Name: Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Lernen Sie die Isolierung retinaler Arteriolen aus der Rattenretina für elektrophysiologische Studien. Diese Methode ermöglicht Untersuchungen zur Regulation des Blutflusses und der glatten Gefäßmuskulatur.

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Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen wurde unterstützt durch Zuschüsse aus folgenden Förderinstitutionen: BBSRC (BB/I026359/1), Kampf um Anblick (1429 und 1822), die Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04) British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) und MRC (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Dr. Joanna Kur ist jetzt ein Mitarbeiter von Medtronic (Doppelstädte, Minnesota, USA), ihre gegenwärtige Arbeit nicht in Konflikt mit dem hier vorgestellten.

Die oben beschriebenen Protokolle sollte erfordern Übung jedoch mit minimalen Fehlerbehebung erreicht werden können. An einem durchschnittlichen Tag würden wir erhalten 6-8 nutzbare Arteriolen aus der Isolation und 3-4 erfolgreiche Experimente erreichen. Wenn Probleme auftreten, jedoch gibt es einige Schritte, die zur Verbesserung der Erfolgsraten getroffen werden können. Gelegentlich haben wir gefunden, insbesondere bei Verwendung von jüngeren Ratten (< 8 Wochen), dass die Ausbeute an Arteriolen kann niedrig sein. Um dieses Problem zu umgehen, empfehlen wir, Zentrifugieren netzhautgewebe (10-30 s bei 500 X g) zwischen den einzelnen die Verreibung in Schritten 1.12-1.14 Schritte. Dies oft hilft, um den Ertrag von Schiffen zu verbessern, sondern erhöht auch die Menge der Zelle Ablagerungen innerhalb der Vorbereitung.
Wenn Schiffe für Druck Myographie Studien Metallspirale ist es wichtig, die Arteriolen sorgfältig für jede Seitenäste zu überprüfen, die nah an der Bifurkation wurde gespalten werden kann. Dies ist eine häufige Ursache für Leckage und Druckverlust während der Experimente. Die wichtigste Frage, die mit der [Ca2 +]ich Protokolle entstehen kann ist das Niveau der Farbstoff beladen. Armen Farbstoff Belastung führt zu niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis bei Überlastung führt zu Störungen der normalen Ca2 + Homöostase. Um die Wahrscheinlichkeit, dass diese Aspekte zu reduzieren, kann eine kleine aliquoten von retinalen Homogenat entfernt werden, und isolierte Schiffe überprüft in regelmäßigen Abständen während des laden-Protokolls. Wenn Unternehmen Patch-Clamp Experimente, die Erfolgsquote der Gigaseal Bildung ist stark abhängig von wie gut hat der Basallamina verdaut wurde. Wann kann dieses Protokoll zunächst testen oder mit einer neuen Vielzahl von Enzymen die Konzentration/Dauer Enzym Verdauung anpassen erforderlich. Sehr aufmerksam die Trennung der Endothelzellen und glatten Muskelzellen Schichten sorgen für ausreichende Verdauung genug basale entfernen laminal zugreifen. Sorgfältige Überwachung ist auch notwendig, über Verdauung, zu vermeiden, die manifestieren kann, als das Schiff beginnt zu verengen. In diesem Fall sind die glatten Muskelzellen oft zu schwach für Patch-Clamp-Aufnahme. Bei Anwendung von Enzymen, ist es wichtig einzuschließende DNAse I Sicherstellung Entfernung der Stränge der DNA befreit Geschädigte Zellen bei der Isolierung. DNA-Fragmente sind klebrig und dazu führen, dass die Zange zur Einhaltung der arteriola während der Endphase des Reinigungsprozesses (Schritt 4,4), die oft zum Schiff Verlust. Reinigung von Schiffen ist technisch schwierig und erfolgt am besten bei hoher Vergrößerung (20 X) mit sanft geschwungenen Bewegungen der geschlossenen Zange von der feinsten möglich Kopfkreis. Zwischen fegt reinigen Sie die Zange mit Roll-Labor.
