Chemischen Rückfall von herkömmlichen menschlichen pluripotenten Stammzellen in eine naiv-artigen Zustand mit verbesserten Multilineage Differenzierung Potenz

Die LIF-3i-Methode wandelt konventionelle humane pluripotente Stammzellen in einen primitiveren pluripotenten Zustand mit biochemischen, transkriptionellen und epigenetischen Merkmalen des humanen prä-implantativen Epiblasten um. Diese Methode verbessert die Funktionalität konventioneller humaner pluripotenter Stammzellen durch Verringerung der linienvorbelasteten Genexpression und Tilgung der Interline-Variabilität der gerichteten Differenzierung, die häufig bei unabhängigen hPSC-Linien beobachtet wird. Mit dieser Methode behalten chemisch umgewandelte humane pluripotente Stammzellen nach wiederholtem Passage die karyotypische und epigenomische Stabilität bei, einschließlich an imprintierten Loci, und können direkt mit verbesserter Effizienz differenziert werden, ohne dass ein erneuter Priming-Schritt erforderlich ist.

Die LIF-3i-Methode wird neue Wege der Erforschung der frühen menschlichen Entwicklungsbiologie eröffnen und kann die regenerative Medizin durch Verbesserung der Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen, der Gentargetierung und der Erzeugung von Interspezies-Chimären voranbringen. Um das Protokoll zu beginnen, halten und erweitern Sie konventionelle humane pluripotente Stammzellen oder hPSCs mit validierten normalen Karyotypen in Kokulturen mit einem Mausembryonale Fibroblasten oder MEF-basierten Feeder-Kultursystem oder in einem feederfreien Kultursystem. Bereiten Sie MEF-Feeder in einer zuvor vorbereiteten gelatinisierten Sechs-Well-Platte mindestens einen Tag vor dem Passieren der LIF-5i-adaptierten konventionellen hPSC-Kulturen vor.

Nachdem die konventionellen hPSC-Kulturen etwa 50 % Konfluenz erreicht haben, ersetzen Sie das Standard-hESC-Kulturmedium durch zwei Milliliter pro Welle Leukemia Inhibitory Factor 5i oder LIF-5i-Medium. Kultivieren und halten Sie die konventionellen hPSCs und MEFs bis zu zwei Tage lang in LIF-5i in einem CO2-Inkubator. Wechseln Sie das LIF-5i-Medium täglich, um sie für ihren nachfolgenden Übergang und die stabile Umkehrung in LIF-3i anzupassen.

Für die feederfreien konventionellen Kulturen kultivieren Sie hPSC nur über Nacht in LIF-5i, bevor Sie am nächsten Morgen passen. Vor dem Passieren waschen Sie die LIF-5i-adaptierten konventionellen hPSCs einmal mit PBS und fügen Sie einem Milliliter Zelldissoziationsreagenz zu jeder Welle hinzu. Inkubieren Sie die Platte anschließend fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator.

Nach der Inkubation triturieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pipette in eine Einzelzellsuspension zurück. Sammeln Sie die Zellsuspension in dem hESC-Medium in mindestens einer zweifachen Verdünnung in einem sterilen, 15-Milliliter-Kegelrohr und triturieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für fünf Minuten.

Nach dem Zentrifugieren aspirieren und entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in ein bis zwei Millilitern LIF-5i-Medium. Zählen Sie dann die Zellen. Waschen Sie die vorbeschichtete Sechs-Well-MEF-Platte zweimal mit zwei Millilitern PBS pro Welle.

Verteilen Sie ein bis zwei Mal 10 zum Sechsten in zwei Millilitern LIF-5i-Medium in einer Welle der PBS-gewaschenen MEF-Platte. Platzieren Sie die Platte in einem CO2-Inkubator. Am nächsten Tag schwirlt die Platte vorsichtig, um alle nicht angehefteten Zellen zu heben, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter LIF-5i-Medium.

