Name: Nasale Potentialdifferenz, Trans-epithelialen Ionentransport bei Mäusen zu quantifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Messung des nasalen Potentialunterschieds bei Mäusen zur Quantifizierung des trans-epithelialen Ionentransports. Diese Methode ermöglicht die Bewertung neuer Therapien für Mukoviszidose.

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Die Autoren danken Prof. J. Lebacq kritisch bearbeitet das Manuskript. CFTR-tm1Eur (homozygoten F508del-CFTR (FVB/129) Mäuse wurden entwickelt durch die Erasmus MC, Rotterdam, Niederlande, mit Unterstützung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft Europäische Koordination Aktion für Forschung in der Mukoviszidose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Die Untersuchungen und Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des UCL (2017/UCL/MD/015) und im Einvernehmen mit der Gesetze der Europäischen Union für Tierversuche in der Forschung (CEE n ° 86/609) genehmigt. Die Ermittler sind für die Tierversuche, die nach der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere geeignet.
(1) vor dem test Bewertung und das Management
<ol><li>Bereiten Sie die doppelte Lumen nasale Katheter. Hinweis: Ein nasale Katheter erfolgt als eine doppelte Lumen Kapillarrohr, ein Lumen für die kontinuierliche Perfusion von Lösungen, und das andere als eine Mess-Kanal.<ol>
<li>Erwärmen der Mittelteil aus einem Stück, ca. 20 cm lang, Polyethylenschlauch (2,0 mm Innendurchmesser; 3,0 mm Außendurchmesser; Abbildung 1 ein) in der Flamme eines Gasbrenners, bis es weich genug zum ziehen (10-15 s) ist.</li>
		<li>Ziehen Sie die zwei Enden auseinander, um einen sehr dünnen Kapillarrohr von entsprechender Länge (~ 15 cm) und Außendurchmesser (~0.1 mm) für die nasale Sonde (Abbildung 1b) zu erhalten.</li>
		<li>Reinigen Sie und Entfetten Sie zwei solche Kapillaren mit reinem Ethanol, begleiten Sie sie mit Klebeband (Abbildung 1c) und kleben Sie sie zusammen mit Cyanacrylat-Klebstoff.</li>
		<li>Schneiden Sie die überschüssige Länge der Sonden mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell, eine optimale Länge der Doppel-Lumen Katheter von ca. 8 cm (Abbildung 1-d) zu erhalten.</li>
		<li>Spritzen Sie Wasser durch beide Lumen um sicherzustellen, dass sie durchlässig sind.</li>
		<li>Anwenden einer Markus in einem Abstand von 5 mm von der Spitze. Hinweis: Die Sonde ist bis zur Markierung in das Nasenloch eingelassen, so dass alle Messungen an der gleichen Stelle innerhalb der Nasenhöhle gemacht werden.</li>
		<li>Die Doppel-Lumen Katheter in eine trockene Box aufbewahren. Hinweis: Es kann gebrauchte 6 - 10 Mal, wenn unmittelbar nach der Prüfung entsprechend gereinigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Creme mischen.<ol>
<li>Mischen Sie vorsichtig Elektrolyt Creme und gesättigten 3 M KCl-Lösung im Verhältnis 1:1 (Volumen/Volumen), Bildung von Luftbläschen zu vermeiden. Hinweis: Die Creme Mischung dient der Elektrode für die Mess- und die Ag/AgCl Elektroden, Brücken zu schlagen wie in Abbildung 1dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> Abbildung 1 : Sonden mit Elektroden und Brücken. Die Abbildung veranschaulicht die Polyethylenschlauch vor (a) und nach Erhitzen und ziehen (b), das Band Beitritt der Kapillare zweiteilig (c) von der Doppel-Lumen Katheter (d), Silikon-Rohrverbinder (e) und der Elektroden (f). Für Bildschärfe sind die Anschlüsse nicht mit Creme Mischung gefüllt worden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Lösung-Label</td>
			<td>Lösungsbeschreibung</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>Basalen gepufferte Salzlösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>Chlorid-freie gepufferte Salzlösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M Amilorid Stammlösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>Forskolin-Stammlösung 10-3 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Lager-Lösung für den nasalen PD-Test an Mäusen.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Salz</td>
			<td>mM</td>