Wie früher war eine wesentliche Motivation hinter der Entwicklung der Protokolle in diesem Manuskript beschrieben, besser zu verstehen, warum Blutfluss während retinalen Gefäßerkrankungen gestört wird. Unsere Arbeit konzentriert sich auf Diabetische Auge Krankheit28,33. Arteriolen können von der Netzhaut der experimentellen Nager-Modelle von Diabetes, die mit den in Abschnitt 1 beschriebenen Methoden isoliert werden. Beim auf isolierte retinalen Arteriolen von diabetischen Tieren zu experimentieren, ist es wichtig zu versuchen, eng der hyperglykämischen Bedingungen, durch die Schiffe in Vivozu replizieren. Aus diesem Grund würden wir normalerweise D-Glukose-Spiegel im unsere Isolation und experimentelle Lösungen für 25 mM erhöhen. Verdickung der vaskulären Keller Membranen ist ein bekanntes Phänomen in der Netzhautgefäße bei Diabetes34,35. Wenn Tiere mit längeren Diabetes (> 1 Monaten Krankheitsdauer) verwenden, sind erhöhte Enzymkonzentrationen oder Verdauung Mal oft erforderlich, um die Anwendung der Patch-Clamp Aufnahmemethoden.
Eine wichtige Einschränkung der Verwendung von ex-Vivo isolierte retinale Arteriolen, retinale vaskuläre Physiologie zu studieren und Pathophysiologie ist der Verlust der umgebenden Netzhaut Neuropile. Zwar Entfernung der Netzhaut glialen und neuronalen Zellen einfachen Zugriff auf die Netzhaut vaskulären glatten Muskelzellen für Zelle Physiologie Studien ermöglicht, kann die Reaktion der Gefäße auf vasoaktive Mediatoren dramatisch in Abwesenheit und Anwesenheit der Netzhaut verändern. Gewebe. Die Aktionen der Adenosin-Tri-Phosphat (ATP), geben Sie beispielsweise, ein gutes Beispiel für diesen Punkt. In isolierten Ratte retinalen Arteriolen, Zugabe von ATP löst eine robuste Verengung der Gefäße36, während in der Gegenwart von einer intakten Neuropile, die Gefäße erweitern sich37. Deshalb, wo immer möglich, wir versuchen in der Regel überprüfen die wichtigsten Ergebnisse unserer isolierten arteriola Präparate mit ex Vivo Netzhaut ganz-Halterungen und in Vivo Messungen des Schiffs Durchmesser und Blut fließen16,37 . Hinweis haben vor kurzem neue Methoden für die Untersuchung kleiner Arteriolen und Kapillaren im gesamten PERFUNDIERTEN porcinen Netzhaut ex Vivo38,39entstanden. Solche Präparate werden voraussichtlich erheblich besser verstehen wie die Netzhaut Neuropile retinalen Arteriolen und Kapillare Ton regelt und wie Veränderungen der Netzhaut Hämodynamik modulieren neuronalen Aktivität in der Netzhaut.
Obwohl in diesem Artikel beschriebenen Verfahren auf die Verwendung von isolierten Ratte retinalen Arteriolen für Verständnis Arteriolen Glattmuskel Zellphysiologie ausgerichtet sind, entwickeln wir derzeit Protokolle, um auch das Studium der endothelial Zelle Funktion aktivieren Diese Schiffe. In Vorarbeiten ist es uns gelungen bei der Modifizierung der enzymatischen Verdauung der retinalen Arteriolen Segmente zu lebensfähigen Endothelzellen Röhren hervorbringen, die Ca2 + Imaging und Patchclamp Aufnahme Studien zugänglich sind. Kanülierung der isolierten Arteriolen an beiden Enden ermöglichen Intraluminal Lieferung von Medikamenten, könnte in Zukunft auch aktivieren Endothel-abhängige gefäßerweiternde Antworten in diesen Gefäßen untersucht werden.

