Name: Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Strukturanalyse von Membranproteinen mit Small-Angle Neutron Scattering (SANS) und Deuterium-Markierung. Diese Methode minimiert Detergens-Störungen und ermöglicht die Bestimmung von Größe, Form und Oligomerisierungszustand in Lösung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Das Büro von biologischen und Umweltforschung unterstützt Forschung im ORNL Center für strukturelle Molekularbiologie (CSMB) und Bio-SANS mit Einrichtungen, unterstützt durch die wissenschaftlichen Nutzer Einrichtungen Division, Office Basic Energiewissenschaften, US Department der Energie. Strukturarbeiten am Membranproteine im Labor Lieberman wurde von NIH (DK091357, GM095638) unterstützt und NSF (0845445).

Die Autoren Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss und Ryan C. Oliver sind vertraglich durch UT-Battelle mit uns DOE zur Unterstützung der Neutron Science Anwenderprogramm und Bio-SANS Instrument am Oak Ridge National Laboratory in diesem Artikel verwendet.
Diese Handschrift ist von UT-Battelle, LLC, unter Vertrag DE-AC05-00OR22725 mit der uns Department of Energy (DOE) Co-Autor gewesen. Behält sich die US-Regierung und der Verlag durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung, räumt ein, dass die US-Regierung eine nicht-ausschließliches, eingezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz behält zu veröffentlichen oder das veröffentlichte Formular dieser Handschrift zu reproduzieren oder zu ermöglichen andere zu tun, für die US-Regierung Zwecke. DOE bieten den Zugang der Öffentlichkeit zu diesen Ergebnissen der vom Bund geförderte Forschung im Einklang mit dem DOE den Zugang der Öffentlichkeit zu planen. 82

Strukturbiologie Forscher nutzen Sie ergänzende strukturelle Techniken wie Lösung Streuung, Biochemische und strukturelle Details (z. B. Größe und Form) von Biomolekülen in Lösung zu erhalten. SANS ist eine besonders attraktive Technik zur Bestimmung geringer Auflösung Strukturen von Membranproteinen, ein Schwerpunkt der modernen Strukturbiologie und Biochemie. SANS erfordert Mengen der gereinigten Proteine vergleichbar mit denen von kristallographischen Studien (1 mg/Probe). Die vor kurzem wachsende kommerzielle Verfügb...

