Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

Zu verstehen, wie der Blutfluss in der Netzhaut gesteuert wird, ist ein wichtiges Ziel, da ein abnormaler Blutfluss mit der Entwicklung einer Vielzahl von sehgefährdenden Netzhauterkrankungen wie diabetischer Retinopathie, Glaukom und Astvenenverschlüssen in Verbindung gebracht wird. Retinale Arteriolen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des Blutflusses in der Netzhaut, indem sie ihren luminalen Durchmesser erweitern und verengen, was durch Veränderungen in der Kontraktilität der glatten Muskelzellen, die diese Gefäße umgeben, vermittelt wird. Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Regulation der retinalen Perfusion zugrunde liegen, sind daher Präparate erforderlich, bei denen retinale arterioläre glatte Muskelzellen unter möglichst physiologischen Bedingungen zugänglich gemacht und untersucht werden können.

In diesem Video zeigen wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung von Arteriolen aus der Netzhaut von Ratten, das in Patch-Clamp-, Calcium-Imaging- und Druckmyographie-Studien verwendet werden kann. In den letzten Jahren wurde dieses Präparat verwendet, um weitere Einblicke in die Regulation der Kontraktilität der vaskulären glatten Muskulatur und des Blutflusses in der Netzhaut sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit zu erhalten. Stellen Sie eine Ein-Liter-Lösung mit niedrigem Kalziumgehalt her, die Hanks'or LCH enthält, wie in der Materialtabelle gezeigt.

Montieren Sie die Isolationsausrüstung vor der Entnahme von Gewebe. Die Glaspasteurpipette muss feuerpoliert werden, um die Spitze zu glätten, aber nicht zu verengen. Schneiden Sie eine Kunststoffpipette auf eine Öffnung von etwa fünf bis sieben Millimetern ab.

Legen Sie die Augen auf die Sezierschale, die in LCH-Lösung getaucht ist. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Auge an der Schale zu verankern, indem Sie die Orbitamuskelansätze oder den Sehnerv festhalten. Stellen Sie sicher, dass der Verankerungspunkt so nah wie möglich an der Sklera liegt, um das Auge zu stabilisieren.

Schneiden Sie mit der Klinge die Hornhaut entlang der Ora serrata durch und entfernen Sie die Linse, indem Sie mit einer Pinzette leicht auf die Sklera drücken. Die kleine, kreisförmige Region, die wir auf diesem Bild im hinteren Teil des Auges sehen, ist der Sehnerv. Schneiden Sie mit der Klinge die Augenmuschel symmetrisch durch die Sehscheibe in zwei Hälften.

Bürsten Sie mit einer geschlossenen Pinzette vorsichtig die Netzhaut aus den beiden Hälften der Augenmuschel heraus und achten Sie darauf, alle verbleibenden Ansätze an der Sehscheibe zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Auge und übertragen Sie die präparierten Netzhäute mit der Kunststoffpipette und einem kleinen Tropfen LCH-Medium in das Reagenzglas. Füllen Sie das Reagenzglas mit der Kunststoffpipette auf etwa fünf Milliliter mit LCH und lassen Sie die Netzhaut am Boden des Röhrchens absetzen.

Waschen Sie das Tuch etwa dreimal, indem Sie etwa vier Milliliter Lösung aus dem Röhrchen entfernen und mit der Kunststoffpipette frisches LCH hinzufügen. Falls erforderlich, sollte Fremdgewebe entfernt werden. Waschen Sie die Innenseite der Pasteur-Pipette aus Glas mit polierter Spitze mit LCH, um zu verhindern, dass das Gewebe an der Pipette kleben bleibt.

Nehmen Sie mit derselben Pipette etwa vier Milliliter Lösung aus dem Reagenzglas und fügen Sie etwa zwei Milliliter frisches LCH hinzu. Dissoziieren Sie die Netzhaut vorsichtig, indem Sie das Gewebe langsam durch die Spitze der Glaspipette ziehen und den Inhalt in das Reagenzglas ausstoßen. Versuchen Sie, in diesem Stadium keine Blasen einzuführen, und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Netzhaut auf die Größe von etwa zwei bis drei Quadratmillimetern aufgebrochen ist.

Waschen Sie das Innere der Pipette mit etwa zwei Millilitern LCH und geben Sie dieses in das Reagenzglas. Lassen Sie den Inhalt über fünf bis 10 Minuten auf dem Boden absetzen. Wiederholen Sie den Verreibungsvorgang wie zuvor beschrieben mit etwas mehr Kraft, bis die Gewebestücke etwa einen Quadratmillimeter groß sind.