Verstehen, wie der Blutfluss in der Netzhaut gesteuert wird ist ein wichtiges Ziel, da abnormale Blutfluss in der Pathogenese von einer Vielzahl von bedrohlichen Anblick verwickelt hat Netzhauterkrankungen1,2,3, 4. Die retinale Zirkulation, die inneren Netzhaut Neuronen und Gliazellen versorgt, hat eine Ende Arterie Anordnung, mit all dem Blut aus der retinalen Arterien und Arteriolen vorbei durch die Kapillaren der Netzhaut Venolen und schließlich Venen5. Durchblutung der Netzhaut wird durch den Ton der retinalen Arterien und Arteriolen sowie die kontraktilen Aktivität die perizyten befindet sich an den Wänden der retinalen Kapillaren und Post-Kapillaren Venolen6,7, geregelt. 8. die Kontrolle des retinalen Gefäßtonus ist komplex und wird durch eine Reihe von Eingaben aus dem Herz-Kreislauf-System und umliegende netzhautgewebe, Blutgase, zirkulierenden Moleküle und Hormone, einschließlich moduliert und vasoaktive Substanzen freigesetzt aus der Netzhaut vaskulären Endothel und Macroglia9,10,11. Der retinalen Arteriolen sind kleine arterielle Zweige der Netzhaut und bestehen aus einer einzigen Schicht von vaskulären glatten Muskelzellen und ein Innenfutter von längs angeordnet Endothelzellen12,13, 14. diese Schiffe bilden die Haupt-Website der Gefäßwiderstand innerhalb der retinalen Zirkulation und spielen daher eine wichtige Rolle in der lokalen Kontrolle des retinalen Blutflusses. Retinale Arteriolen regulieren Kapillare Durchblutung der Netzhaut durch Erweiterung oder Verengung der luminalen Durchmesser, vermittelt durch Veränderungen der vaskulären glatten Muskelzellen Kontraktilität10,15,16. Das Verständnis der molekularen Mechanismen durch die retinalen Arteriolen regulieren retinaler Perfusion daher Vorbereitungen, erfordert wo die Arteriolen glatten Muskelzellen zugänglich und studierte in Bedingungen so nahe wie möglich physiologische.
Ex-Vivo -Vorbereitungen des isolierten Netzhautgefäße bieten Zugriff auf die vaskulären glatten Muskelzellen Beibehaltung noch ihre Funktionalität und Vernetzung mit dem zugrunde liegenden Endothel. Die meisten Studien bisher mittels isolierter Schiffe konzentrierten sich auf großen Rindern oder Schweinen arteriellen Gefäßen (60-150 µm). Diese können in handelsübliche Draht- oder Myograph Drucksysteme ermöglichen pharmakologische Verhör von vaskulären glatten Muskelzellen Zelle kontraktilen Mechanismen17,18montiert werden. Solche Präparate haben nach unserer Kenntnis der Netzhaut vaskuläre Physiologie unter normalen Bedingungen wesentlich beigetragen. Einige Studien haben retinale Arteriolen isoliert von kleinen Labortieren wie ihre kleineren Durchmesser verwendet (~ 8-45 µm) verhindert den Einsatz in herkömmlichen Myographie Systemen19,20,21,22. Ein wichtiger Vorteil ist jedoch die breite Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten, transgenen und Netzhaut Krankheitsmodelle von mit Schiffen von kleinen Labortieren. Auch sind kleine Versuchstiere zugänglicher für in Vivo Interventionsstudien.
Hier beschreiben wir einfache Protokolle zum isolieren und Metallspirale Ratte retinalen Arteriolen für Druck Myographie Experimente. Ca2 + Imaging und Elektrophysiologie Protokolle mittels diese Schiffe sind auch aufgeführt. Diese bieten weitere Einblicke in die Regulierung der vaskulären glatten Muskelzellen Kontraktilität und Durchblutung der Netzhaut.