			<td>Molekulargewicht</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumchlorid (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.889</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calciumchlorid Dihydrat (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesium-Chlorid-Hexahydrat (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium Phosphat (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174,2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium Phosphat (KH2PO4)</td>
			<td>0,4</td>
			<td>136,1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Zusammensetzung der basalen gepufferte Salzlösung (Stammlösung).
<ol start="3"><li>Bereiten Sie die Lösungen.<ol>
<li>Bereiten Sie die vier Lager Lösungen für experimentelles Protokoll (Tabelle 1).<ol>
<li>Bereiten Sie die basalen gepufferte Lösung (Stammlösung A; Tabelle 2) und frei von Chlorid gepufferten Lösung (Stammlösung B; Tabelle 3) durch das Mischen der Salze in reinem Wasser bei Raumtemperatur. Stellen Sie pH auf 7,4 (Bereich 7,0-7,6) mit 1 N NaOH, um pH-Wert, 1 N HCl zu niedrigeren pH-Wert zu erhöhen. Überprüfen Sie die Osmolarität der Lösung (275 mOsm/L).</li>
			<li>Speichern Sie in beschrifteten Glasflaschen bei 4 ° C für bis zu 3 Monaten oder gefroren in Kunststoff-Flaschen für bis zu 6 Monaten.</li>
			<li>Bereiten Sie die 10-2 M Amilorid Lösung (Stammlösung C) durch das Hinzufügen von 26,6 mg Amilorid Hydrochlorid 10 ml reines Wasser. Erhitzen Sie die Mischung für 5 bis 10 Minuten bei 70 ° C. Wie Amilorid lichtempfindlich ist, aufzubewahren Sie Lösung C ist in einem dunklen Behälter. Beschriften Sie die Behälter und bei 4 ° C bis zu 3 Monate lagern.</li>
			<li>Bereiten Sie die 10-3 M Forskolin Lösung (Stammlösung D) indem Sie 10 mg von Forskolin 24,36 mL reines Wasser hinzufügen. Beschriften Sie 0,1 mL Aliquots der Vorratslösung von Forskolin und bei-20 ° C bis zu 6 Monate zu speichern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie frische Lösungen A1, B1 und B2 (Tabelle 4).<ol>
<li>Bereiten Sie frische Lösung A1 (basale gepufferte Salzlösung plus 10-4 M Amilorid) 10 mL der basalen Salzlösung (Stammlösung) und 0,1 mL 10-2 M Amilorid Lösung (Stammlösung C) hinzufügen. Beschriften Sie die Behälter und innerhalb von 24 Stunden nach der Zubereitung zu verwenden.</li>
		<li>Bereiten Sie frische Lösung B1 (Chlorid gepufferte Lösung plus 10-4 M Amilorid) 10 mL Chlorid-freie gepufferte Salzlösung (Stammlösung B) und 0,1 mL 10-2 M Amilorid Lösung (Stammlösung C) hinzufügen. Beschriften Sie die Behälter und innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung verwenden.</li>
		<li>Bereiten Sie frische Lösung B2 (Chlorid-freie gepufferte Salzlösung plus 10-4 M Amilorid und 10-5 M Forskolin) 10 mL Chlorid-freie gepufferte Salzlösung (Stammlösung B) und Hinzufügen von 0,1 mL 10-2 M Amilorid Lösung (Lager C) und 0,1 mL 10-3 M Forskolin Lösung (Stammlösung D). Beschriften Sie die Behälter und innerhalb von 2 Stunden der Vorbereitung verwenden.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Salz</td>
			<td>mM</td>
			<td>Molekulargewicht</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium Gluconat (Mononatrium-Salz)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29.444</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalzium-Glukonat (wasserfreie Pulver)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0,947</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumsulfat Heptahydrat (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246,5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium Phosphat (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174,2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium Phosphat (KH2PO4)</td>
			<td>0,4</td>
			<td>136,1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Zusammensetzung des Chlorid-freie gepufferte Lösung (Stammlösung B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> Abbildung 2 : Position der Maus während der Durchblutung der Nasenschleimhaut. Die Abbildung zeigt das Akku-Heizkissen (a), das Voltmeter (b), die Bezugselektrode eingefügt in den subkutanen Raum in einer hinteren Gliedmaßen (c), die proximalen (d) und die distalen (e) Outlets der peristaltischen Pumpe, Kissen (f), und das Bett Blatt (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