Lassen Sie das Gewebe sich absetzen und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal mit noch mehr Kraft, bis der Inhalt vollständig homogenisiert ist und keine Netzhautstücke mehr übrig sind. Die Lösung sollte in diesem Stadium milchig aussehen. Diese Technik liefert bis zu acht Arteriolensegmente pro Isolierung mit einer Länge von 200 bis 2.500 Mikrometern.

Die Kanülierung eines Endes der Arteriole mit einem Verschluss des gegenüberliegenden Endes ermöglicht die Messung der druckinduzierten Vasokonstriktion, die auch als myogene Reaktion bezeichnet wird. Die arterioläre Druckmyographie wird wie folgt durchgeführt. Ein Aliquot des retinalen Homogenats wird in eine physiologische Aufnahmekammer überführt, die auf dem Tisch eines inversen Mikroskops montiert ist.

Lassen Sie das Homogenat mindestens fünf Minuten lang auf dem Boden der Kammer absetzen. Scannen Sie visuell durch die Aufnahmekammer, um Arteriolen zu identifizieren, die mehr als 200 Mikrometer lang sind und ein offenes Ende besitzen, durch das das Gefäß kanüliert werden kann. Ankern Sie an einem Ende des Gefäßes mit einer feinen Pinzette und einem kleinen Wolframdrahtstreifen, der über das Gefäß gelegt wird.

Manövrieren Sie das Gefäß unter Verwendung der überlappenden Enden des Wolframdrahtes so, dass es horizontal über das Bad verläuft, so dass das offene Ende in einer Linie mit der Druckkanüle liegt. Die Kammer mit null Kalzium-Hanks'bei 37 Grad Celsius durchbluten. Die Kanülierungen werden mit Glaspipetten durchgeführt.

Die Kanüle wird mit Hilfe eines feinen Mikromanipulators am offenen Ende des Gefäßes positioniert. Die Spitze wird unmittelbar neben der Öffnung positioniert, wie durch Einstellen der Fokusebene am Mikroskop beurteilt, so dass sowohl das Ende des Gefäßes als auch die Kanülenspitze gleichzeitig scharf sind und die Druckkabine in die Gefäßöffnung vorgeschoben wird. Eine Hilfspipette ist erforderlich, um den Kanülierungsprozess zu unterstützen, und wird verwendet, um die Arteriole sanft zurückzuhalten und die arterioläre Wand über die Druckkanüle zu führen, während die Kanüle gleichzeitig in das Gefäßlumen vorgeschoben wird.

Dieses Verfahren erfordert eine gleichzeitige, kontrollierte Bewegung beider Manipulatoren und viel Übung, um eine hohe Erfolgsquote zu erzielen. Nach einer Minute der Aufzeichnung bei null Millimeter Quecksilbersäule wird der intraluminale Druck auf 40 Millimeter Quecksilbersäule erhöht, und das Gefäß sollte sich schnell erweitern, was eine erfolgreiche Kanülierung bestätigt. Die druckinduzierte Vasokonstriktion, also die myogene Reaktion, entwickelt sich anschließend über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten.

Die Aufzeichnung von Patch-Clamp-Zellen aus retinalen vaskulären glatten Muskelzellen ermöglicht die Untersuchung der Ionenströme der Plasmamembran, die das intrazelluläre Kalzium und damit die zelluläre Kontraktilität regulieren. Eine Ganzzell- und Einkanalaufzeichnung ist von einzelnen glatten Muskelzellen, die noch in ihren Elternarteriolen eingebettet sind, wie folgt möglich. Die retinalen Arteriolen werden isoliert und mit Wolframdrahtschlickern in der Aufzeichnungskammer verankert.

Die Basallamina muss wegverdaut werden, damit eine hochohmige Abdichtung zwischen der Patch-Pipette und der arteriolären glatten Muskelzellmembran gebildet werden kann. Die Arteriolen werden mit einer sequentiellen Reihe von Enzymlösungen bei 37 Grad Celsius überflogen, was auch zu einer elektrischen Entkopplung benachbarter Zellen führt, wie die Pfeile auf dem Bild zeigen. Der Grad der Verdauung wird zunächst anhand der visuellen Trennung von endothelialen und glatten Muskelschichten während des Kollagenase-Schritts bewertet.