<table><tbody><tr><td>Becher</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Einweg-Kunststoffpipette / -transfer</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6 ml ist am besten, aber andere Größen sind akzeptabel; Spitze entfernen, um die Öffnung zu vergrößern</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>Oder irgendein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Jede gleichwertige feine Pinzette</td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>Feuerpoliert, um die Reibung zu verringern, aber nicht genug, um die Spitze zu verengen</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>Oder ein gleichwertiges 10-cm-Produkt</td></tr><tr><td>Pipettensauger</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>Oder irgendein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Gereinigte Wasserversorgung</td><td>Merek</td><td>Milli-Q Integriertes Wasseraufbereitungssystem</td><td>Oder ein gleichwertiges System</td></tr><tr><td>Reagenzglas mit rundem Boden</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; jedes gleichwertige Produkt</td></tr><tr><td>Serattierte Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Einschneidige Klingen</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>Oder eine andere biegsame Oberfläche&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagenzglasgestell</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Druckmyographie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mechanischer 3-Achsen-Manipulator</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2 (oder ein gleichwertiges Produkt)</td></tr><tr><td>3-Wege-Gewindebohrer</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Reinbank</td><td>oder eine gleichwertige</td></tr><tr><td>Produktanalysesoftware&nbsp;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Kostenlose Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>Analyse-Plugin</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>Benutzerdefiniertes Plugin für imageJ Kostenlos zum Download verfügbar</td></tr><tr><td>Kanülenpipettenglas</td><td>World Percision Instrumente</td><td>TW150F-4</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Digitales Thermometer</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Make 1 mM Stock in DMSO</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>Jede gleichwertige feine Pinzette</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Make 1 mM Stock in DMSO</td></tr><tr><td>Aufnahmekammer mit Glasboden</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Helfer Pipettenglas</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Inline-Heizung</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Kommerzielles Äquilaent SH-27B Lösung Inline-Heizung von Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Manometer</td><td></td><td>Riester LF1459</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Sutter instruments</td><td>P97</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Olympus CX 31 Mikroskop</td><td>Glashütte</td><td>Fine Point F-550</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Lieferverteiler&nbsp;</td><td>Automatisieren Sie den wissenschaftlichen</td><td>Perfusionsstift</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Pipettenfüller&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1 ml</td><td>Spritze erhitzt und auf den Innendurchmesser der Pipette gezogen</td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td></td><td>Absaugpumpe Interpet</td><td>AP1</td><td>Umgebaute Belüftungspumpe mit Umkehrbalg</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD Plastipak</td><td>20 mL Luer-lok</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Wolframdraht</td><td>Advent</td><td>W558818</td><td>75&mu; m Durchmesser</td></tr><tr><td>Tygon Schläuche</td><td>VWR</td><td>verschiedene Größen</td><td>Oder jedes gleichwertige Produkt</td></tr><tr><td>USB-Kamera</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Videoaufnahmesoftware</td><td>Hypercam</td><td>Version 2.28.01</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td></td><td>Wasserbad</td><td>Grant Sub Aqua 12 Plus</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>x20 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>x4 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Oder ein beliebiges Produkt gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Y-Verbinder</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Patch-Klemmung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Gewindebohrer</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>mechanischer 3-Achsen-Manipulator</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Clean Bench</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg täglich gelöst in 50 μ; L von DMSO (Sonicate to Dissolve)</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200a</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Analoger