Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der antimikrobiellen Peptide zu beantworten, ob Peptide an der Zellmembran lokalisieren oder translokalisiert werden. Die Verwendung von Sphäroplasten und Protoplasten ermöglicht die Visualisierung und Analyse der Peptidlokalisierung in einem physiologisch relevanten Modellsystem ohne die Auflösungsprobleme, die bei der bakteriellen Zellbildgebung auftreten. Obwohl diese Methode Einblicke in antimikrobielle Peptide geben kann, kann sie auch auf andere membranaktive Wirkstoffe wie zellpenetrierende Peptide angewendet werden.

Gramnegative E.coli-Sphäroplasten und grampositive B.megaterium-Protoplasten sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube unter Verwendung einer geeigneten sterilen Technik hergestellt werden. Auf Wunsch können Bakterienstämme ein antibiotikaresistentes Plasmid enthalten, und Sphäroplasten und Protoplasten können an einem offenen Labortisch hergestellt werden. In diesem Video werden Sphäroplasten und Protoplasten auf einem offenen Labortisch mit antibiotikaresistenten Bakterienstämmen hergestellt.

Um eine Übernachtkultur einzurichten, verwenden Sie eine sterile Mikropipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie von einer festen Agarkulturplatte in ein 14-Milliliter-Kulturröhrchen zu übertragen, das zwei bis drei Milliliter dreiprozentige Tryptikase-Sojabrühe, TSB, für eine 16- bis 21-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schütteln enthält. Um gramnegative E.coli-Sphäroplasten herzustellen, verdünnen Sie die Übernachtkultur im Verhältnis eins zu 100 und 25 Milliliter TSB in einem 250-Milliliter-Kolben und bringen Sie die Bakterien für weitere 2,5 Stunden in den Schüttinkubator zurück. Wenn die Lösung eine optische Dichte von 0,5 bis 0,8 bei 600 Nanometern erreicht hat, wird die Kultur in einem Verhältnis von eins zu zehn in frischem TSB in einem neuen 250-Milliliter-Kolben für eine zweite 2,5-stündige Inkubation mit einer wirksamen Endkonzentration von 60 Mikrogramm pro Milliliter Cephalexin verdünnt.

Zur Herstellung von einzelligen Filamenten von etwa 50 bis 150 Mikrometern Länge, wie sie unter einem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung sichtbar gemacht werden. Zentrifugieren Sie die bakterielle Lösung, um die Filamente zu ernten, und dekantieren Sie den Überstand. Waschen Sie die Filamente unter vorsichtiger Zugabe von einem Milliliter 0,8 molaren Saccharose und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Nach einer Minute wird der Überstand verworfen, ohne das Pellet zu stören, und die angegebenen Reagenzien in der entsprechenden Reihenfolge zu den Filamenten gegeben. Nach zehn Minuten bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von einer Minute nach und nach einen Milliliter Lösung A hinzufügen, dabei die Lösung vorsichtig von Hand schwenken. Inkubieren Sie die Lösung vier Minuten lang bei Raumtemperatur, dann teilen Sie die Filamentsuspension in zwei gleiche Aliquote zwischen zwei konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf, die sieben Milliliter der Lösung B enthalten.

Verwenden Sie eine p1000-Mikropipette, um die Pellets vorsichtig wieder zu suspendieren. Überprüfen Sie ein kleines Aliquot der Probe lichtmikroskopisch auf Sphäroplastenbildung. Die Sphäroplasten können dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden oder bis sie drei Frost-Tau-Zyklen durchlaufen haben.

Zur Herstellung von grampositiven B.megaterium-Protoplasten verdünnen Sie die Bakterienkultur über Nacht im Verhältnis eins zu 1000 in 100 Millilitern mit drei Prozent TSB in einem 250-Milliliter-Kolben für eine 4,5-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Wenn die Flüssigkultur eine optische Dichte von 0,9 bis 1,0 bei 600 Nanometern erreicht, werden die Bakterien für ihre Zentrifugation auf zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen aufgeteilt und die Überstände mit einer assyriologischen Pipette aufgegessen. Die Pellets werden in 2,5 Millilitern Protoplastenmedium pro Röhrchen wieder suspendiert und die Suspension in ein einzelnes konisches Röhrchen zur Kultivierung in einem 125-Milliliter-Kolben gezogen.

