Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis
17. Oktober 2018
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Monocyte Teilmengen von Vollblut Durchflusszytometrie. Dazu gehören wie Tor die Teilmengen und bewerten ihren Ausdruck der oberflächenmarker skizziert und geben ein Beispiel für die Beurteilung des Ausdrucks (entzündlich) M1 und M2-Marker (entzündungshemmend).
Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten. Beispielsweise bestimmen, wie Monozyten-Teilmengenanteile oder Die Expression verschiedener Marker in Krankheitszuständen verändert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sich die Zellen in der Nähe ihres ursprünglichen Zustands befinden und dass klare Anweisungen und Begründungen verwendet werden, um eine standardisierte Gating-Methode bereitzustellen.
Im Allgemeinen können Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da viele Papiere keine klaren Anweisungen dazu geben, wie das Gating der Zellen durchgeführt wurde. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Entnahme von Blutproben und der Bestimmung der Anzahl der weißen Blutkörperchen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie das Blut mit phosphatgepufferter Saline, um die Konzentration auf etwa 5 Millionen weiße Blutkörperchen pro Milliliter anzupassen.
Bereiten Sie einen ausreichenden Master-Mix für die Anzahl der Tuben vor, indem Sie Blut, Anti-CD14-V450, Anti-CD16-APC und Anti-HLA-DR-PerCP kombinieren. Vortex und Pipette 51,9 Mikroliter in jedes Rohr mischen. Fügen Sie PE-markierte M1- und M2-Marker-Antikörper sowie Marker für T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile und natürliche Killerzellen zu ihren entsprechenden Röhren hinzu.
Wirbel und inkubieren für 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nun fügen Sie 250 Mikroliter kombinierte rote Blutkörperchen Lyse und weiße Blutkörperchen Fixierlösung, und sofort wirbeln die Mischung, sanft. Die Wirbelmischung 10 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach 10 Minuten 250 Mikroliter PBS hinzufügen und die Zellen bei 260g für 10 Minuten bei Raumtemperatur drehen. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 300 Mikroliter 1%Formaldehyd wieder aus. Bewahren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius auf, geschützt vor Licht, bis eine Analyse durchgeführt wird.
Die Durchflusszytometrie sollte innerhalb von 48 Stunden nach probenvorbereitung erfolgen. Überprüfen Sie zunächst das Durchfluss-Zytometer-Protokoll, um sicherzustellen, dass das Personal der Einrichtung Qualitätskontrollen durchgeführt hat. Um das Flow-Zytometrie-Experiment einzurichten, klicken Sie auf ein neues Experiment, gefolgt von neuen Proben und neuen Rohren, um Röhren hinzuzufügen.
Wählen Sie bivariate Plots aus, indem Sie auf das Symbol klicken, und verwenden Sie die Dropdown-Menüs, um die Zugriffsparameter auszuwählen. Stellen Sie sicher, dass ein CD16/CD14-Plot und ein Diagramm, das einen Detektor neben der Zeit anzeigt, enthalten sind, um die Erfassung zu überwachen. Legen Sie das Rohr ein und klicken Sie, erwerben Sie.
Überprüfen Sie die Gerätespannungseinstellungen, um sicherzustellen, dass detektorsignale nicht aus der Skala sind. Beobachten Sie Zellen, die in das Monozytentor des CD14/CD16-Plots fallen. Legen Sie den Aufnahmeschwellenwert auf 5.000 Ereignisse für das klassische Monozytentor fest, und klicken Sie auf Aufzeichnung.
Fahren Sie mit der Aufzeichnung der Daten für die verbleibenden Rohre fort. Nachdem Daten für alle Rohre aufgezeichnet wurden, exportieren Sie die Flussdaten zur Analyse als fcs-Dateien. Um Monozyten-Gating durchzuführen, öffnen Sie Dateien in der Analysesoftware, doppelklicken Sie auf den Rohrnamen, und wählen Sie Parameter aus den Dropdownmenüs aus, um die Zellen in einem Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Vorwärtsstreuhöhendiagramm zu visualisieren.
