Name: Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Zellmechanik in vivo mit wulstfreien optischen Pinzetten in Drosophila-Embryonen untersuchen. Diese Methode ermöglicht minimale Invasivität und Echtzeitbildgebung zur Messung von Gewebespannung.

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Diese Arbeit wurde durch eine FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale De La Recherche ANR-Blanc Grant Morfor ANR-11-BSV5-0008 (zur P.-f.l.) unterstützt. Wir erkennen Frankreich BioImaging Infrastruktur unterstützt durch die französische National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investitionen in die Zukunft»). Wir danken Brice Detailleur und Claude Moretti aus der PICSL-FBI-Infrastruktur für technische Hilfe.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Optische Pinzetten ermöglichen absolute mechanische Messungen direkt in der embryonalen Entwicklung Epithel in eine nicht-invasive Weise durchführen. In diesem Sinne bietet es Vorteile gegenüber anderen Methoden wie Laser-Ablation, die invasive und liefern relative Messungen, magnetische Kräfte, die Injektionen erfordern, oder zwingen Folgerung, die auf starke Annahmen beruht und auch relative Messungen.
Das Protokoll enthält ein paar wichtige Schritte. Erstens, da das Objektiv zeigen könnten,...

Embryonalentwicklung ist ein hoch reproduzierbarer Prozess, bei dem die Zellen und Gewebe verformen um das zukünftige Tier zu gestalten. Solche Verformungen haben gezeigt, dass erfordern die aktive Generation der Kräfte an der Zelle Level1,2. Um morphogenetischen Prozesse zu verstehen, während die Zellen und Gewebe ihre Form zu verändern, ist es daher Schlüssel für die mechanischen Eigenschaften der beteiligten Zellen beurteilen und messen die Kräfte innerhalb des Gewebes während der Prozess3,4 . Epitheliale Schichten, vor allem in Drosophila, wurden weitgehend durch ihre quasi-2D-Geometrie und ihre einfache Handhabung untersucht.
Eine Reihe von Techniken wurden so von uns und anderen epithelialen Mechanik in Vivo während der Entwicklung zu bewerten. Wir geben einen schnellen Überblick über die drei wichtigsten Techniken in epithelialen Geweben verwendet. Laser-Ablation, eine weit verbreitete Methode erlaubt es, die lokale mechanische Beanspruchung in der Zelle Kreuzungen5,6,7,8 oder im größeren Maßstab9,10,11 zeigen durch die Durchführung lokaler Kürzungen, die die mechanische Integrität des Ziels zu stören. Die Dynamik der Öffnung nach dem Schnitt informiert der Stress vor Ablation, sowohl auf die Rheologie der Gewebe12,13. Ein Nachteil der Laser-Ablation ist, dass es invasiv, wie es die lokale Störung des Kortex Zelle erfordert. Daher kann man nur eine begrenzte Anzahl von Ablationen durchführen, will man Gewebe Integrität zu bewahren. Ein weiterer Nachteil ist, dass Ablationen nur relative Schätzungen der Spannung am Zellkontakte, da die Öffnung Geschwindigkeit viskose Reibung abhängig ist, die nicht allgemein bekannt ist. Magnetische Manipulation hat auch entwickelt und in Drosophila, an denen entweder die Verwendung von Ferrofluide14 oder ultramagnetic Liposomen15verwendet. Sie bieten absoluten Messungen16,17, sondern sind auch in dem Sinne, dass sie die Injektion von Sonden an der gewünschten Stelle erfordern invasiv. Dies kann je nach System, sehr schwierig sein die nicht immer präzise Injektionen zugänglich ist. Ein drittes Verfahren, völlig nicht-invasiv, ist Kraft Inferenz18,19,20. Kraft Ableitung beruht auf der Annahme des mechanischen Gleichgewichts auf dreifache Punkte (Tricellular Kreuzungen oder Scheitelpunkte) und ermöglicht es, Spannungen überhaupt ableiten, Zell-Zell Kontakte (und gegebenenfalls Druck in allen Zellen) durch ein inverses Problem zu lösen. Für Spannungen bietet jeder Vertex zwei Gleichungen (X und Y). Daraus ergibt sich ein großes System von linearen Gleichungen, die unter bestimmten Bedingungen zur Spannung bei allen Zellkontakte Bewertung invertiert werden kann. Während diese Methode sehr attraktiv, da es nur eine segmentierte Bild und keine zusätzliche Experiment oder Setup erfordert, seine Genauigkeit ist noch zu bestimmen, und wieder es bietet nur relative Werte, wenn eine absolute Kalibrierung-Messung durchgeführt wird.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir in diesem Artikel eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt an ein leichtes Blatt Mikroskop, kontrollierten Kräfte auf der Ebene der Zelle in der embryonalen Epithel von Drosophila Melanogasteranzuwenden. Optische Pinzette wurden für zahlreiche Anwendungen in der Biologie auch die Messungen auf einzelne Proteine und Manipulation von Organellen und Zellen21verwendet. Wir berichten hier angewendeten Kräfte im Bereich von ein paar Dutzend pN, die kleine ist noch ausreichend, um lokale Verformungen der Zellkontakte zu induzieren und mechanische Messungen in Vivodurchzuführen. In der Regel verwenden wir senkrecht Auslenkung des Zellkontakte, überwacht durch die Analyse der Kymographs, um Kraft auf Verformung zu beziehen. Wichtig ist, erfordert unser Setup nicht die Injektion von Perlen an der gewünschten Stelle im Gewebe, wie optische Pinzette Kräfte auf Zell-Zell-Kontakte direkt ausüben kann. Die Kopplung der optischen Pinzette zu einem leichten Bogen Mikroskop ermöglicht eine schnelle Bildgebung (mehrere Bilder pro Sekunde), was sehr spürbare für eine mechanische Analyse auf kurzen Zeitskalen und mit reduzierten Phototoxizität, da die Beleuchtung von der Probe ist auf der Ebene von imaging-22beschränkt.
Insgesamt, optische Pinzette sind eine nicht-invasive Weise kontrollierten Kräfte bei der in-vivo in Drosophila Embryos Zellkontakte anwenden und mechanische Informationsextraktion wie Steifigkeit und Spannung bei Zelle Kontakte23, rheologischen Eigenschaften 24, und Farbverlauf oder Anisotropie der Spannung23.

