Nasale Potentialdifferenz, Trans-epithelialen Ionentransport bei Mäusen zu quantifizieren

Die nasale Potentialdifferenz ist eine wertvolle Methode, um den Phänotyp transgener Mäuse zu charakterisieren, die Mukoviszidose modellieren. Es ermöglicht die Untersuchung der Wirksamkeit neuartiger Therapien bei Mukoviszidose. Die Hauptvorteile der Technik bestehen darin, dass sie zuverlässige Messungen an kontinuierlich brütenden Mäusen ermöglicht.

Es reduziert die damit verbundene Mortalität und ermöglicht die Wiederholung des Tests am selben Tier. Um den doppellumigen Nasenkatheter vorzubereiten, halten Sie die Mitte eines 20 Zentimeter langen Polyethylenschlauchs etwa 10 bis 15 Sekunden in der Flamme, bis er weich genug zum Ziehen ist. Ziehen Sie dann die beiden Enden auseinander, um ein sehr dünnes Kapillarrohr von etwa 15 Zentimetern Länge und einem Außendurchmesser von 0,1 Millimetern für die Nasensonde zu erhalten.

Reinigen und entfetten Sie anschließend die beiden Kapillaren mit reinem Ethanol. Verbinden Sie sie mit Klebeband und kleben Sie sie mit Cyanacrylatkleber zusammen. Schneiden Sie die überschüssige Länge der Sonden mit einer Rasierklinge ab, um den etwa acht Zentimeter langen Doppellumenkatheter zu erhalten.

Injizieren Sie dann Wasser durch beide Lumen, um zu überprüfen, ob sie durchlässig sind, und markieren Sie sie in einem Abstand von fünf Millimetern von der Spitze. Bereiten Sie anschließend eine Crememischung vor, indem Sie die Elektrolytcreme und die gesättigte dreimolare Kaliumlösung im Verhältnis eins zu eins mischen, um die Bildung winziger Luftblasen zu vermeiden. Um eine Unterkühlung während und nach dem Versuch zu vermeiden, verwenden Sie für den Versuchsaufbau zwei Heizkissen, eines für den Messaufbau und das andere für die Box, in die das Tier am Ende des Tests zur Erholung gelegt wird.

Schalten Sie den Computer ein, der mit dem Datenspeicher verbunden ist, mit hoher Eingangsimpedanz und hochauflösendem Voltmeter. Öffnen Sie dann die Software für die Datenerfassung. Verbinden Sie die Elektroden mit dem Voltmeter.

Tauchen Sie die Spitze der Elektroden zusammen in die Sahnemischung. Überprüfen Sie den anfänglichen Elektroden-Offset-Wert und lehnen Sie die Elektroden ab, wenn der Wert größer als plus oder minus zwei Millivolt ist. Schalten Sie dann die Schlauchpumpe ein und führen Sie den Pumpschlauch in das perfundierte Lumen des Nasenkatheters ein.

Füllen Sie ein Lumen des Nasenkatheters mit einer Elektrolytcrememischung durch eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze. Passen Sie den Katheter an einen Silikonschlauchanschluss an und füllen Sie den Anschluss mit der Crememischung. Stecken Sie anschließend die positive Elektrode in den Stecker.

Überprüfen Sie den Offset-Wert der Messelektrodenbrücke und verwerfen Sie die Brücken, wenn der Wert größer als plus oder minus zwei Millivolt ist. Verbinden Sie anschließend den proximalen Auslass des Pumprohrs mit dem Fläschchen mit der ausgewählten Lösung für die Nasenperfusion. Verbinden Sie dann den distalen Ausgang des Pumprohrs mit dem Perfusionslumen des Nasenkatheters.

Füllen Sie anschließend das zweite Lumen des Nasenkatheters mit frischer Lösung A1. Tauchen Sie die Spitze des Nasenkatheters in die Durchstechflasche mit Lösung A.Kehren Sie die Richtung der Peristaltikpumpe um, um die Länge des Nasenkatheters entsprechend 10 Sekunden Perfusion zu füllen. Falten Sie anschließend ein Blatt absorbierendes Gewebe zu einem drei Zentimeter breiten Kissen, das als Stütze für den Mauskopf verwendet wird. Decken Sie das Heizkissen mit der Folie aus absorbierendem Gewebe ab.

Lege dann die Maus auf den Rücken auf das Heizkissen und klebe die Gliedmaßen und den Schwanz an das Pad. Führen Sie anschließend den intravenösen Referenzkatheter in den subkutanen Raum einer hinteren Extremität ein. Entfernen Sie die Nadel und adaptieren Sie sie in den Silikonschlauchverbinder.