Membranproteine sind um schätzungsweise 30 % aller Gene1 codiert und repräsentieren eine deutliche Mehrheit der Ziele für die modernen Arzneimitteln. 2 diese Proteine führen eine Vielzahl von lebenswichtigen Zellfunktionen,3 aber trotz ihrer Fülle und ihrer Bedeutung – nur etwa 1 % der gesamten Strukturen hinterlegt in der Forschung Collaboratory für strukturelle Bioinformatik (RCSB) Protein darstellen Daten Bank. 4 aufgrund ihrer teilweise hydrophoben Natur, Strukturaufklärung von Proteinen, Membrane-springen überaus schwierig wurde. 5 , 6 , 7
Wie viele biophysikalische Techniken Monodisperse Partikel in Lösung für die Messung erforderlich, wurde Membranproteine von native Membranen zu isolieren und stabilisiert diese Proteine in eine lösliche Mimik der native Membranen ein aktives Gebiet der Forschung in den letzten Jahren Jahrzehnten. 8 , 9 , 10 diese Untersuchungen zur Entwicklung der vielen neuartigen AMPHIPHILE Baugruppen führten zu solubilisieren Membranproteine, wie Nanodiscs,11,12,13 Bicelles14,15 und Amphipols. 16 , 17 bleibt jedoch die Verwendung von Reinigungsmittel Micellen einer der am weitesten verbreitete und einfache Ansätze für die Erfüllung der Anforderungen der Löslichkeit eines gegebenen Proteins. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 leider gibt es kein einziges Reinigungsmittel oder magische Mischung von Reinigungsmitteln derzeit, die alle Membranproteine gerecht wird; Diese Bedingungen müssen daher empirisch für die individuellen Anforderungen jedes Protein kontrolliert werden. 26 , 27
Reinigungsmittel selbst-zusammenbauen in Lösung über ihre kritischen Micelle Konzentration zu aggregieren Strukturen Mizellen genannt. Mizellen bestehen aus vielen Waschmittel Monomere (in der Regel im Bereich von 20-200) mit hydrophoben Alkyl-Ketten bilden eine Micelle Kern- und hydrophilen Kopfgruppen angeordnet in einem Micelle Shell Layer mit Blick auf das wässrige Lösungsmittel. Das Verhalten von Waschmitteln und Micelle Bildung wurde von Charles Tanford in Der hydrophobe Effekt,28 und Größen klassisch beschrieben und Formen von Micellen aus häufig verwendeten Reinigungsmittel in Membran-Protein-Studien wurden mit kleinen Winkel Streuung charakterisiert. 29 , 30 Waschmittel Organisation über Membranproteine wurde ebenfalls untersucht, und die Bildung von Protein-Reinigungsmittel-komplexen (PDCs) dürfte mit Waschmittel Moleküle, die rund um das Protein in einer Anordnung, die das ordentliche Waschmittel ähnelt Mizellen. 31
Eine hinzugefügte Vorteil bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist, dass die resultierenden Micelle Eigenschaften bearbeitet werden können, durch die Integration von anderen Waschmitteln. Viele Waschmittel weisen ideale mischen, und wählen Sie Eigenschaften von gemischten Micellen können sogar vorhergesagt werden, von den Komponenten und Verhältnis zu mischen. 22 jedoch kann das Vorhandensein von Waschmittel noch für biophysikalische Charakterisierungen Herausforderungen beitragen, das gesamte Signal. Signal von Waschmittel in der PDC ist beispielsweise mit Röntgen- und Lichtstreuung Techniken, praktisch nicht von Protein. 32 Untersuchungen mit einzelnen Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) verlassen in der Regel auf eingeschlossene Partikel (gefroren); strukturelle Details des Proteins sind noch verdeckt durch bestimmte Reinigungsmittel oder eine hohe Konzentration des Reinigungsmittels, der Hintergrund verleiht. 33 alternative Ansätze zur Interpretation der vollen PDC-Struktur (inklusive Waschmittel) durch Berechnungsmethoden wurden unternommen, die darauf abzielen, das Waschmittel um einen bestimmten Membranprotein zu rekonstruieren. 34
Für den Fall der Neutronenstreuung produziert die Kern-Schale-Anordnung der Reinigungsmittel in der Micelle einen Formfaktor die beobachtete Streuung beiträgt. Glücklicherweise können Lösungskomponenten geändert werden, so dass sie nicht zu den net beobachtete Streuung beitragen. Dabei "Kontrast passend" erfolgt durch Substitution von Deuterium für Wasserstoff, eine Streuung Länge Dichte zu erreichen, die den Hintergrund (Puffer) übereinstimmt. Eine vernünftige Auswahl an Reinigungsmittel (mit verfügbaren deuterierte Gegenstücke) und ihr Verhältnis zu mischen müssen berücksichtigt werden. Für Waschmittel Micellen kann diese Substitution mit einem Waschmittel mit der gleichen Kopf Gruppe aber eine deuterierte Alkyl Kette (d-Tail statt h-Tail) durchgeführt werden. Da das Waschmittel gut gemischt sind,35 ihrer Aggregate haben eine Streuung Länge Dichte, die Mole-Fraktion gewichtete Durchschnitt der beiden Komponenten (h-Schwänzen und d-Tails). Wenn diese durchschnittliche Kontrast mit derjenigen der Kopfgruppe konsistent ist, können einheitlichen aggregierten Strukturen voll abgestimmt werden, um alle Beiträge zu beobachtete Streuung zu entfernen.
Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um das Neutron Kontrast von Waschmittel Micellen zu manipulieren, durch den Einbau von chemisch identisch Waschmittel Moleküle mit Deuterium-Label Alkyl-Ketten. 19 , 36 , 37 das komplette Simultankontrast Anpassung der Micelle Kern und Schale, die eine einzigartige Fähigkeit der Neutronenstreuung ist erlaubt. 35 , 38 mit dieser deutlich verfeinert Detailebene, passender Kontrast aktivieren kann sonst nicht machbar Studien von Membran-Protein-Strukturen. Darüber hinaus könnte dieser Kontrast-matching-Ansatz auf andere Systeme mit Waschmittel wie Polymer Austausch Reaktionen39 und Öl-Wasser-Dispergiermittel,40 oder sogar andere solubilizing Mittel, wie Bicelles,41 ausgeweitet werden Nanodiscs,42 oder Block-Copolymere. 43 A ähnlicher Ansatz wie in dieser Handschrift, aber mit einer einzigen Waschmittel Spezies mit teilweise Deuterium Substitutionen auf die Alkylgruppe Kette und/oder Kopf wurde vor kurzem veröffentlicht. 37 während dies erwartet werden kann, um die zufällige Verteilung von Wasserstoff und Deuterium in das Waschmittel zu verbessern im Vergleich zu der hier vorgestellte Ansatz der begrenzten Anzahl der verfügbaren Positionen auf das Waschmittel für Substitution und in zwei Schritten Waschmittel Synthese benötigt zusätzliche Herausforderungen für die Prüfung.
Schritte 1 und 2 des Protokolls unten oft überschneiden sich da erstes Experiment Planung erfolgen muss, um eine Qualität Vorschlag zu unterbreiten. Antragstellung gilt jedoch hier als der erste Schritt zu betonen, dass dieser Prozess im Vorfeld ein Neutron-Experiment gestartet werden soll. Anzumerken ist, dass ein erforderlicher Schritt, der durch den Vorschlag nachgewiesen werden sollte, ist, biochemischen und physikalischen Charakterisierung (einschließlich Reinheit und Stabilität) der Probe die Notwendigkeit Neutron Untersuchungen zu unterstützen. Eine allgemeine Diskussion über kleine Winkel Neutronen-Streuung (SANS) sprengt den Rahmen dieses Artikels. Eine kurze, aber gründliche Einführung gibt es in der Referenzarbeit, die Charakterisierung der Materialien von Kaufmann,44 und eine umfassende Lehrbuch konzentrierte sich auf biologische kleine Winkel Lösung Streuung vor kurzem veröffentlicht worden. 45 weitere Buchempfehlungen ist im Abschnitt Diskussion gegeben. Kleine Winkel Streuung verwendet die so genannten Streuung Vektor Q als zentrale Menge, die die Streuung Prozess beschreibt. Dieser Artikel verwendet die allgemein akzeptierte Definition Q = 4π Sünde (θ) / λ, wo θ halbe Winkel zwischen eingehenden und verstreuten Strahl und λ ist ist die Wellenlänge der Neutronenstrahlung in Angström. Andere Definitionen existieren, verwenden Sie verschiedene wie z. Symbole b. die "für die Streuung Vektor, und dass durch einen Faktor 2π oder mithilfe von Nanometern anstelle von Angstrom abweichen kann (siehe auch Diskussion der Abbildung 10).