2. Bewertung und das Management während des Tests
<ol><li>Bereiten Sie den Versuchsaufbau.<ol>
<li>Zur Vermeidung von Hypothermie während und nach dem Test benutzen Sie zwei Heizkissen gepflegt bei physiologischen Temperaturen, eine für den Messaufbau (18,8 x 37,5 cm; Abbildung 2 ein), und der andere (15,5 x 15,5 cm) für das Feld, in dem das Tier für Erholung am Ende des Tests platziert werden.</li>
		<li>Schalten Sie den Computer mit der Software für die Datenerfassung mit den Daten Speicher hohe Eingangsimpedanz verbunden (&gt; 1012Ω) und hoher Auflösung (0,1 mV) Voltmeter (Abb. 2b).</li>
		<li>Verbinden Sie die Elektroden mit dem Voltmeter. Anschließen Sie die positive Messelektrode an der nasalen Katheter und die negativen Bezugselektrode, den Katheter in den subkutanen Raum in einer hinteren Extremität, wie in Abbildung 2cgezeigt.</li>
		<li>Tauchen Sie die Spitzen der Elektroden in die Sahne-Mischung zusammen. Überprüfen Sie die erste Elektrode-Offset-Wert. Die Elektroden dann ablehnen, wenn der Wert größer als (±) 2 mV ist (im Idealfall 0 mV).</li>
		<li>Peristaltische Pumpe schalten Sie ein und stecken Sie das Pumpenrohr in Position, wie in Abbildung 2dargestellt.</li>
		<li>Schließen Sie proximalen Auslass der Pumpe Schlauch an das Fläschchen mit der gewählten Lösung für nasale Perfusion (Abbildung 2d an). Distale Auslass der Pumpe Schlauch an die Perfusion Lumen der nasalen Katheter (Abb. 2e) anschließen.</li>
		<li>Füllen Sie ein Lumen des Katheters nasale mit Elektrolyt Creme Mischung durch eine 10 µL PIPETTENSPITZE. Anpassen des Katheters an einen Silikon-Rohr-Anschluss (Abbildung 1e), füllen Sie den Connector mit Sahne mischen und legen Sie die positive Elektrode in die Stecker (Abbildung 1-f). Überprüfen Sie die Elektrode Brücke Offset Messwert. Die Brücken ablehnen, wenn der Wert größer als (±) 2 mV ist (im Idealfall 0 mV).</li>
		<li>Füllen Sie das zweite Lumen des Katheters nasale mit der frischen Lösung A1. Tauchen Sie die Spitze des nasalen Katheters in die Fläschchen mit Lösung A. Reverse die Richtung der peristaltischen Pumpe füllen eine Länge von den nasalen Katheter entspricht 10 s der Perfusion. Hinweis: Dies ermöglicht Aufnahme basale PD-Werte für 10 s vor dem Auftragen Amilorid. Tauchen Sie die Spitze des nasalen Katheters in die Creme Mischung innerhalb der Stecker der Bezugselektrode (Abbildung 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Beginnen Sie mit der Maus.<ol>
<li>Nehmen Sie die Maus Gewicht berechnen die genaue Dosis von Anästhetika durch die intraperitoneale (Ip) Route17injiziert werden.</li>
		<li>Mit Hilfe einer Nadel 26G (0,45 x 10 mm) injizieren Prämedikation intraperitoneal, die Induktion der Anästhesie zu fördern: eine feste Dosis von 50 µL 5 mg/mL Midazolam. 5 min. warten.</li>
		<li>Bereiten Sie die Narkose Mischung (Fentanyl, Medetomidine, Droperidol bei Endkonzentrationen von 0,05, 0,40 und 20 mg/kg Körpergewicht bzw. und Clonidin bei der festen Dosis von 0,375 µg) ermöglicht optimale und stabile Tiefe der Narkose (Stadium III, Ebene 2)17 . Das Volumen der Narkose Mischung intraperitoneal injizieren, und dann das Volumen von Clonidin zu injizieren. Hinweis: Nach 15 min, die Maus sollte schlafen und die Anästhesie kann für mindestens 30 Minuten dauern.</li>
		<li>Falten Sie ein Blatt des Aufsaugens Gewebe machen einen 3 cm breiten "Kissen" (Abbildung 2-f), das den oberen Teil des heizkissens (Abbildung 2eine) als Unterstützung für den Maus-Kopf abdecken wird.</li>
		<li>Decken Sie das Heizkissen mit einem Blatt des Aufsaugens Gewebe ("Bettlaken"; Abbildung 2 ( g). Legen Sie die Maus auf den Rücken auf das Heizkissen. Kleben Sie die Gliedmaßen und das Heck (Abbildung 2).</li>