Digitalwandler</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>0,1 mg/ml in LCH</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Digitales Thermometer</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>Arbeitsmaterial 1 MU mL-1 (10 MU verdünnt in 10 mL LCH)&nbsp;</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Jedes gleichwertige kommerzielle</td></tr><tr><td>Produkt Feine Pinzette</td><td>Dumont</td><td>Nr. 7</td><td>Jede superfeine Pinzette</td></tr><tr><td>Aufnahmekammer mit Glasboden</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Oder jedes gleichwertige Produkt</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td>Oder jedes gleichwertige Produkt</td></tr><tr><td>Inline-Heizung</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Kommerzielles Äquilavent SH-27B Solution In-Line Heater von Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Sutter instruments</td><td>P97</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Olympus CX 31 Mikroskop</td><td>Glashütte</td><td>Fine Point F-550</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Lieferverteiler&nbsp;</td><td>Automatisieren Sie Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Patching-Software</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp v10.2</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Pipettenfüller&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Spritze erhitzt und auf den Innendurchmesser der Pipette gezogen</td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Protease Typ XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp;</td><td>0,01 mg/ml in LCH</td></tr><tr><td>Einkanal-Pipette Glas</td><td>World Percision Instrumente</td><td>IB150F-3</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Saugpumpe</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Umgebaute Belüftungspumpe mit Umkehrbalg</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Wolframdraht</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50μm m Durchmesser</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>verschiedene Größen</td><td>Jedes gleichwertige Produkt passend für</td></tr><tr><td>USB-Kameras</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Ganzzellenpipettenglas</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>x20 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>x4 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>x40 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>40x/0.55, WD 2.1, &infin;/1.2</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Y-Steckverbinder</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Ca2+ Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Abgriffe</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>3-Achsen mechanischer Manipulator</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Akquisitionssoftware&nbsp;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>Akquisitionsmotor V1.1.5</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt; Mikrofluorimetrie</td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Clean Bench</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Analysesoftware für die konfokale Bildgebung</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Kostenlose Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&nbsp;</td><td>oder ein gleichwertiges Erzeugnis; konfokal</td></tr><tr><td>Digitales Thermometer</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Dumont</td><td>Nr. 7</td><td>Jede superfeine Pinzette</td></tr><tr><td>Aufzeichnungskammer mit Glasboden</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Inline-Heizung</td><td>Maßgeschneiderte</td><td></td><td>kommerzielle Äquilavente SH-27B Lösung Inline-Heizung von Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Invertiert Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt; Mikrofluorimetrie</td></tr><tr><td>Monochromator&nbsp;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>Optoscan</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt; Mikrofluorimetrie</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Verteiler</td><td>Automatisieren Sie den wissenschaftlichen</td><td>Perfusionsstift</td><td>oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Pipettenfüller&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Spritze erhitzt und auf den Innendurchmesser der Pipette gezogen</td></tr><tr><td>Software für Konfokalmikroskop</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF Version 3.3.