Zelle Seneszenz überwiegend in prämaligne Läsionen vorhanden waren, wo Onkogenen Ras und BRAF sind aktiviert, aber wurden in bösartigen Tumoren, die von entwickelt vermindert Diese Läsionen3,4,5. Über seine Rolle als Altern und Tumor-Unterdrückung zelluläre Seneszenz in früheren Studien nachweislich eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der Wundheilung, Gewebereparatur immunüberwachung und embryonale Entwicklung6.
Obwohl Wachstum Verhaftung als ein Markenzeichen der zellulären Seneszenz7ausgiebig untersucht wurde, schlägt eine erhebliche Zahl von beweisen, dass die intrazelluläre reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auch einen Beitrag zur zellulären Seneszenz8. Die Höhe des ROS Ebenen während der verschiedenen Arten der zellulären Seneszenz, einschließlich replikative Seneszenz und Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), hieß ursprünglich vor Jahrzehnten9,10. Mehr induziert direkt, exogene Behandlung mit subletale Dosis von H2O2 Seneszenz11,12. Die Hemmung der ROS-Aufräumvorgang Enzyme wie SOD1, verursacht auch vorzeitige Seneszenz13. Im Gegensatz dazu niedrig ambient sauerstoffbedingungen und Erhöhung der ROS Aufräumvorgang verzögert das Auftreten von Seneszenz10,14,15. Diese Ergebnisse zeigen zweifellos, dass ROS wichtige Mediatoren oder Determinanten der zellulären Seneszenz Induktion sind. Jedoch wie ROS beitragen zur Induktion der zellulären Seneszenz und wie erhöhte ROS Niveaus während der zellulären Seneszenz sind weitere machen Sie Untersuchungen nötig.
Neuere Studien haben gezeigt, dass alternde Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch eine SASP16,17. Im Alter von Gewebe fördern seneszenten Zellen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen über viele Wege durch SASP neben einer autonomen Erschöpfung der proliferativen Zellen. Proinflammatorischen Faktoren, wie IL-6, IL-8, TGFβ und Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sezerniert seneszenten Zellen verursachen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen durch Beeinträchtigung der Gewebe Homöostase, Zerstörung der Gewebearchitektur Seneszenz der benachbarten Zellen und sterile Entzündung18,19. Allerdings kann die SASPs je nach biologischen Kontext günstig auswirken. Heterogenetic Artder SASPs hängt darüber hinaus die alternde Zelltyp und Zell-Stadium, betonend, dass weitere Forschung19.
Hier beschreiben wir rasche und sensible zytometrie-basierte Techniken für die Beurteilung der intrazelluläre ROS Ebenen während OIS. Darüber hinaus werden Methoden zur Analyse der SASP Faktoren mit quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) und ELISA eingeführt.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr>, <tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl &beta; D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>wellgen</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Reverse Transkriptase</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master 2x Mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 ELISA-Assay für Menschen</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 ELISA-Assay für Menschen</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m Spritzenfilter</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-System</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>EMax Mikroplatten-Reader</td><td></td></tr></tbody></table>

eine quantitative messung von reaktiven sauerstoffspezies und seneszenz-assoziierten sekretorischen phänotyp in normalen menschlichen fibroblasten während onkogen-induzierte seneszenz

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Zelluläre Seneszenz wurde einen Zustand der irreversiblen Wachstum Festnahme nach Erschöpfung der proliferative Kapazität oder Exposition gegenüber verschiedenen Belastungen berücksichtigt. Jüngste Studien haben die Rolle der zellulären Seneszenz, verschiedene physiologische Prozesse, einschließlich Entwicklung, Wundheilung, immunüberwachung und altersbedingte Gewebe Dysfunktion erweitert. Zwar Zellzyklus Festnahme einer kritischen Markenzeichen der zellulären Seneszenz, wurde eine erhöhte intrazelluläre reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Produktion auch eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz gezeigt. Neue Studien zufolge darüber hinaus seneszenten Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) ausstellen. Die starke gestiegene Interesse bezüglich Therapiestrategien gegen zelluläre Seneszenz betont die Notwendigkeit für ein genaues Verständnis der Seneszenz Mechanismen, einschließlich der intrazellulären ROS und der SASP. Hier beschreiben wir Protokolle für die Beurteilung der quantitativ intrazelluläre ROS Ebenen während H-Ras-induzierte zellulären Seneszenz mit ROS-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und Durchflusszytometrie. Darüber hinaus stellen wir sensible Techniken für die Analyse der Induktion von mRNA Expression und Sekretion von SASP Faktoren. Diese Protokolle können auf verschiedenen zellulären Seneszenz Modelle angewendet werden.