		<li>Legen Sie den Verweis intravenöse Katheter (Abb. 1g) in den subkutanen Raum einer hinteren Extremität. Entfernen Sie die Nadel und passen Sie den Silikon Schlauch Anschluss (Abbildung 1e, 2 c).</li>
		<li>Füllen Sie den Katheter und der Stecker mit Sahne mischen und legen Sie die negative Elektrode in die Stecker (Abbildung 1-f).</li>
		<li>Fixieren Sie den Katheter und die Elektrode mit Klebeband wie erforderlich, um eine Verschiebung zu verhindern. Überprüfen Sie nach der Platzierung der Referenzelektrode und Brücken den Elektrode Brücke Offset Messwert wieder durch die Spitze des Katheters in der Elektrode Sahne-Mischung in den Stecker von der IV-Katheter nasale eintauchen. Aufzeichnung der stabilen Offset Endwert (idealerweise weniger als (±) 2 mV).</li>
		<li>Fixieren Sie die Maus Ohren mit "sanften" Klebeband auf das Heizkissen in einem freien Raum zwischen den zwei Stücken des Aufsaugens Gewebe ("Kissen" (Abbildung 2-f) und "Bettlaken"; (Abbildung 2g)). Beheben Sie die Tasthaare (die steifen Haare wachsen in der Nähe von den Nasenlöchern) ohne die Augen zu berühren.</li>
		<li>Flüssigkeit aus der Mundhöhle zu absorbieren, bewegen Sie die Zunge seitwärts (Abbildung 3ein) und legen Sie einen Spitzen Docht Filterpapier ("Rohr"; Abbildung 3 ( b) ca. 1 cm in den Mund. Flüssigkeit läuft aus der PERFUNDIERTEN Nasenloch zu absorbieren, legen Sie ein zweites Stück Filterpapier (das Taschentuch; Abbildung 3 ( c) statt an der Spitze der Nase.</li>
		<li>Überprüfen Sie einen Positivkontrolle Wert des epithelialen Potentials, indem die Spitze des nasalen Katheters in Kontakt mit der Innenseite des Mundes. Hinweis: Die Lesung sollte stabil und liegen zwischen-10 mV und-20 mV.</li>
		<li>Halten Sie es mit feinen Zangen und unter guten direkte Beleuchtung, zart führen Sie die nasale Katheter in ein Nasenloch bis zu 4 - 6 mm aus der Nase tip. Hinweis: Die nasale PD-Katheter befindet sich in der mittleren Nasenmuschel an der Position, die die maximale stabilere Basislinie PD Wert17,20gibt.</li>
		<li>5 min nach Injektion von Anästhetika, kippen leicht das Heizkissen um etwa 30° mit Tierkopf nach unten. Überwachen Sie die maximale basalen PD-Wert.</li>
		<li>Wann ist es stabil über einen Zeitraum von ca. 30 s, Start Vorrichtung die Nasenschleimhaut mit einer Konstanten Rate von 10 µL / min, mit 4 gepufferten Lösungen (A, A1, B1, B2) in Folge. Perfundieren die erste Lösung (Schritt 1.3.1.1) für 10 s und jede folgende Lösung (Schritt 1.4) für 5 Minuten oder bis ein stabiler Wert erreicht ist. Stoppen Sie die Vorrichtung Forskolin (B2), wenn die vorübergehende Forskolin Antwort beginnt hinunter.</li>
		<li>Wählen Sie ein 1 s-Intervall für die Datenerfassung. Starten Sie Daten zum Zeitpunkt der Gründung Perfusion Aufnahme. Daten als Funktion der Zeit auf dem Bildschirm anzeigen.</li>
		<li>Stop Datenerfassung am Ende der Perfusion mit B2-Lösung. Speichern Sie Daten als eine Tabellenkalkulationsdatei.</li>
		<li>Korrekte Daten durch Subtraktion den letzten Offset-Wert.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> Abbildung 3 : Position der Maus auf das Heizkissen mit der nasalen Katheter und der Filterpapiere vorhanden. Die Abbildung zeigt die Zunge seitwärts (a), Rohr (b) und das Taschentuch (c) setzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
(3) nach dem test, Bewertung und das Management
<ol><li>Lassen Sie die Maustaste aus der Heizkissen.</li>
	<li>Wischen Sie die Maus-Nase mit "Bettlaken" (Abbildung 2g).</li>
	<li>Injizieren Sie intraperitoneal den Narkose Antagonist-Mix bestehend aus einer festen Dosis (4 µg) von wettbewerbsfähigen Morphin Antagonisten Naloxon und Atipamezol, ein Medetomidine spezifisches Antidot (2 mg/kg Körpergewicht).</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf das kleinere Heizkissen im Feld Erholung bis zur endgültigen Genesung, die in der Regel nach 1 bis 2 h beobachtet wird. Hinweis: Der UCL-Labor wird etwa 10 % Mortalität, vor allem im Zusammenhang mit Bronchoaspiration Lösungen in der Nasenhöhle durchblutet, während des Tests unabhängig von Geschlecht oder Genotyp beobachtet.</li>
</ol>