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra MWCO 50KDa Konzentrator&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>Ammoniumcitrat zweibasig</td><td>Fisher Scientific</td><td>A663</td><td></td></tr><tr><td>Mittelkomponente Ammoniumsulfat</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Bioflo 310 Bioreaktor System</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02025</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>EMD Millipore</td><td>3130</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Kobalt(II)-chlorid</td><td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Kupfer (II)-sulfat</td><td>Acros</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>mittelkomponentiger</td></tr><tr><td>Drierit-Gasreiniger</td><td>W.A. Hammond Drierite Co., Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Dinatrium, Dihydrat</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>Ausrüstung</td></tr> <tr><td>& Auml; kta Luftreiniger UPC100</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR Säule</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17116701</tr><tr><td>Imidazol</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-chloridhexahydrat</td><td>MP Biochemikalien</td><td>ICN19404590</td><td>mittlere Komponente</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Mangan(II)-sulfat-Monohydrat</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Inkubations-/Kühlschüttler</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-d25-&beta;-D-Maltopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>RC 6 Plus Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>SIGMAFAST Proteasehemmer Cocktail Tabletten, EDTA-freies</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Steriler 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 μm; m PES-Membran</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>Steriler Einweg-Flaschenaufsatzfilter mit 0,2 & Mikro; m PES-Membran</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517501</tr><tr><td>Superose-12 10/300 GL Spalte&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517301</tr><tr><td>Ultrospec 10 Zelldichtemessgerät</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Zinksulfat-Monohydrat</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>mittlere Komponente</td></tr></tbody></table>