Erstellen Sie ein Doublet-Ausschlusstor, indem Sie auf das Polygon-Gate-Symbol klicken und die Zellen einschließen. Wählen Sie die gated Cells aus, indem Sie auf den gated Bereich doppelklicken. Passen Sie im neuen Anzeigefeld dropdown-Menüparameter an, um die Zellen auf einem vorwärts gerichteten Streubereich im Vergleich zum Seitenstreubereichsdiagramm anzuzeigen.
Klicken Sie auf das rechteckige Torsymbol, und wählen Sie großzügig die Monozytenpopulation aus, basierend auf vorwärts- und seitlichen Streueigenschaften, um die Mehrheit der Lymphozyten, natürlichen Killerzellen und Granulozyten auszuschließen. Wählen Sie die abgegrenzten Zellen aus und zeigen Sie sie auf einem CD14/CD16-Plot erneut an, indem Sie die Parameter mithilfe der Dropdown-Menüs auswählen. Klicken Sie auf das Polygon-Tor, um Monozyten basierend auf ihrer charakteristischen, invertierten l-Form auszuwählen.
Wenn sich die nicht-klassische Population nicht von den Zellen links unterscheidet, ist eine Kontamination wahrscheinlich und sollte untersucht werden. Wählen Sie die gated cells aus, und zeigen Sie die Monozyten auf einem CD/16 HLA-DR-Plot an, indem Sie die Dropdown-Menüs verwenden, um Parameter auszuwählen. Klicken Sie auf das Polygontor, um die HLA-DR-positiven Zellen auszuwählen und alle verbleibenden natürlichen Killerzellen und Neutrophilen auszuschließen.
Wählen Sie die gated cells aus, und zeigen Sie die HLA-DR-positiven Zellen in einem CD14/HLA-DR-Diagramm mithilfe von Dropdown-Menüs an, um Parameter auszuwählen. Klicken Sie auf das Polygon-Gate, und zeichnen Sie ein Tor, um die HLA-DR-Hoch-/CD14-Low-B-Zellen auszuschließen. Wählen Sie die gated cells aus, und verwenden Sie die Dropdown-Menüs, um sie auf einem CD16/CD14-Plot anzuzeigen.
Wählen Sie aus Plotoptionen Zebradiagramm aus, mit dem Monozyten-Teilmengentore gezeichnet werden können, um Teilmengenanteile zu bestimmen. Klicken Sie nun auf das rechteckige Torsymbol, und wählen Sie die klassischen Monozyten aus, indem Sie ein ungefähres rechteckiges Tor um die CD14 high/CD16 low classic monocyte population zeichnen. Wählen Sie unter Anzeige die Mediane aus, um die mittlere Fluoreszenzintensität für klassische Monozyten anzuzeigen.
Passen Sie das Tor so an, dass die Grundgesamtheit eine gleichmäßige Verteilung vom Median auf der linken und rechten Seite hat und alle Zellen links umfasst. Wählen Sie die Zwischenpopulation aus, indem Sie ein rechteckiges Tor zeichnen, das die Zellen rechts vom klassischen Tor umfasst. Passen Sie den Boden des Tores an, um die nicht-klassischen Zellen auszuschließen, indem Sie das Tor mit der Unterseite der konzentrischen Kreise ausrichten, die sich vollständig innerhalb des klassischen Monozytentors befinden.
Gate die nicht-klassische Teilmenge, indem Sie ein rechteckiges Feld vom unteren Rand der Zwischenteilmenge nach unten ziehen und alle Zellen zum unteren Rand der Grundgesamtheit auswählen. Wählen Sie unter Anzeige die Option Gate-Frequenzen anzeigen aus, um den Prozentsatz jeder Monozyten-Teilmenge zu bestimmen. Wählen Sie schließlich Zellen aus jeder Monozyten-Teilmenge aus.