<ol><li>Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bioelectric+potential+difference+across+respiratory+epithelia+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis.</a> New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Papier soll eine angemessene Protokoll zur Messung der nasalen PD unter kontinuierlicher Perfusion der Lösungen in spontan atmen Mäuse auf einer Länge von Zeitaufwand für die Prüfung der Integritätdes der Ionen-Transporter, hauptsächlich CFTR und ENaC beschreiben. Alle Schritte des Protokolls wurden sorgfältig optimiert, um vollständige Tier Erholung und gute Qualität und reproduzierbare Daten zu gewährleisten. In bestimmten, wichtigen Schritte sind Anästhesie Bewertung und Management und adäquate Tier Position un...

Seit fast drei Jahrzehnten wurden elektrischen möglichen Unterschied (PD) Messungen zur funktionellen Status von transmembranen Ionen-Transporter auf der Nasenschleimhaut, als Vertreter des distalen Airways1ausgedrückt zu bewerten. Wie ein mehrstufiger dynamischer test2,3, Nasal PD ermöglicht funktionale Dissektion der Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) und epitheliale Natrium-Kanal (ENaC) Aktivität, lokalisiert sowohl an der apikalen Membranen der Epithelzellen und kritische Rollen in Oberfläche Hydratation Atemwege ausübt. Die große klinische Anwendung der nasalen PD-Test ist bei der Diagnose von CF, die häufigste tödliche genetische Störung in den kaukasischen Bevölkerungen mit einer durchschnittlichen Inzidenz der 1 von 2.500 Lebendgeburten in europäischen Ländern zu unterstützen. Der Test hat lange hilfreich bei der Diagnose von abgeschwächten, Oligo oder Mono-symptomatischen Formen von CF in der Regel später diagnostiziert, und CF-bedingten Erkrankungen wie kongenitale bilaterale Fehlen der Samenleiter, idiopathischer chronischer Pankreatitis, allergische bewiesen. bronchopulmonale Aspergillose und Bronchiektasen4. In jüngerer Zeit, clinometric Bewertung der therapeutischen Modulation der grundlegenden CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 der nasalen PD in klinischen Studien mit neuen CF-Therapien Gebrauch gemacht hat. In der präklinischen Einstellung wurde der Test die Maus17 Untersuchung des die Bioaktivität der neuen CF Target Therapien18,19,20,21zuzulassen angepasst. Bei Mäusen ist die Technik zarte, basierend auf Art verwandt anatomische Unterschiede in der Größe der nasalen Region zwischen Nagern und Menschen, und vor allem auf die wesentliche Rolle der Sinneseindrücke aus der Nasofacial Region bei Nagetieren. Es erfordert ausgebildete und qualifizierte Betreiber, spezielle Ausrüstungen und Zubehör.
CF ist eine Multi-systemische Erkrankung therapeutisches Drüsen, in denen chronische Erkrankung der Atemwege das klinische Bild dominiert. Die Krankheit wird verursacht durch Mutationen im Gen Kodierung der zyklischen Adenosin Monophosphate (cAMP)-CFTR-Chlorid-Kanal22geregelt. Bis heute wurden mehr als 2.000 CFTR-Mutationen identifiziert23. Die häufigste Mutation24,25, gefunden in fast 90 % der CF-Allele, entspricht eine Deletion von Phenylalanin in Position 508 der Polypeptidkette des Proteins (F508del-CFTR). Das CFTR-Protein ist ein rein ohmschen kleiner Leitwert-Chlorid-Kanal. Außerdem gibt es beträchtlichen Beweis, dass CFTR andere Transportmechanismen, insbesondere ENaC26,27regelt. Defekten Elektrolyt Transport, einschließlich reduzierter CFTR-abhängigen Chlorid Leitwert und erhöhte ENaC-abhängige Natrium Leitwert, ist ein Markenzeichen von CF Epithelien. Der ehemalige defekt spiegelt sich ein reduziert oder abgeschafft Repolarisation als Reaktion auf einen elektrochemischen Gradienten bevorzugen Chlorid Ausfluss und Zugabe von Isoprenalin (einen β-adrenerge Agonisten, die intrazellulären cAMP erhöht) oder Forskolin (eine Adenylat Cyclase-Agonist, nicht für den klinischen Einsatz zugelassen). Der letztere defekt spiegelt sich eine basale Hyperpolarisation der Nasenschleimhaut (ein negativer PD) und eine erhöhte Reaktion auf Amilorid, ein Diuretikum, das ENaC28blockiert.