Füllen Sie den Katheter und den Konnektor mit einer Crememischung. Verbinden Sie dann die positive Messelektrode mit dem Nasenkatheter und die negative Referenzelektrode mit dem Katheter, der in den Unterhautraum in der Hintergliedmaße des Tieres eingeführt wird. Befestigen Sie dann den Katheter und die Elektrode nach Bedarf mit Klebeband, um eine Verschiebung zu verhindern.

Überprüfen Sie nach dem Platzieren der Referenzelektrode und der Brücken erneut den Offset-Wert der Messelektrodenbrücke, indem Sie die Spitze des Nasenkatheters in die Elektrodencrememischung im Anschluss des IV-Katheters tauchen. Notieren Sie sich den stabilen, endgültigen Offset-Wert. Fixieren Sie nun die Mauseohren mit Klebeband auf dem Heizkissen in einem freien Raum zwischen den beiden Stücke des absorbierenden Gewebes.

Fixieren Sie die Lebendigkeit, ohne die Augen zu berühren. Um Flüssigkeit aus der Mundhöhle aufzunehmen, bewegen Sie die Zunge zur Seite und führen Sie einen spitzen Docht aus Filterpapier etwa einen Zentimeter in den Mund ein. Um Flüssigkeit aufzusaugen, die aus dem durchbluteten Nasenloch austritt, legen Sie ein zweites Stück Filterpapier auf den Toi der Nase.

Überprüfen Sie den positiven Kontrollwert des Epithelpotentials, indem Sie die Nasenkatheterspitze in die Innenseite des Mundes einführen. Halten Sie ihn mit einer feinen Pinzette und bei guter direkter Beleuchtung fest und führen Sie den Nasenkatheter vorsichtig in ein Nasenloch ein, bis zu vier bis sechs Millimeter von der Nasenspitze entfernt. Fünf Minuten nach der Injektion der Narkosemittel kippen Sie das Heizkissen vorsichtig um etwa 30 Grad mit dem Kopf des Tieres nach unten.

Überwachen Sie den maximalen basalen PD-Wert. Wenn es über 30 Sekunden stabil ist, beginnen Sie mit der Perfusion der Nasenschleimhaut bei 10 Mikrolitern pro Minute mit den vier gepufferten Lösungen nacheinander. Perfundieren Sie die erste Lösung 10 Sekunden lang und jede folgende Lösung fünf Minuten lang oder bis eine stabile Spannung erreicht ist.

Beenden Sie die Perfusion von Forskolin, wenn die transiente Reaktion von Forskolin abnimmt. Lassen Sie die Maus nach der Bewertung vom Heizkissen lösen. Verabreichen Sie es mit der Anästhesie-Antagonistenmischung und geben Sie es bis zur vollständigen Genesung in die Aufwachbox mit Heizkissen.

Hier sind die repräsentativen nasalen PD-Spuren einer homozygoten, normalen Maus und einer homozygoten Maus für die F508-Deletions-CFTR-Mutation, zusammen mit den Einzelwerten, die für die nasalen PD-Parameter erhalten wurden. Die Amiloridreaktion ist die Differenz zwischen den Werten der nasalen PD am Ende und zu Beginn der Perfusion der Nasenschleimhaut mit einer amiloridhaltigen basalen gepufferten Salzlösung. Die chloridfreie Reaktion ist die Differenz zwischen den Werten der nasalen PD am Ende und zu Beginn der Perfusion der Nasenschleimhaut mit chloridfreier gepufferter Salzlösung plus Amilorid.

Die Forskolin-Reaktion ist die Differenz zwischen den Werten der nasalen Parkinson-Krankheit am Ende und zu Beginn der Perfusion der Nasenschleimhaut mit chloridfreier gepufferter Salzlösung plus Forskolin und Amilorid. Die Gesamtchloridreaktion ist die Summe der letzten beiden Parameter, die bei Null-Chloridperfusion erhalten werden. Das Projekt kann genutzt werden, um die Transportdefektoren in der Maus, aber auch in der Göre, im Großen und im Frettchen-Mukoviszidose-Modell zu erforschen, bereitzustellen.

Und Natriumtransportdefekte im Eunuchen-Mausmodell. Alle Transporter können unter Verwendung des Protokolls untersucht werden. Die Arbeit in der Nasenhöhle von Nagetieren ist äußerst heikel, da die sensorischen Eingaben aus der nasalen Gesichtsregion wesentlich sind.

Der adäquate Tod der Anästhesie ist bei Operationen in der Nasenhöhle der Maus besonders schwierig.