kontrast-passende reinigungsmittel im small-angle neutron streuexperimente für membrane protein strukturelle analyse und modellierung von ab initio

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Das biologische Small-Angle Neutron Streuung Instrument in der High-Flux-Isotope Reaktor des Oak Ridge National Laboratory ist widmet sich der Erforschung der biologischen Materialien, Biokraftstoff, die Verarbeitung und Bioinspirierte Materialien für Nanometer Mikrometer Längenskalen. Für die Untersuchung der physikalischer Eigenschaften (z.B. Größe und Form) von Membranproteinen hier vorgestellten Methoden (hier, MmIAP, eine Intramembrane Aspartyl-Protease aus Methanoculleus Marisnigri) in Lösungen von Micelle bildenden Reinigungsmittel sind gut geeignet für dieses kleine Winkel Neutronen-Streuung Instrument, unter anderem. Ndere biophysikalische Charakterisierung sind durch ihre Unfähigkeit, die Waschmittel Beiträge in einer komplexen Struktur von Protein-Reinigungsmittel Adresse behindert. Darüber hinaus bietet Zugriff auf die Bio-Deuterierung Labor einzigartige Fähigkeiten für die Vorbereitung der großflächige Anbau und Deuterium-markierten Proteine für verbesserte streusignal aus dem Protein zum Ausdruck zu bringen. Während diese Technik bietet keine strukturelle Details in hoher Auflösung, die strukturelle Wissenslücke für Membranproteine enthält viele adressierbare Bereiche der Forschung ohne in der Nähe von atomarer Auflösung. Beispielsweise enthalten diese Bereiche Bestimmung der Oligomere Staaten, Komplexbildung, Konformationsänderungen bei Störung und Faltung/Entfaltung Ereignisse. Diese Untersuchungen können leicht durch Anwendungen dieser Methode erreicht werden.

Ein Strahl Zeit und Instrument Vorschlag sollte eindeutig vermitteln alle Informationen benötigt, um die Review Committee, dass eine gültige vorgeschlagene Experiment beurteilt werden können. Kommunikation mit einem NSS ist für unerfahrene Anwender dringend empfohlen. Die NSS kann erste Machbarkeit und Führer Antragstellung, Machbarkeit, Sicherheit und das Potenzial für hohe Schlagzähigkeit Wissenschaft betonen beurteilen. Die Angaben in dem Vorschlag gehören Hintergrundinformationen und ...