Ändern Sie die Dropdown-Parameter, um ein Histogramm für jede Monozyten-Teilmenge zu erstellen, wobei jede Markierung angezeigt wird. Berechnen Sie dann den Ausdrucksgrad unter Verwendung des medianen oder geometrischen Mittelwerts, wie im Textprotokoll beschrieben. Erfolgreich abgegrenzte Monozytenpopulationen werden hier gezeigt.
Und die Proportionen entsprechen denen in der Literatur. Die Anteile für diese Stichprobe wurden berechnet als 88,1% klassisch, 4,33% Zwischenprodukte und 7,49% nicht-klassisch. Durch die Beurteilung der relativen Position anderer Populationen wird deutlich, dass die hier in Blau dargestellten T-Zellen und Neutrophilen weit außerhalb der monozyten, invertierten l-Form auf einem CD16/CD14-Diagramm folgen.
Sowohl die natürlichen Killerzellen als auch die B-Zellpopulationen, die hier in Blau dargestellt werden, überschnitten sich jedoch mit der nicht-klassischen Monozytenpopulation. Hier werden Wärmekarten gezeigt, die bestätigen, dass kontaminierende Zelltypen entfernt wurden. Die natürlichen Killerzellen wurden durch den HLA-DR CD16-Schritt ausgeforstet, während die B-Zellen durch den HLA-DR CD/14-Schritt ausgeforstet wurden.
Die Expression von M1- und M2-Markern in Blau, relativ zu ihren Isotyp-Steuerelementen in Rot, wird hier angezeigt. CD120b ein M1-Marker, zeigt eine klare Verschiebung über seine Isotype-Steuerung, für alle Monozyten-Teilmengen. Dies gilt auch für CD93 ein M2-Marker, wobei der Ausdruck in der klassischen, moderaten zwischenden und niedrig auf nicht-klassischen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass kontaminierende Zellen abgegrenzt werden, da sie andernfalls zur quantifizierten Expression beitragen können. Nach diesem Verfahren können andere Marker untersucht werden. Um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie sich der Monozytenmarker-Ausdruck bei Krankheiten verändert.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut und Formaldehyd gefährlich sein kann, und daher sollten Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung und die Verwendung einer Biohazard-Haube immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Charakterisierung von Monozyt-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie an Vollblut vor. Es werden die Gating-Strategie für die Subpopulationen sowie die Bestimmung der Oberflächenmarkerdarstellung beschrieben, einschließlich der M1- und M2-Marker.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Durchflusszytometrie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Monocyten spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort.
- Die Charakterisierung von Monozyten-Subpopulationen kann Einblicke in Krankheitszustände liefern.
- Standardisierte Gating-Methoden sind für eine genaue Analyse unerlässlich.
- Viele bestehende Protokolle weisen Unklarheiten bei den Gating-Anweisungen auf.
Zweck der Studie
- Eine klare Anleitung für die Charakterisierung von Monozyt-Subpopulationen bereitstellen.
- Die Expression entzündungsfördernder und entzündungshemmender Marker bewerten.
- Standardisierte Methoden für Forscher erleichtern.
Verwendete Methoden
- Entnahme von Blutproben und Bestimmung der Leukozytenzahl.
- Herstellung der Blutverdünnung und der Antikörper-Master-Mix-Lösung.
- Einrichtung der Durchflusszytometrie und Datenaufnahme.
- Tordefinition und Analyse der Monozytenpopulationen mittels Software.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Gating-Strategie für Monozyten-Populationen wurde erreicht.
- Die Anteile der Monozyten-Subpopulationen wurden berechnet: 88,1 % klassische, 4,33 % intermediäre und 7,49 % nicht-klassische Monozyten.
- Die Expressionslevel von Oberflächenmarkern wurden bestimmt.
- Die Ergebnisse stimmen mit der bestehenden Literatur zu Monozyten-Subpopulationen überein.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Charakterisierung von Monozyt-Subpopulationen.
- Klare Anweisungen verbessern die Reproduzierbarkeit in der Forschung.