<table><tbody><tr><td>Ytterbium Faserlaser LP, 10 W, CW</td><td>IPG Laser</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>inkl. Kollimator LP: Strahl D = 1,6 mm und roter Leitlaser</td></tr> <tr><td>& Oslash; 1/2" Optischer Strahlverschluss</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometersysteme mit kleinem Strahldurchmesser</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>1 für X-Verschiebung, 1 für Y-Verschiebung</td></tr><tr><td>1D- oder 2D-Galvo-System Lineare Stromversorgung</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>Galvanometer Stromversorgung</td></tr><tr><td>2 Linsen f = 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>Relaisteleskop zwischen 2 Galva</td></tr><tr><td>Linse f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5X Teleskop</td></tr><tr><td>Objektiv f = 500 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5X Teleskop</td></tr><tr><td>Rechtwinklige kinematische elliptische Spiegelhalterung mit Gewinde Käfigstangenlöcher</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td><td>Periskop</td></tr><tr><td>Laserschutzbrille, hellgrüne Gläser, 59% Durchlässigkeit für sichtbares Licht, Universal Style</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; AOI, 50,0 mm Durchmesser, Heißer Spiegel</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonen-Emitter HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>CompactDAQ-Chassis</td><td>National Instruments</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>C-Serie Spannungsausgangsmodul</td><td>National Instruments</td><td>NI-9263</td><td>Analogausgangsmodul</td></tr><tr><td>C-Serie Spannungseingangsmodul</td><td>National Instruments</td><td>NI-9215</td><td>Analoges Eingangsmodul</td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylat-modifizierte Mikrosphären, 0,5 & Mikro; m, rot fluoreszierend (580/605), 2 % Feststoffe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td><td>Kalibrierperlen</td></tr><tr><td>C++ (Qt) hausgemachte optische Pinzettensoftware</td><td></td><td></td>, <td>entwickelt von Olivier Blanc und Claire Chard&egrave;s. Alternative Lösung: labview</td></tr></tbody></table>