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über integrale Membranproteine wie den oligomeren Zustand, ihre Größe, Gesamtform und niedrige Auflösung Struktur in Lösung zu beantworten. Lösungsstudien von Membranproteinen erfordern stabilisierende Moleküle wie Waschmittel. Diese Technik hat den Vorteil, dass sie Waschmittel unsichtbar macht und das Signal des Membranproteins hervorhebt.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf viele biologische und medizinische Forschungsfragen, da über 1/3 der Proteine in Membranen liegen, wo sie viele lebenswichtige zelluläre Funktionen ausführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Deuterium-Etikettierungs- und Neutronenstreuungsschritte schwer zu erlernen sind, da nur sehr wenige Institutionen Schulungen in diesen Techniken anbieten. Bestimmen Sie zunächst Neutronenstreuungslängendichten oder SLDs mithilfe der Webanwendung MULCh, Modulen zur Analyse von Kontrastvariationsdaten.Öffnen Sie das Kontrastmodul, indem Sie im linken Navigationsbereich auf Kontrast klicken. Geben Sie Text für einen Projekttitel an, und geben Sie die folgenden Details für zwei Komponenten als Untereinheit eins und U

contrast-matching-detergent-small-angle-neutron-scattering

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion, wenn sie an Membranoberflächen gebunden sind. Die Bindung von extrinsischen Proteinen an Nanodisc-Membranen kann indirekt durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass das charakteristische Stapeln (Rouleau) von Nanodiscs, das durch die Negativfärbung Natriumphosphotungat induziert wird, durch die Bindung von extrinsischem Protein verhindert wird.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Diese Methode beschreibt die Klonen, Ausdruck und Reinigung von rekombinanten Nsa1 zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie und kleine Winkel Röntgenstreuung (SAXS) und gilt für die Hybrid-Strukturanalyse von anderen Proteinen mit beiden bestellt und Domänen ungeordnet.

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Wir beschreiben ein Protokoll für die Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine mit Bindung des Sortier-Rezeptors, Sortilin, um die erste luminalen Schleife von der Glukose-Transporter-Protein, GLUT4, als Beispiel.

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Hier zeigen wir, wie kleine Winkel x-ray Scattering (SAXS) genutzt werden können, um Informationen auf niedriger Auflösung Umschläge repräsentieren die makromolekularen Strukturen zu erhalten. Bei Verwendung in Verbindung mit hochauflösenden strukturelle Techniken wie Röntgen-Kristallographie und magnetischen Kernresonanz bieten SAXS detaillierte Einblicke in multidomain Proteine und makromolekulare komplexe in Lösung.

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von zwei Modellproteinen, die eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielen. Die Technik kombiniert die biophysikalische Charakterisierung auf dem Labortisch mit der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie, um auf die Dynamik auf Zeit- und Längenskalen zuzugreifen, die für Proteininterdomänenbewegungen relevant sind.

Untersuchung der Proteindynamik mittels Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie

Dieser Artikel beschreibt die Protokolle für die Probenvorbereitung, Datenreduktion und Datenanalyse in Neutronenspinechostudien (NSE) von Lipidmembranen. Eine umsichtige Deuteriummarkierung von Lipiden ermöglicht den Zugang zu unterschiedlichen Membrandynamiken auf mesoskopischen Längen- und Zeitskalen, über die lebenswichtige biologische Prozesse ablaufen.

Neutronenspin-Echospektroskopie als einzigartige Sonde für Lipidmembrandynamik und Membran-Protein-Wechselwirkungen

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Diese Studie beschreibt das Verfahren zur Rekonstituierung des Membranproteins TWIK-bezogenen säuresensitiven K+ -Kanal 2 (Task2) in Nanodiscs. Die erfolgreiche Assemblierung wurde durch eine Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie bestätigt, die gut definierte zweidimensionale Klassendurchschnitte lieferte.

Eine Technik zur Stabilisierung von Membranproteinen in Nanodiscs

Erfahren Sie die Strukturanalyse von Membranproteinen mit Small-Angle Neutron Scattering (SANS) und Deuterium-Markierung. Diese Methode minimiert Detergens-Störungen und ermöglicht die Bestimmung von Größe, Form und Oligomerisierungszustand in Lösung.

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio (Video) | JoVE Journal

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Weitere Videos entdecken