Name: Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Lernen Sie die quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und dem Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in menschlichen Fibroblasten während der H-Ras-induzierten Seneszenz kennen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (2015R1D1A1A01060839) (zu jung Yeon Kim) und durch einen National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss von der Regierung von Korea (MSIT) finanziert (Nein 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (um Jeanho Yun).

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<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
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<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
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<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
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<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
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<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir Methoden für die Überwachung der intrazellulärer ROS Ebenen während H-Ras-induzierte Seneszenz in normalen menschlichen Fibroblasten WI-38 vorgestellt. Intrazellulären ROS in lebenden Zellen gemessen werden quantitativ mit der Zelle durchlässig Reagenz DCF-DA und flow Cytometry. Auf zelluläre Aufnahme ist DCF-DA deacetylated von intrazellulären Esterasen und anschließend oxidiert durch ROS stark fluoreszierende 2', 7'-dichlorofluoresceins (DCF) bilden. DCF-Fluoreszenz kann durch Durchflusszytometrie mit ei...

Mehr als 50 Jahren offenbarte Hayflick und Moorhead, dass normale Zellen irreversibel Wachstum Verhaftung auf die Erschöpfung der proliferativen entfalten nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen1eingeben. Dieses Phänomen ist heute bekannt als replikative Seneszenz und wird geglaubt, um mit organismal Altern2stark korrelieren. Obwohl die fortschreitende Erosion der Telomere als eine der Hauptursachen für replikative Seneszenz gilt, worden verschiedenen zelluläre Belastungen, wie DNA-Schäden, Onkogene Aktivierung und oxidativen Stress, berichtet, eine andere Art der zellulären Seneszenz induzieren "vorzeitige Seneszenz" oder "Stress-induzierte Seneszenz" genannt. Interessanterweise spielt vorzeitige Seneszenz eine potente Tumor-suppressive Rolle bei der Aktivierung der Onkogene wie H-Ras und BRAF. Studien an Mäusen und menschlichen Geweben haben starke Beweise hergestellt, die Biomarker der Zelle Seneszenz überwiegend in prämaligne Läsionen vorhanden waren, wo Onkogenen Ras und BRAF sind aktiviert, aber wurden in bösartigen Tumoren, die von entwickelt vermindert Diese Läsionen3,4,5. Über seine Rolle als Altern und Tumor-Unterdrückung zelluläre Seneszenz in früheren Studien nachweislich eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der Wundheilung, Gewebereparatur immunüberwachung und embryonale Entwicklung6.
Obwohl Wachstum Verhaftung als ein Markenzeichen der zellulären Seneszenz7ausgiebig untersucht wurde, schlägt eine erhebliche Zahl von beweisen, dass die intrazelluläre reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auch einen Beitrag zur zellulären Seneszenz8. Die Höhe des ROS Ebenen während der verschiedenen Arten der zellulären Seneszenz, einschließlich replikative Seneszenz und Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), hieß ursprünglich vor Jahrzehnten9,10. Mehr induziert direkt, exogene Behandlung mit subletale Dosis von H2O2 Seneszenz11,12. Die Hemmung der ROS-Aufräumvorgang Enzyme wie SOD1, verursacht auch vorzeitige Seneszenz13. Im Gegensatz dazu niedrig ambient sauerstoffbedingungen und Erhöhung der ROS Aufräumvorgang verzögert das Auftreten von Seneszenz10,14,15. Diese Ergebnisse zeigen zweifellos, dass ROS wichtige Mediatoren oder Determinanten der zellulären Seneszenz Induktion sind. Jedoch wie ROS beitragen zur Induktion der zellulären Seneszenz und wie erhöhte ROS Niveaus während der zellulären Seneszenz sind weitere machen Sie Untersuchungen nötig.
Neuere Studien haben gezeigt, dass alternde Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch eine SASP16,17. Im Alter von Gewebe fördern seneszenten Zellen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen über viele Wege durch SASP neben einer autonomen Erschöpfung der proliferativen Zellen. Proinflammatorischen Faktoren, wie IL-6, IL-8, TGFβ und Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sezerniert seneszenten Zellen verursachen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen durch Beeinträchtigung der Gewebe Homöostase, Zerstörung der Gewebearchitektur Seneszenz der benachbarten Zellen und sterile Entzündung18,19. Allerdings kann die SASPs je nach biologischen Kontext günstig auswirken. Heterogenetic Artder SASPs hängt darüber hinaus die alternde Zelltyp und Zell-Stadium, betonend, dass weitere Forschung19.
Hier beschreiben wir rasche und sensible zytometrie-basierte Techniken für die Beurteilung der intrazelluläre ROS Ebenen während OIS. Darüber hinaus werden Methoden zur Analyse der SASP Faktoren mit quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) und ELISA eingeführt.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr>, <tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl &beta; D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>wellgen</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Reverse Transkriptase</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master 2x Mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 ELISA-Assay für Menschen</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 ELISA-Assay für Menschen</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m Spritzenfilter</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-System</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>EMax Mikroplatten-Reader</td><td></td></tr></tbody></table>

eine quantitative messung von reaktiven sauerstoffspezies und seneszenz-assoziierten sekretorischen phänotyp in normalen menschlichen fibroblasten während onkogen-induzierte seneszenz