- Das Verständnis von Monozyt-Subpopulationen kann bei immunologischen Studien hilfreich sein.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die standardisierte Charakterisierung menschlicher Monozyt-Subpopulationen ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Dynamik von Immunzellen in Modellen entzündlicher Erkrankungen. Die Durchflusszytometrie von Vollblut minimiert ex-vivo-Artefakte und liefert so physiologisch relevante Daten für die Zielvalidierung in der Entwicklung immunmodulierender Arzneimittel. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagegenauigkeit, indem er quantitative und reproduzierbare Messungen der Anteile von Subpopulationen sowie der Expression funktioneller Marker bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Anteile von Monozyt-Subpopulationen als Biomarker für die Aktivierung entzündlicher Signalwege in Krankheitsmodellen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem die Expression von Oberflächenmarkern (z. B. M1/M2-Marker) mit den Polarisationstadien von Monozyten verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten durch standardisierte Gating-Strategien, die die interlaboratorische Variabilität bei der Identifizierung von Subpopulationen minimieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Daten zur Untergruppenhäufigkeit, die für die Standardisierung von Assays in Verbindung mit Wirkstoff-Screening-Kampagnen geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht hochreproduzierbare Messwerte zur Beurteilung immunmodulatorischer Wirkungen von Testsubstanzen auf Monozyten-Phänotypen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die multiplexe Analyse von Oberflächenmarkern innerhalb einer einzelnen Probe und erhöht dadurch die Effizienz des Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet krankheitsrelevante Systemauslesungen, die mit klinischen Beobachtungen von Veränderungen in Monocyt-Subpopulationen bei Entzündungen übereinstimmen.
- Operativer Wert: Unterstützt die translationale Biomarker-Qualifizierung, indem er die longitudinale Verfolgung von Anteilen der Subpopulationen und der Markerexpression ermöglicht.
- Strategischer Wert: Hilft bei risikoadjustierten Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem er Veränderungen im Monocyt-Phänotyp mit der Bindung an das pharmakologische Zielmolekül korreliert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungsphase der biologischen Forschung ein, in der eine präzise Phänotypisierung der Immunzellen vor der Optimierung der Wirkstoffkandidaten erforderlich ist, um immunmodulatorische Zielstrukturen hinsichtlich ihrer Mechanismen abzusichern.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem quantifiziert wird, wie Monozyt-Teilpopulationen auf Weginhibitoren im Kontext von Vollblut reagieren.
- Screening: Liefert assaysbereite, standardisierte Ergebnisse zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Verteilung und Aktivierungszustände von Monozyt-Teilpopulationen.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich der medianen Fluoreszenzintensität und der Häufigkeiten von Teilpopulationen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, um Rückschlüsse auf die Zielmodulation zu ziehen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch biomarkerbasierte Beurteilung von Monozytenantworten, die für menschliche entzündliche Erkrankungen relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Immunphänotypisierung, die in mehreren therapeutischen Bereichen mit monozytenvermittelter Pathologie anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem falsch-positive Ergebnisse durch artefaktuelle Zellaktivierung verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Probenvorbereitung und Gating-Strategie.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem bereits früh im Entwicklungsprozess mechanistische Aussagen zur immunmodulatorischen Aktivität bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf konsistenten Daten zur immunmodulatorischen Profilierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kompensation der Durchflusszytometrie, der Gate-Strategie und der Gestaltung von Immunphänotypisierungs-Panels.
- Ist abhängig vom Zugang zu Durchflusszytometern mit ausreichend Fluoreszenzkanälen für die multiplexe Detektion von Monozyten und Kontaminationszellen.
- Erfordert standardisierte Schulungen, um eine konsistente Anwendung der Gate-Hierarchie zwischen Anwendern und Standorten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Panel um zusätzliche funktionelle Marker über die M1/M2-Marker hinaus erweitert wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie Stabilitätsanforderungen der Proben, die eine Analyse innerhalb von 48 Stunden nach der Probenvorbereitung notwendig machen.