Ein Beispiel für H-Ras-induzierte Seneszenz ist in Abbildung 1dargestellt. Eine Infektion des normalen menschlichen Fibroblasten WI-38 mit der H-RasV12-Retroviren induzierte dramatische morphologische Veränderungen (Abb. 1 b). Darüber hinaus wurde wie in Abbildung 1dargestellt, SA β-gal-Färbung-Aktivität bemerkenswert auf H-RasV12 Ausdruck erhöht. Mehr als 70 % der Zellen zeigte SA β-gal-Färbung Akti...

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, empfindliche Techniken zur Überwachung der intrazellulären ROS-Spiegel und des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) während der zellulären Seneszenz bereitzustellen. Hier zeigen wir, dass diese Methoden erfolgreich den Anstieg der intrazellulären ROS-Spiegel und der SASP-Faktoren IL-6 und IL-8 während der H-Ras-induzierten Seneszenz in WI-38 normalen humanen Fibroblasten aufzeigen. Diese Techniken ermöglichen die Überwachung von Veränderungen der intrazellulären ROS-Spiegel während der zellulären Seneszenz und die Analyse der Expression von SASP-Faktoren.Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie auf viele verschiedene zelluläre Seneszenzmodelle angewendet werden können. Daher kann uns diese Methode letztendlich helfen, die Rolle von ROS und SASP bei der zellulären Seneszenz zu verstehen und die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen zu untersuchen. Das Verfahren wird von Young Yeon Kim und Jee-Hyun Um aus meinem Labor vorgeführt.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das H-Ras-Retrovirus vorbereiten. Zuerst werden ökotrope BOSC-Zellen in einer Poly-L-Lysin-beschichteten Kulturschale ausgesät und einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator kultiviert. Am nächsten Tag transfizieren Sie die BOSC-Zellen mit retroviraler H-Ras-DNA und Verpackungs-DNAs unter Verwendung des Transfektionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers.Entfernen Sie nach acht Stunden Transfektion das Transfektionsmedium und fügen Sie acht Milliliter frisches Medium hinzu. Sammeln Sie das Medium mit Viruspartikeln 48 Stunden später und entfernen Sie Zelltrümmer durch Zentrifugation. Filtrieren Sie anschließend das virushaltige Medium mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter.Einen Tag vor der Entnahme des H-Ras-Retrovirus werden WI-38-Zellen in eine 60-Millimeter-Kulturschale eingelegt und einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator kultiviert. Entfernen Sie am nächsten Tag das Wachstumsmedium und fügen Sie einen Milliliter H-Ras-Virusmedium hinzu. Fügen Sie zusätzlich einen Milliliter Wachstumsmedium mit zwei Mikrolitern Polybrene-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie einen Tag lang im CO2-Inkubator.Entfernen Sie 24 Stunden nach der Infektion das Virusmedium, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie das Wachstumsmedium hinzu. Um nicht infizierte Zellen zu entfernen, behandeln Sie die Zellen zwei Tage lang mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Bereiten Sie frische SA Beta-Gal-Färbelösung vor, indem Sie die Stammlösung verdünnen.Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie formaldehydhaltige Fixierlösung hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Entfernen Sie die Fixierlösung aus den Zellen und waschen Sie sie mit PBS.Fügen Sie frisch zubereitete SA Beta-Gal-Färbelösung hinzu, um das Gericht zu bedecken. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator ohne CO2. Überprüfen Sie am nächsten Tag den Färbestatus der Zellen unter dem Mikroskop.SA beta-gal-positive Zellen erscheinen im perinukleären Bereich blau. Erfassen Sie ein Bild der SA-Beta-Gal-Färbung mit einer CCD-Kamera und berechnen Sie den Prozentsatz der SA-Beta-Gal-gefärbten Zellen, indem Sie die Anzahl der SA-Beta-Gal-positiven Zellen unter mindestens 200 Zellen insgesamt zählen. Plattieren Sie zwei mal 10 bis die fünften WI-38-Zellen auf einer 60-Millimeter-Kulturschale und induzieren Sie Seneszenz, indem Sie die Zellen mit dem H-Ras-Retrovirus infizieren, wie zuvor beschrieben.Entfernen Sie zum gewünschten Zeitpunkt für die Messung von ROS das Wachstumsmedium und waschen Sie es einmal mit PBS. Trennen Sie die Zellen durch Behandlung mit Trypsin/EDTA-Lösung und bestimmen Sie die Zellzahl. Übertragen Sie eine mal 10 bis die fünften Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Entfernen Sie das Nährmedium vorsichtig und fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes DCF-DA-Färbemedium hinzu. Suspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig wieder und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie sie einmal mit PBS.Resuspendieren Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS und überführen Sie die Proben in ein FACS-Röhrchen. Das DCF-DA-Fluoreszenzsignal kann mit einem Durchflusszytometer gemessen werden, das mit einem blauen Laser mit 488 Nanometern ausgestattet ist. Führen Sie zunächst eine nicht gefärbte Kontrollzellprobe durch.Wählen Sie im Punktdiagramm der Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Seitenstreuung lebende Zellen aus, und entfernen Sie tote Zellen und Zelltrümmer mithilfe eines Gating-Werkzeugs. Passen Sie anschließend im Histogramm, das das DCF-DA-Fluoreszenzsignal anzeigt, die blaue Laserspannung so an, dass der Peak aus den Kontrollzellen am linken Rand platziert wird. Führen Sie nun jede mit DCF-DA gefärbte Probe durch und zeichnen Sie mindestens 10.000 Ereignisse auf.Induzieren Sie Seneszenz, indem Sie die Zellen mit dem H-Ras-Retrovirus infizieren, wie zuvor beschrieben. Waschen Sie die Zellen einen Tag vor der Ernte zweimal mit PBS. Fügen Sie drei Milliliter DMEM ohne FBS hinzu und kultivieren Sie die Zellen einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator.Nach 24 Stunden wird das konditionierte Medium aufgefangen und für den nachfolgenden ELISA bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Trypsinisieren Sie die Zellen und ernten Sie die Zellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation. Bereiten Sie die Gesamt-RNA mit der herkömmlichen RNA-Extraktionsmethode vor und generieren Sie cDNA aus zwei Mikrogramm Gesamt-RNA durch eine reverse Transkriptionsreaktion.Bereiten Sie für die Echtzeit-PCR den SYBR Green PCR Master Mix für alle Reaktionen vor, die die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für IL-6 oder IL-8 enthalten. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für jede Probe vor, die Aktin-Primer als interne Kontrolle enthält. Geben Sie 48 Mikroliter Master Mix und zwei Mikroliter cDNA-Produkte, verdünnt ein bis drei in jede Vertiefung in einer optischen qPCR-Platte mit 96 Vertiefungen.Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausführung durch. Richten Sie das Echtzeit-PCR-Reaktionsprogramm auf dem Thermocycler ein und führen Sie die Echtzeit-PCR durch. Erfassen Sie nach Abschluss des Laufs die Schwellenwerte für den Zyklus oder CT-Werte und berechnen Sie die mRNA-Spiegel von IL-6 oder IL-8 nach der Normalisierung auf die Aktinspiegel.Tauen Sie konditionierte Medien auf, die zuvor aus seneszenten WI-38-Zellen gewonnen wurden. Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 500 g für fünf Minuten entfernen. Das konditionierte Medium wird mit einem Zentrifugalfilter mit einer Porengröße von 3.000 Dalton um das 10-fache konzentriert.Führen Sie den ELISA mit dem entsprechenden IL-6- oder IL-8-ELISA-Kit durch. Beschichten Sie zunächst die ELISA-Platte gut mit verdünntem IL-6- oder IL-8-Antikörper, indem Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie jede Vertiefung viermal gewaschen haben, fügen Sie jeder Vertiefung Blockierungspuffer hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang.Waschen Sie den Teller viermal. Geben Sie entweder seriell verdünnte ELISA-Standards oder konzentrierte konditionierte Mediumproben hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden lang. Nach dem Waschen der Platte werden die Proben mit einem Sekundärantikörper inkubiert und nacheinander mit Streptavidin-HRP konjugiert.Geben Sie 100 Mikroliter TMB-Substratlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Farbentwicklung zu ermöglichen. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Stopplösung. Lesen Sie die Absorption jeder Vertiefung mit einem ELISA-Reader bei 450 Nanometern ab.Plotten Sie die Normkurve für die generierten Normen. Berechnen Sie die Konzentrationen von IL-6 und IL-8 im konditionierten Medium gemäß den Standardkurven. Plotten Sie die Ergebnisse nach der Normalisierung auf die Zellzahl.Die Infektion von WI-38-normalen humanen Fibroblasten mit dem H-Ras-Retrovirus führte zu dramatischen Veränderungen in der zellulären Morphologie. In mehr als 70% der Zellen wurde eine SA-beta-Gal-Färbeaktivität beobachtet, was darauf hindeutet, dass die H-Ras-Expression in WI-38-Zellen innerhalb von sechs Tagen eine zelluläre Seneszenz induziert. Die DCF-DA-Färbeanalyse zeigt, dass die H-Ras-Expression auch einen signifikanten Anstieg der intrazellulären ROS-Spiegel induziert.Der Anstieg der intrazellulären ROS-Spiegel wird bereits zwei Tage nach der H-Ras-Expression beobachtet und hält bis zum sechstägigen Zeitpunkt an. Die real-time PCR-Analyse der repräsentativen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Faktoren IL-6 und IL-8 zeigt, dass die mRNA-Expression von IL-6 und IL-8 in seneszenten WI-38-Zellen bemerkenswert erhöht ist. ELISAs des konditionierten Mediums bestätigten, dass die IL-6- und IL-8-Sekretion auch in H-Ras-induzierten seneszenten Zellen erhöht ist.Die Induktion der zellulären Seneszenz durch Onkogenexpression, DNA-Schäden oder oxidativen Stress dauert in der Regel sechs bis acht Tage. Sobald die Zellen bereit sind, kann die ROS-Messung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach Beherrschung dieser Techniken kann die Analyse der mRNA- und Proteinspiegel von SASP-Faktoren innerhalb eines Tages abgeschlossen werden.Bei der Analyse der ROS-Spiegel und der SASP-Induktion ist es wichtig, die zelluläre Seneszenz durch SA-Beta-Gal-Färbung und ggf. zusätzliche Methoden zu bestätigen. Darüber hinaus ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Anstieg der ROS in der frühen Phase der Seneszenz auftritt, während die Entwicklung von SASP erst nachweisbar ist, nachdem die Seneszenz vollständig etabliert ist. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von zellulären Seneszenzmodellen angewendet werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ROS-Spiegel und SASP-Induktion während der zellulären Seneszenz analysiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz (Video) | JoVE Journal

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