CF-Maus-Modellen in CF Forschung häufig verwendet worden und wurden bei CF Pathologie sezieren von unschätzbarem Wert. Heute wurden mindestens fünfzehn Modellen beschriebenen29, drei davon homozygot für die klinisch relevanten F508del Mutation30,31,32 sind. Eines dieser drei Sorten30, entwickelt an der Erasmus Universität in Rotterdam, hat seit fast 20 Jahren in der Université Catholique de Louvain (UCL) Labor eingesetzt. Die Cftrtm1Eur Modell30 hat erwies sich als sehr nützlich, die Gewebehypoxie Pathophysiologie der CF-Krankheit zu studieren und testen Sie die Wirksamkeit von neuen therapeutischen Strategien18,19,20, 21. Zahlreiche Probleme können auftreten, während oder nach der frühen (< 24 h) der nasalen PD-Test an Mäusen. In diesem Papier die ausreichende Tiefe der Narkose, Broncho-Aspiration von Lösungen in der Nase durchströmt zu vermeiden halten einen nasalen Katheter in Situ für kontinuierliche Perfusion und Maßnahmen gefordert werden beschrieben. Die Pflege der Tiere am Ende des Tests ist auch beschrieben, einschließlich der Verwaltung aus einer Kombination von Gegenmittel von Anästhetika, rasch die Rücknahme der Narkose mit vollständige Genesung der Tiere führt. Insgesamt können diese Verfahren zuverlässige Messungen in spontan atmen Mäuse, reduzierte Test-Mortalität und Wiederholung des Tests in das gleiche Tier. Repräsentative Daten aus der nasalen PD-Test in eine CF und Wildtyp Maus werden gezeigt und diskutiert.
Das murine nasale PD Testprotokoll wird in drei Sitzungen berichtet: Bewertung und das Management vor, während und nach dem Test. In der Pre-Test-Bewertung und Management wird das Protokoll der Vorbereitung des doppelten Lumen nasale Katheters und Lösungen für kontinuierliche nasale Perfusion verwendet ausführlich beschrieben. Bei der Bewertung und Management Teile des Tests der experimentelle Aufbau und die Handhabung der Maus minutiös seziert. Schließlich ist Management des Tieres am Ende des Tests beschrieben, um die vollständige Tier Erholung zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Portex Polyethylen-Tube&nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500; 2,0 mm ID, 3,0 mmOD</td><td>zur Vorbereitung von Kapillarröhrchen für die Nasensonde</td></tr><tr><td>Elektrodencreme</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Redux Creme</td><td>zum Aufbau von Elektrodenbrücken</td></tr><tr><td>Ag/AgCl-Elektroden</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>Mess- und Referenzelektroden</td></tr><tr><td>Amiliridhydrochlorid</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>zur Herstellung von Perfusionslösungen</td></tr><tr><td>forskolin</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>F6886</td><td>zur Vorbereitung von Perfusionslösungen</td></tr><tr><td>Knick Portamess Voltmeter</td><td>Elektronisch Me&beta; ger&auml; te, Berlin, Deutschland</td><td>Portavo 904 pH</td><td>zur Messung der Potentialdifferenz</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 Software&nbsp;</td><td>Elektronisch Me&beta; ger&auml; te, Berlin, Deutschland</td><td>Paraly SW112 Software</td><td>zur Erfassung von Potentialdifferenzdaten</td></tr><tr><td>Midazolam&nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Belgien</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>als Anästhetikum</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen Cilag, Berchem, Belgien</td><td>Fentanyl-Janssen 0,05 mg/ml</td><td>als Anästhetikum</td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finnland</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>als Anästhetikum</td></tr><tr><td>Droperidol&nbsp;</td><td>Janssen&nbsp; Cilag, Berchem, Belgien</td><td>Dehydrobenzperidol 2,5 mg/ml</td><td>als Anästhetikum</td></tr><tr><td>Clonidin&nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Deutschland</td><td>Catapressan 0,15 mg/ml,</td> <td>um als Referenz für Anästhesiemedikamente zu dienen</td></tr><tr><td>IV-Katheter</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0,75 IN, BD Insyte-W</td><td>zum Aufbau von Elektrodenbrücken</td></tr><tr><td>Pinzetten&nbsp;</td><td>Fine science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>Dumont #5, Fine science Tools</td><td>zum Platzieren des Nasenkatheters</td></tr><tr><td>Naloxon&nbsp;</td><td>Braun Medical, Brüssel, Belgien</td><td>Narcan, 0,4 mg/ml</td><td>als anästhetischer Antagonist</td></tr><tr><td>Atipamezol&nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, Belgien</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>als Medetomedin-spezifisches Gegenmittel&nbsp;</td></tr><tr><td>Heizkissen&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>zur Vermeidung von Unterkühlung während und nach dem Test</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Schweden</td><td>18111091</td><td>zur Perfusion von Lösungen in der Mausnase</td></tr><tr><td>Cyanacrylatkleber</td><td>Loctite, Henkel, D&uuml; sseldorf, deutschland&nbsp;</td><td>Sekundenkleber 3</td><td>zum Zusammenkleben von zwei Kapillarröhrchen für Nasensonde</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Na-Gluconat</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Ca-Gluconat</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma, St. Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>BD-Nadel &nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>BD 26G (0,45x10 mm)</td><td>intraperitoneale Injektion</td></tr></tbody></table>