Geben Sie einen Milliliter mit fünf Milligramm Lysozym pro Milliliter Lysozym für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius unter Schütteln in die Kultur. Überwachen Sie das Wachstum des Protoplasten unter dem Lichtmikroskop und notieren Sie Unregelmäßigkeiten, wie z. B. Bakterien, die als geschwollene Stäbchen anstelle von Kugeln erscheinen. Am Ende der Inkubation wird die Suspension zur Zentrifugation in ein konisches 15-Liter-Röhrchen überführt und das Pellet in fünf Millilitern Protoplastenmedium erneut suspendiert.

Die Protoplasten können dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden oder bis sie drei Frost-Tau-Zyklen durchlaufen haben. Zur Visualisierung des Sphäroplasten oder Protoplasten werden fünf Mikroliter der interessierenden Suspension auf einen mit Poly L Lysin beschichteten Objektträger übertragen, gefolgt von zwei Mikrolitern fitc mit 100 bis 200 mikromolaren antimikrobiellen Peptiden oder AMP. Nach einer dreiminütigen Inkubation vor Licht geschützt geben Sie einen Mikroliter eines geeigneten Membranstempels in die Probe für eine weitere dreiminütige Inkubation im Dunkeln.

Decken Sie am Ende der Inkubation den beschrifteten Sphäroplast oder Protoplast mit einem Glasdeckglas ab und versiegeln Sie den Deckglas mit dem Nagellack. Um die Zellen abzubilden, schalten Sie das konfokale Mikroskop und den entsprechenden Laser ein, wählen Sie das 63-fache Objektiv aus und verwenden Sie dann die entsprechende Bildgebungssoftware, um acht Bit 512 x 512 zusammengesetzte Z-Stapelbilder zu erhalten, die aus 0,5-Mikrometer-Schichten der Gesamtheit jeder Bakterienzelle von Interesse bestehen. Um die Lokalisierung des fluoreszenzmarkierten AMP zu visualisieren, öffnen Sie die Komposit-Z-Stapelbilder in einem geeigneten Bildgebungsanalyseprogramm und lokalisieren Sie die mittlere Schicht des ersten interessierenden Sphäroplasten oder Protoplasten.

Platzieren Sie einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 0,3 Mikrometern auf der Membran, einen in der Mitte der Zelle und einen von der Zelle entfernt, um die Hintergrundfluoreszenz zu messen, wobei darauf zu achten ist, gesättigte Pixel zu vermeiden. Die mittlere Fluoreszenzintensität in jedem interessierenden Bereich kann dann von der Software berechnet werden. Die Auflösungsgrenzen herkömmlicher Lichtmikroskope machen es schwierig zu unterscheiden, ob fluoreszenzmarkierte Peptidsignale bei normalen Bakterien von der Membran oder dem intrazellulären Raum stammen.

Wenn die Signale auf der Membran lokalisiert sind, scheint es so, als ob sie sich mit dem intrazellulären Raum überlappen. Im Gegensatz dazu führt die vergrößerte Größe des Sphäroplasten und Protoplasten im Vergleich zu normalen Bakterien zu einer deutlichen Auflösung zwischen dem Membranmarker und dem intrazellulären Raum. Dies erleichtert die Unterscheidung der Peptidlokalisierung.

Zum Beispiel kann die Lokalisation an der Membran und die Translokation durch die Zellmembran von fluoreszenzmarkiertem Peptid sowohl in E.coli spheroplast als auch in B.megaterium protoplast durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden, wie gerade gezeigt. Die Platzierung von interessierenden Bereichen auf der Membran und dem intrazellulären Raum des Sphäroplasten oder Protoplasten und im Hintergrund ermöglicht die Berechnung des Verhältnisses der intrazellulären Peptidfluoreszenzintensität zur Peptidfluoreszenzintensität auf der Membran jedes Sphäroplasten oder Protoplasten, der mit AMP interagiert. Zum Beispiel kann diese Methode verwendet werden, um die Wechselwirkungen einer aus Histon abgeleiteten mikrobiellen Peptidmutante mit E.coli spheroplast und B.megaterium Protoplasten sichtbar zu machen.

In diesem Experiment zeigte das AMP ein ähnliches Lokalisationsmuster in beiden Bakterienstämmen. Dies unterstreicht die reduzierte Translokation relativ zum Wildtyp-Peptid. Letztendlich ermöglicht diese Technik den Forschern, Peptidlokalisierungsmuster auf Einzelzellebene zu untersuchen.

Bietet Einblicke in den Wirkmechanismus eines Peptids von Interesse. Abgesehen davon, dass die Forscher eine größere Anzahl von Bildern für die systematische Charakterisierung von Peptidmechanismen sammeln können, sind Bilder von größeren Sphäroplasten und Protoplasten für die quantitative Analyse leichter zu handhaben als die von kleineren Bakterienzellen.