Die Entfernung aller verbleibenden Stränge der Basallamina und/oder des peripheren Neuropiles wird erreicht, indem die geschlossenen Spitzen der feinen Pinzette vorsichtig über die Oberfläche des Gefäßes gestrichen werden. Für das Patch-Klemmen wird die Spitze der Patch-Pipette vertikal über der interessierenden Zelle positioniert und mit der feinen, langsamen Bewegung des Mikromanipulators allmählich abgesenkt, um Kontakt mit der arteriolären glatten Muskelmembran aufzunehmen. Dies wird anhand der Zellbewegung und einer Änderung des Pipettenwiderstands beurteilt, die mit Hilfe eines Zellversiegelungstestprotokolls in der Erfassungssoftware gemessen werden.

Wenn die Pipette auf die Zelle abgesenkt wird, erhöht sich der Dichtungswiderstand um das Fünffache. Auf der Rückseite der Pipette wird vorübergehend Unterdruck ausgeübt, und nach und nach bildet sich ein Gigaseal. Dies erfordert wiederholte Anwendungen von Unterdruck über einen Zeitraum von ein bis fünf Minuten.

Für die Ganzzellaufzeichnung wird überwiegend die perforierte Patch-Clamp-Methode verwendet. Mit einer Pipette, die intrazelluläre Lösung und Amphotericin B enthält, wird, wie zuvor beschrieben, ein Gigaseal gebildet. Der Zugangswiderstand wird mit Hilfe des Membrantestprotokolls in der Erfassungssoftware überwacht. Sobald der Zugangswiderstand auf weniger als 15 Megaohm fällt, wird eine Serienwiderstandskompensation durchgeführt.

Typischerweise ist es möglich, den Serienwiderstand im perforierten Patch-Modus um ca. 75% zu kompensieren. Spannungsstufen oder Rampenprotokolle können dann verwendet werden, um Ganzzellenströme zu messen. Nach der Dissoziation der Netzhaut können primäre, sekundäre und präkapilläre Arteriolen anhand ihres Kalibers und der Anordnung der vaskulären glatten Muskelzellen identifiziert werden.

Die Arteriolen erster und zweiter Ordnung erscheinen in der Hellfeldmikroskopie optisch ähnlich, können aber anhand ihrer Größe unterschieden werden. Die präkapillären Arteriolen sind die kleinsten arteriellen Gefäße in der Präparation und sind durch die intermittierende Anordnung der vaskulären glatten Muskelzellen leicht zu erkennen. Die isolierten Arteriolen können innerhalb der Isolierung deutlich von Kapillaren und Venolen unterschieden werden.

Die Kapillaren sind als ein Geflecht aus kleinkalibrigen Gefäßen mit einem Durchmesser von etwa vier bis 10 Mikrometern sichtbar, während die Venolen dünnwandig sind und keine glatte Muskelzellabdeckung aufweisen. Primäre, sekundäre und präkapilläre Arteriolen eignen sich für Druckmyographie, Kalziumbildgebung und Patch-Clamp-Untersuchungen. Mit Hilfe von druckbeaufschlagten Arteriolen haben wir die molekularen Mechanismen untersucht, die an der Entstehung der myogenen Reaktion beteiligt sind.

Die Mikroaufnahmen in diesem Bild zeigen eine retinale Arteriole der Ratte zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf eines Druckmyographie-Experiments. Das untenstehende Zeitverlaufsdiagramm zeigt die Änderungen des Gefäßdurchmessers während des gesamten Verlaufs des Experiments. Unmittelbar nach der Druckbeaufschlagung erweitert sich das Gefäß, woraufhin eine aktive myogene Verengung folgt, die nach 15 Minuten ein Steady-State-Niveau erreicht.

Die Zugabe von Wortmannin in einer kalziumfreien Hanks-Lösung am Ende des Experiments erweitert das Gefäß zu Normalisierungszwecken auf seinen passiven Durchmesser. Diese Folie zeigt ein Beispiel für eine einkanalige Patch-Clamp-Aufzeichnung einer glatten Muskelzelle der Netzhautarteriole vor und nach der Membrandehnung. Dieses On-Cell-Pflaster enthält zwei dehnungsaktivierte TRPV2-Kanäle, deren Aktivität mit dem Anlegen von Unterdruck auf die Patch-Pipette zunimmt.

Die hier beschriebenen Protokolle erfordern Übung, sollten aber mit minimaler Fehlerbehebung erreichbar sein. Wir empfehlen, die isolierten Arteriolen am selben Tag wie die Isolierung zu verwenden. Die Methode ist für retinale Arteriolen der Ratte optimiert, kann aber auch auf die Netzhaut von Mäusen angewendet werden.

Nun haben wir dieses Präparat ausgiebig verwendet, aber wo es möglich ist, versuchen wir auch, unsere wichtigsten Ergebnisse mit ex vivo retinalen Ganzhalterungen und in vivo Messungen des Blutgefäßdurchmessers und des Blutflusses zu validieren.