nasale potentialdifferenz, trans-epithelialen ionentransport bei mäusen zu quantifizieren

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Die nasale potenzielle Unterschied Test wurde seit fast drei Jahrzehnten zur bei der Diagnose der zystischen Fibrose (CF) zu unterstützen. Es hat sich als hilfreich im Falle von gedämpft, Oligo oder Mono-symptomatischen Formen von CF in der Regel später diagnostiziert, und CF-bedingten Erkrankungen wie kongenitale bilaterale Fehlen der Samenleiter, idiopathischer chronischer Pankreatitis, allergische bronchopulmonale Aspergillose und Bronchiektasen. In klinischen und präklinischen Einstellungen wurde der Test verwendet wie ein Biomarker, Antworten auf gezielte therapeutische Strategien für vgl. Anpassung der Test eine Maus zu quantifizieren anspruchsvoll ist und kann einen damit verbundenen Sterblichkeit zur Folge haben. Dieses Papier beschreibt die ausreichende Tiefe der Narkose erforderlich, um einen nasalen Katheter in Situ für kontinuierliche Perfusion. Es werden Maßnahmen zur Vermeidung von Broncho-Aspiration von Lösungen in der Nase durchströmt. Es beschreibt auch die Pflege der Tiere am Ende des Tests, einschließlich Verwaltung aus einer Kombination von Gegenmittel von Anästhetika, rasch die Rücknahme der Narkose mit vollständige Genesung der Tiere führt. Repräsentative Daten aus einem CF und Wildtyp Maus zeigen, dass der Test zwischen CF und nicht-CF unterscheidet. Insgesamt ermöglicht das Protokoll hier beschriebenen zuverlässige Messungen des funktionellen Status von Trans-epithelialen Chlorid und Natrium-Transporter in spontan atmen Mäuse sowie mehrere Tests im gleichen Tier und gleichzeitig Test-bezogene Mortalität.