prüfende zelle mechanik mit wulst-freie optische pinzetten in drosophila embryos

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenese erfordert Koordination zwischen genetischen Musterung und mechanische Kräfte, die Zellen und Gewebe robust zu gestalten. Daher ist eine Herausforderung, morphogenetischen Prozesse verstehen zellulären Kräfte und mechanische Eigenschaften in Vivo in der Embryogenese direkt zu messen. Hier präsentieren wir eine Einrichtung der optischen Pinzette gekoppelt an ein leichtes Blatt-Mikroskop, wodurch Kräfte direkt auf Zell-Zell-Kontakte des frühen Embryos von Drosophila anzuwenden, während der Bildgebung mit einer Geschwindigkeit von mehreren Bildern pro Sekunde. Diese Technik hat den Vorteil, den es nicht erfordert, dass die Injektion von Perlen in den Embryo, normalerweise verwendet als Zwischenprodukt Sonden auf die optischen Kräfte ausgeübt werden. Wir ausführlich Schritt für Schritt die Umsetzung des Setups und Werkzeuge, um mechanische Informationsextraktion aus den Experimenten vorschlagen. Durch die Überwachung der Verschiebungen von Zell-Zell-Kontakten in Echtzeit, kann eine Spannung Messungen durchführen und Zellkontakte Rheologie untersuchen.

Abbildung 5 zeigt experimentelle Daten, die von imposanten eine sinusförmige Bewegung in die Falle. Die Falle erzeugt eine Auslenkung der Schnittstelle, wie durch die 3 Schnappschüsse zeigen 3 aufeinander folgende Schnittstelle Positionen (Abb. 5A)23veranschaulicht. Aufgenommene Filme sind ein Glomeruli (Abb. 5 b) erzeugt und werden weiter analysiert, um festzustellen, dass di...

Wir präsentieren Ihnen eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt mit einem leichten Bogen Mikroskop und deren Umsetzung, Zelle Mechanik ohne Perlen in Drosophila Embryos zu erforschen.

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Gewebemechanik zu beantworten, wie die Eigenschaften von Zellkontakten sich in Raum und Zeit während der Gewebemorphogenese verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schwach invasiv ist und mit Live-Bildgebung wie der Lichtbogenmikroskopie kompatibel ist. Diese Technik erfordert keine Injektion von Perlen in das Gewebe.Normalerweise als Demiere-Sonden verwendet, auf denen Froses zu bekommen, bin ich aufgeregt. Demonstriert wird der Prozess von Chardes, einem Ingenieur, und Raphael Clement, Forscher aus meinem Gelände. Zunächst richten Sie ein aufrechtes Mikroskop für die Lichtbogenmikroskopie in der horizontalen Ebene ein, und bereiten Sie dann den Laser und die Optik so vor, dass sie als optische Pinzette fungieren.Als nächstes einen Mikroliter 500 Nanometer Fluoreszenzperlen in eine Glasküvette geben und 10 Milliliter destilliertes Wasser hinzufügen. Legen Sie die Küvette in den Küvettenhalter unter das Ziel, und passen Sie den Fokus des Objektivs so an, dass das Ziel die Wasseroberfläche berührt. Öffnen Sie nun die integrierte Entwicklungsumgebung QT Creator, die verwendet wird, um die Erfassungssoftware zu steuern

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Forschung

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Entwicklungsbiologie

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Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

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Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie ein verbesserter Test für mechanische Nociception in Drosophila Larven durchzuführen. Wir verwenden den Test hier, um zu zeigen, dass mechanische Überempfindlichkeit (Allodynie und Hyperalgesie) in Drosophila Larven existiert.

Ein verbesserter Assay und Werkzeuge zur Messung der mechanischen Nociception in Drosophila Larven

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Diese Protokolle beschreiben, wie die Organisation und Okklusionsfunktion plissierter Septatenübergänge in Kontroll- und mutanten-embryonalem Epithel von Drosophila charakterisiert werden kann.

Immunfärbungs- und Farbstoffpenetrationsexperimente zur Definition von Kern-Plezier-Septaten-Übergangsproteinen in Drosophila-embryonalen Epitheln

Erfahren Sie, wie Sie Zellmechanik in vivo mit wulstfreien optischen Pinzetten in Drosophila-Embryonen untersuchen. Diese Methode ermöglicht minimale Invasivität und Echtzeitbildgebung zur Messung von Gewebespannung.

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

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