Häufige Schwanzspitze Blutabnahme bei Mäusen zur Beurteilung der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion

Das übergeordnete Ziel der häufigen Blutentnahme an der Schwanzspitze besteht darin, Vollblutproben für die Messung der pulsierenden luteinisierenden Hormonsekretion, die als LH bezeichnet wird, bei wachen, nicht anästhesierten und sich normal verhaltenden Mäusen zu erhalten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der reproduktiven Neuroendochrinologie zu beantworten, indem sie ein zuverlässiges Protokoll zur Beurteilung der pulsierenden Sekretion des luteinisierenden Hormons bei Mäusen liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass häufige Handhabung und Gewöhnung eine robuste und zuverlässige Pulsmessung des luteinisierenden Hormons nach akuten oder chronischen experimentellen Behandlungen gewährleisten.

Behandeln Sie die Mäuse fünf Wochen lang täglich von Montag bis Freitag. In den letzten zwei Wochen fassen Sie die Mäuse auch am Samstag und Sonntag an. Führen Sie die Handhabung der Maus in einer Biosicherheitswerkbank durch.

Nehmen Sie die erste Maus aus dem Käfig und platzieren Sie sie auf einer geeigneten Unterlage im Schrank. Halten Sie die Maus vorsichtig auf dieser Oberfläche fest, indem Sie die Basis ihres Schwanzes festhalten. Streichen Sie dann mit der anderen Hand fest über die Bauchfläche des Schwanzes von der Basis bis zur Spitze.

Tun Sie dies insgesamt sechs Mal und setzen Sie die Maus dann wieder in ihren Käfig ein. Dies stellt ein Handhabungsset dar. Warten Sie nun sechs Minuten und führen Sie einen weiteren Handhabungssatz durch.

Wenn Sie dieses Muster mit Intervallen zwischen den Sätzen fortsetzen, führen Sie vier Handhabungssätze pro Handhabungssitzung durch. Insgesamt ergeben dies vierundzwanzig Schwanzschläge pro Sitzung. Wenn experimentelle Behandlungen während des Probenahmezeitraums zusätzliche Handhabungsmethoden wie Scrubing oder eine intraperitoneale Injektion umfassen, dann akklimatisieren Sie die Mäuse auch an solche Handhabungsaktivitäten während der Handhabungssitzungen.

Zwei Wochen vor dem geplanten Tag der Blutentnahme sollten die Mäuse paarweise untergebracht werden, um ihre Beeinträchtigungen während des Probenahmezeitraums so gering wie möglich zu halten. Für die Blutentnahme bereiten Sie 0,6 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen für die Blutlagerung vor. Beschriften Sie die Röhrchen und aliquotieren Sie für drei Mikroliter Blutentnahmen siebenundfünfzig Mikroliter ACES-Puffer in jedes Röhrchen.

Lagern Sie die Röhrchen nach der Zubereitung bei vier Grad Celsius. In der Biosicherheitswerkbank halten Sie folgende Gegenstände bereit: Pipettenspitzen, einen Abfallbehälter, einen Timer, ein Versuchsprotokoll, einen Eiskübel mit den Blutentnahmeröhrchen, eine scharfe, sterile Schere, einen Permanentmarker und eine kleine Gaze. Fünfundvierzig Minuten vor Beginn der Blutentnahme nehmen Sie die erste Maus aus ihrem Käfig und legen Sie sie auf eine geeignete Oberfläche.

Markieren Sie dann den Schwanz, um diese Maus schnell von ihrem Käfigpartner zu unterscheiden. Entferne nun mit einer Schere ein bis zwei Millimeter der Schwanzspitze. Nachdem du den Schwanz abgeschnitten hast, streichle vorsichtig über den Schwanz, bis sich an der Spitze ein Blutstropfen bildet.

Sammeln Sie dann drei Mikroliter Blut und werfen Sie sowohl das Blut als auch die Spitze in den Mülleimer. Stellen Sie anschließend sicher, dass der Blutfluss gestoppt wurde. Bei Bedarf sanften Druck mit steriler Gaze ausüben.

Setze die Maus dann für sechs Minuten in ihren Käfig zurück. Streichen Sie nun in Sechs-Minuten-Intervallen über fünfundvierzig Minuten fest über den Schwanz, um der Maus zusätzliche Blutproben zu entnehmen. Wenn sich kein Blutstropfen bildet, tupfen Sie den Schwanz mit einem in Kochsalzlösung getränkten Mullkissen ab, um das Blutgerinnsel zu entfernen.

Während der Zeit vor der Probenahme sind alle Blutaliquoten zu verwerfen. Nach fünfundvierzig Minuten beginnen Sie mit der Probenahme. Bei der Probenentnahme werden drei Mikroliter Blut in ein Sammelröhrchen überführt, das Röhrchen durch Inversion gemischt und wieder auf Eis gelegt.

Fahren Sie nun so lange wie nötig mit der Probenahme fort. Sobald Sie fertig sind, euthanasieren Sie die Mäuse entweder ein oder stellen Sie sicher, dass ihr Schwanzblutfluss vollständig gestoppt wurde, und stellen Sie den Mäusen dann einen sauberen Käfig zur Verfügung. Übergeben Sie anschließend Blutproben in eine Aufbewahrungsbox und lagern Sie die Proben bei minus zwanzig Grad Celsius, bis sie analysiert werden können.

Das luteinisierende Hormon oder LH wurde in häufigen Blutproben gemessen, um die Reaktion auf eine akute psychosoziale Stressbelastung zu bestimmen. Erwachsene weibliche C57-schwarze sechs Mäuse wurden ovariektomiert und Blutproben wurden neunzig Minuten lang entnommen, um eine Ausgangsbasis für die pulsierende LH-Sekretion vor der Behandlung zu ermitteln. Für die Stressbehandlung während der neunzigminütigen Probenahme wurden die Versuchstiere in Nagetierfixierungsvorrichtungen gesteckt und in einen neuen Käfig gebracht, während die Kontrolltiere in ihren Heimkäfigen blieben und nicht angeschnallt wurden.

Die Analyse zeigte, dass die Kontrolltiere während des gesamten Probenahmezeitraums klare, eindeutige LH-Impulse aufwiesen. Im Gegensatz dazu unterdrückte der psychosoziale Stress der Fixierung in der Versuchsgruppe schnell und eindeutig die pulsierende LH-Sekretion. Bei der Vorbereitung auf diese Technik ist es wichtig, daran zu denken, Umweltstörungen wie Lärm oder Unterbrechungen durch andere Untersucher, die die Mäuse belasten und die pulsierende LH-Sekretion unterbrechen könnten, zu minimieren.

Seit ihrer Entwicklung durch Dr. Stein und andere im Chen-Labor hat diese Technik begonnen, Forschern auf dem Gebiet der Neuroendokrinologie den Weg zu ebnen, um die LH-Pulsregulation in einer Spezies zu erforschen, in der komplexe molekulare und genetische Werkzeuge praktisch und verfügbar sind.