Um die charakteristischen Ionen-Transport Anomalien in CF zu verdeutlichen, wurden nasale TE-Messungen durchgeführt, nach der oben beschriebenen, in eine F508del-CF-Maus und ein Wildtyp Kontrolle über den FVB/129 genetischen Hintergrund aus der Kolonie Brüssel-Protokolls CFTRtm1Eur Mäuse30. Diese klinisch relevante Modell, beherbergen die häufigste und einer der schwersten F508del-CFTR-Mutation23,24</s...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur nasalen Potentialdifferenz bei Mäusen zu messen. Der Test wird die Funktion des transmembranen Ion Transporter wie der Mukoviszidose transmembranen Leitwert Regler und der epithelialen Natrium-Kanal quantifiziert. Es ist wertvoll zur Bewertung der Wirksamkeit neuartiger Therapien für Mukoviszidose.

Nasale Potentialdifferenz, Trans-epithelialen Ionentransport bei Mäusen zu quantifizieren

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Die nasale Potentialdifferenz ist eine wertvolle Methode, um den Phänotyp transgener Mäuse zu charakterisieren, die Mukoviszidose modellieren. Es ermöglicht die Untersuchung der Wirksamkeit neuartiger Therapien bei Mukoviszidose. Die Hauptvorteile der Technik bestehen darin, dass sie zuverlässige Messungen an kontinuierlich brütenden Mäusen ermöglicht.Es reduziert die damit verbundene Mortalität und ermöglicht die Wiederholung des Tests am selben Tier. Um den doppellumigen Nasenkatheter vorzubereiten, halten Sie die Mitte eines 20 Zentimeter langen Polyethylenschlauchs etwa 10 bis 15 Sekunden in der Flamme, bis er weich genug zum Ziehen ist. Ziehen Sie dann die beiden Enden auseinander, um ein sehr dünnes Kapillarrohr von etwa 15 Zentimetern Länge und einem Außendurchmesser von 0,1 Millimetern für die Nasensonde zu erhalten.Reinigen und entfetten Sie anschließend die beiden Kapillaren mit reinem Ethanol. Verbinden Sie sie mit Klebeband und kleben Sie sie mit Cyanacrylatkleber zusammen. Schneiden Sie die überschüssige Länge der Sonden mit einer Rasierklinge ab, um den etwa acht Zentimeter langen Doppellumenkatheter zu erhalten.Injizieren Sie dann Wasser durch beide Lumen, um zu über

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen und zuverlässige Methode zur Beurteilung Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Dieses Protokoll beschreibt eine Aufnahme-Setup, Maus Gewebe Vorbereitung, Datenerfassung und grundlegende Analyse der Daten.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Dieses Video zeigt die elektrophysiologische Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSNs) bei Mäusen mit einer perforierten Patch-Clamp-Technik. Das olfaktorische Epithel, das OSNs mit Fluorophor-markierten Geruchsrezeptoren enthält, wird von einer Maus isoliert und in einer Aufzeichnungskammer gesichert. Eine Aufzeichnungspipette wird an den dendritischen Knopf eines OSN geklemmt, und Nystatin in der Pipette perforiert die Membran, um eine elektrische Verbindung mit der Zelle...

Perforierte Patch-Clamp-Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen bei Mäusen

Eine effektive Methode, um Manuelle Zerlege Intact Maus Nasengewebe mit erhaltener Anatomische Organisation vorbereiten

Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Hier beschreiben wir einen physiologischen Ansatz, der die Identifizierung und eingehende Analyse einer definierten Population von sensorischen Neuronen in akuten koronalen Gewebeschnitten des vomeronasalen Organs der Maus unter Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen ermöglicht.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

Dieses Protokoll beschreibt Echtzeit-Iontophorese, eine Methode, die physikalische Parameter des extrazellulären Raumes (ECS) des lebenden Gehirns misst. Die Diffusion eines in das ECS freigesetzten Inertmoleküls wird zur Berechnung des ECS-Volumenanteils und der Tortuosität herangezogen. Es ist ideal für das Studium akuter reversibler Änderungen an Gehirn ECS.

Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

Hier präsentieren wir Ihnen ein standardisiertes Protokoll um die nasale Potentialdifferenz (NPD) zu messen. Zystische Fibrose transmembranen Leitwert Regulator (CFTR) und epitheliale Natrium-Kanal (ENaC)-Funktion werden ausgewertet von der Änderung in der Spannung über die nasale Epithel nach Superfusion von Lösungen, die Ionen-Kanal Aktivität ändern vorausgesetzt, eine Ergebnis Maßnahme.

Standardisierte Messung der Nasenschleimhaut berührt Potential Unterschied (NPD)

Das Darmepithel verleiht nicht nur Nährstoffaufnahme, sondern auch Schutz vor schädlichen Substanzen. Die apikal-epithelste interzelluläre Verbindung, d. h. die Tight Junction, reguliert die parazelluläre Durchlässigkeit von gelösten Stoffen und Ionen. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Schleimhautblättern und zur Beurteilung der Ionenselektivität von Tight Junctions mittels Ussing-Kammertechnik beschrieben.

Funktionelle Beurteilung der intestinalen Tight-Junction-Barriere und der Ionenpermeabilität im heimischen Gewebe durch Ussing-Chamber-Technik

Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.

Primäre humane Nasennebenhöhlen: Biobanking im Kontext der Präzisionsmedizin

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

Erfahren Sie die Messung des nasalen Potentialunterschieds bei Mäusen zur Quantifizierung des trans-epithelialen Ionentransports. Diese Methode ermöglicht die Bewertung neuer Therapien für Mukoviszidose.

Nasale Potentialdifferenz, Trans-epithelialen Ionentransport bei Mäusen zu quantifizieren

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