Wiederholen Sie diesen Schritt täglich für drei bis fünf Tage oder bis die Zellen zu 60 bis 70 % konfluent sind. Dieses Protokoll unterstützt eine schnelle und massive naiv-ähnliche Umkehrung eines großen Bereichs menschlicher embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzelllinien, solange humane pluripotente Stammzellpräparationen mit ausgeprägter Differenzierung oder abnormalen Karyotypen sorgfältig ausgeschlossen werden. Nach der anfänglichen LIF-5i-Adaption passieren Sie die nachfolgenden stabilen LIF-3i-Kulturen alle drei bis vier Tage in einem Biosicherheitsschrank oder wenn die Kulturen zu 60 bis 70 % konfluent sind.

Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie jedes Loch der LIF-5i-LIF-3i-Kulturen, indem Sie vorsichtig zwei Milliliter PBS hinzufügen. Entsorgen Sie das PBS und fügen Sie ein Milliliter Zellablösungslösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator.

Nach der Inkubation sammeln Sie die Zellsuspension, fügen Sie unbehandeltes hESC-Medium in einer zweifachen Verdünnung hinzu und triturieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie die Suspension in ein steriles 15-Milliliter-Kegelrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für fünf Minuten und aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet in LIF-3i-Medium und zählen Sie die Zellen. Beschichten Sie als Nächstes zweimal 10 zum Fünften pro Welle auf die bestrahlten MEF in der gelatinisierten Sechs-Well-Platte für die routinemäßige Passage von LIF-3i-Kulturen. Für die anfänglichen LIF-5i-adaptierten Kulturen platzieren Sie vor dem ersten Übergang in LIF-3i MEF eine anfänglich höhere Dichte.

Individuelle humane pluripotente Stammzelllinien sollten optimiert und auf hohe anfängliche Bepflanzungsdichten eingestellt werden, wenn erforderlich, um kontinuierliches Massenpassieren während der frühen Passagen der LIF-3i-Umkehrkultur aufrechtzuerhalten. Beschichten und verteilen Sie die LIF-5i-adaptierten hPSCs auf frischen, PBS-gewaschenen, bestrahlten MEF-Feeder-Platten im LIF-3i-Medium. Ersetzen Sie das LIF-3i-Medium täglich.

Passieren Sie N-hPSC für mindestens vier bis sieben kontinuierliche Massenpassagen im LIF-3i-Medium, bevor N-hPSC in funktionellen Studien oder Kryokonservierung verwendet wird. Notieren Sie die Anzahl der Passagen von N-hPSC in herkömmlichen oder LIF-3i-Medien. Immunfluoreszente Färbungen und Western-Blot erkennen die Expression der aktivierten phosphorylierten und Gesamtisoformen von STAT3 und Erk1/2, wichtige Marker für molekulare Pluripotenz.

Hämatoxylin- und Eosinfärbungen von Teratomen-Mikroschnitten zeigten eine robuste Differenzierung in alle drei Keimblätter mit gut strukturierten Ektoderm-, Mesoderm- und Endoderm-Linien. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis davon haben, wie man konventionelle humane pluripotente Stammzellen effizient in großen Mengen in einen naiv-ähnlichen Zustand umkehrt, indem die sequentielle universelle LIF-5i-zu-LIF-3i-Chemiemethode verwendet wird. Bevor Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, mit einer niedrigen Passage von konventionellen humanen pluripotenten Stammzelllinien zu beginnen, die normale Karyotypen aufweisen.

Konventionelle humane pluripotente Stammzellkulturen sollten vor dem Beginn überwiegend undifferenziert sein und nur wenige spontan differenzierte Zellen enthalten. Der anfängliche, kurze LIF-5i-Adaptationsschritt verbessert signifikant die klonale Expansion konventioneller humaner pluripotenter Stammzellen und ermöglicht es ihnen, anschließend mit LIF-3i allein in großen Mengen naiv umgewandelt zu werden, wodurch die Notwendigkeit, seltene naive humane pluripotente Stammzellkolonien später zu picken oder subzuklonen, entfällt. Die weitere Optimierung dieser Tankyrase-Inhibitor-verwendenden Chemiemethode in definierten feederfreien GMP-konformen Kulturbedingungen wird die effiziente, klinisch nützliche Erzeugung eines breiten Spektrums funktioneller und transplantierbarer Zelltypen für therapeutische Zwecke erleichtern.