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Zelluläre Seneszenz wurde einen Zustand der irreversiblen Wachstum Festnahme nach Erschöpfung der proliferative Kapazität oder Exposition gegenüber verschiedenen Belastungen berücksichtigt. Jüngste Studien haben die Rolle der zellulären Seneszenz, verschiedene physiologische Prozesse, einschließlich Entwicklung, Wundheilung, immunüberwachung und altersbedingte Gewebe Dysfunktion erweitert. Zwar Zellzyklus Festnahme einer kritischen Markenzeichen der zellulären Seneszenz, wurde eine erhöhte intrazelluläre reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Produktion auch eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz gezeigt. Neue Studien zufolge darüber hinaus seneszenten Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) ausstellen. Die starke gestiegene Interesse bezüglich Therapiestrategien gegen zelluläre Seneszenz betont die Notwendigkeit für ein genaues Verständnis der Seneszenz Mechanismen, einschließlich der intrazellulären ROS und der SASP. Hier beschreiben wir Protokolle für die Beurteilung der quantitativ intrazelluläre ROS Ebenen während H-Ras-induzierte zellulären Seneszenz mit ROS-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und Durchflusszytometrie. Darüber hinaus stellen wir sensible Techniken für die Analyse der Induktion von mRNA Expression und Sekretion von SASP Faktoren. Diese Protokolle können auf verschiedenen zellulären Seneszenz Modelle angewendet werden.

Ein Beispiel für H-Ras-induzierte Seneszenz ist in Abbildung 1dargestellt. Eine Infektion des normalen menschlichen Fibroblasten WI-38 mit der H-RasV12-Retroviren induzierte dramatische morphologische Veränderungen (Abb. 1 b). Darüber hinaus wurde wie in Abbildung 1dargestellt, SA β-gal-Färbung-Aktivität bemerkenswert auf H-RasV12 Ausdruck erhöht. Mehr als 70 % der Zellen zeigte SA β-gal-Färbung Akti...

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, empfindliche Techniken zur Überwachung der intrazellulären ROS-Spiegel und des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) während der zellulären Seneszenz bereitzustellen. Hier zeigen wir, dass diese Methoden erfolgreich den Anstieg der intrazellulären ROS-Spiegel und der SASP-Faktoren IL-6 und IL-8 während der H-Ras-induzierten Seneszenz in WI-38 normalen humanen Fibroblasten aufzeigen. Diese Techniken ermöglichen die Überwachung von Veränderungen der intrazellulären ROS-Spiegel während der zellulären Seneszenz und die Analyse der Expression von SASP-Faktoren.Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie auf viele verschiedene zelluläre Seneszenzmodelle angewendet werden können. Daher kann uns diese Methode letztendlich helfen, die Rolle von ROS und SASP bei der zellulären Seneszenz zu verstehen und die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen zu untersuchen. Das Verfahren wird von Young Yeon Kim und Jee-Hyun Um aus meinem Labor vorgeführt.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das H-Ras-Retrovirus vorbereiten. Zuerst werden ökotrope BOSC-Zellen in einer Poly-L-Lysin-beschichteten Kulturschale ausgesät und ei

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Assay zur Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen mit dualen Seneszenzmarkern. Der Nachweis und die Quantifizierung seneszenter Zellen erfolgt unter Verwendung eines β-Galactosidase-Substrats. Das Substrat wird durch aktive lysosomale β-Galactosidase innerhalb der seneszenten Zellen gespalten, wodurch ein fluoreszierendes Produkt entsteht, das in Verbindung mit autofluoreszierenden Lipofuszin-Granulaten die...

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll bietet eine reflektierte-licht-konfokale Mikroskopie zur objektiven, einzelzelligen Detektion der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität in der stromalen Gefäßfraktion, die aus menschlichem Fettgewebe isoliert ist. Die Methode ist mit der Immunzytochemie kompatibel, beinhaltet pH-Kontrollen zur quantitativen Beurteilung und bietet zudem eine sensiblere und weniger subjektive Alternative zur herkömmlichen SA-β-gal-Färbung.

Seneszenzdetektion mit reflektiertem Licht in der fettreichen stromalen Gefäßfraktion

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Diese Methode untersucht, wie seneszente Hautfibroblasten gesunde Fibroblasten beeinflussen. Die Seneszenz wird durch UVB-Exposition induziert, und das konditionierte Medium wird auf normale Fibroblasten angewendet. Sie hilft dabei, bioaktive Verbindungen zu bewerten, die auf veränderte Zell-zu-Zell-Kommunikation bei der Hautalterung abzielen.

Neue Kombination von Antioxidantien zur Wiederherstellung gesunder interzellulärer Kommunikation in einem in-vitro-Modell unter Verwendung eines konditionierten Mediums aus alter Zellen

Lernen Sie die quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und dem Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in menschlichen Fibroblasten während der H-Ras-induzierten Seneszenz kennen.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz (Video) | JoVE Journal

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

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