</td><td>oder ein gleichwertiges Erzeugnis; konfokal</td></tr><tr><td>Absaugpumpe</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Umgebaute Belüftungspumpe mit Umkehrbalg</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Wolframdraht</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50μm; m Durchmesser</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>verschiedene Größen</td><td>Jedes gleichwertige Produkt für</td></tr><tr><td>das Wasserbad</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>x100 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>x100 N.A. 1.3 Öl</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt; Mikrofluorimetrie</td></tr><tr><td>x20 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt; Mikrofluorimetrie</td></tr><tr><td>x20 Objektiv</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt; konfokales</td></tr><tr><td>x4-Objektiv</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt; Mikrofluorimetrie</td></tr><tr><td>x63-Objektiv</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &infin;/0.17/E</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt; konfokale</td></tr><tr><td>Y-Steckverbinder</td><td>Weltgenauigkeit Instrumente</td><td>14012</td><td>Oder ein gleichwertiges Produkt</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td></td><td></td><td>Spezifikationen und Einstellungen für die Herstellung von Pipetten für Experimentierzwecke</td></tr><tr><td>Helper Pipette</td><td>World Percision Instrumente</td><td>IB150F-3</td><td>Innendurchmesser: 0,86 mm Rampe: 261 Druck: 300 Hitze: 280 Zug: 0 Geschwindigkeit: 56 Zeit: 250 Anzahl der Zyklen: 4 Spitzendurchmesser: 0,5-2 &mu; m Polieren: ja Endwiderstand: >10 m&Omega;</td></tr><tr><td>Kanülenpipette</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Innendurchmesser: 1,17 mm Rampe: 290 Druck: 300 Hitze: 280 Zug: 0 Geschwindigkeit: 58 Zeit: 150 Anzahl der Zyklen: 4 Spitzendurchmesser: 3-10 &mu; m Polieren: nein Endwiderstand: < 1 M&Omega;</td></tr>World <tr><td></td><td>Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>Innendurchmesser: 0,86 mm Rampe: 261 Druck: 300 Hitze: 280 Zug: 0 Geschwindigkeit: 56 Zeit: 250 Anzahl der Zyklen: 4 Spitzendurchmesser: 0,5-2 &mu; m Polieren: ja Endwiderstand: >5 m&Omega;</td></tr><tr><td>Ganzzell-Patching</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7,5</td><td>Innendurchmesser: 1,17 mm Rampe: 296 Druck: 200 Hitze: 287 Zug: 0 Geschwindigkeit: 50 Zeit: 250 Anzahl der Zyklen: 4 Spitzendurchmesser: 2-3 &mu; m Polieren: hilfreich, aber nicht notwendig Endwiderstand: 1-2 m&Omega;</td></tr></tbody></table>

isolierung der retinalen arteriolen für ex vivo zelle physiologie studien

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Die Netzhaut ist ein hoch metabolisch aktives Gewebe, die erfordert eine erhebliche Blut-Versorgungsmaterial. Die retinale Zirkulation unterstützt die inneren Netzhaut, während die aderhautgefäße Photorezeptoren liefern. Veränderungen der Netzhaut Perfusion zur zahlreiche Anblick lebensbedrohlichen Erkrankungen, einschließlich diabetischen Retinopathie, Glaukom und retinal Branch Vene Gefäßverschlüsse. Verständnis der molekularen Mechanismen der Kontrolle der Durchblutung der Netzhaut und wie diese geändert werden, während augenfällige Krankheit könnte die Identifizierung neuer Ziele für die Behandlung dieser Bedingungen. Retinale Arteriolen sind die wichtigsten Widerstand Gefäße der Netzhaut, und folglich eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Netzhaut Hämodynamik durch Änderungen in der luminalen Durchmesser. In den letzten Jahren entwickelten wir Methoden zur Isolierung von Arteriolen von der Ratte Netzhaut, die für eine Vielzahl von Anwendungen einschließlich Zelle Physiologie Studien geeignet sind. Dieses Präparat hat bereits begonnen, neue Einblicke in wie Blutfluss wird in der Netzhaut gesteuert und hat uns erlaubt, einige der wichtigsten Änderungen zu identifizieren, die während der okulären Erkrankungen auftreten. In diesem Artikel Wir beschreiben Methoden für die Isolierung von Ratte retinalen Arteriolen und Protokolle für den Einsatz in Patch-Clamp Elektrophysiologie, Kalzium Imaging und Druck Myographie Studien. Diese Schiffe sind auch für den Einsatz in der PCR, western Blot und Immunohistochemistry-basierten Studien zugänglich.

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache Protokoll für die Isolierung von Arteriolen von der Netzhaut der Ratte, die in elektrophysiologische, Kalzium Imaging und Druck Myographie Studien verwendet werden können.

Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Zu verstehen, wie der Blutfluss in der Netzhaut gesteuert wird, ist ein wichtiges Ziel, da ein abnormaler Blutfluss mit der Entwicklung einer Vielzahl von sehgefährdenden Netzhauterkrankungen wie diabetischer Retinopathie, Glaukom und Astvenenverschlüssen in Verbindung gebracht wird. Retinale Arteriolen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des Blutflusses in der Netzhaut, indem sie ihren luminalen Durchmesser erweitern und verengen, was durch Veränderungen in der Kontraktilität der glatten Muskelzellen, die diese Gefäße umgeben, vermittelt wird. Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Regulation der retinalen Perfusion zugrunde liegen, sind daher Präparate erforderlich, bei denen retinale arterioläre glatte Muskelzellen unter möglichst physiologischen Bedingungen zugänglich gemacht und untersucht werden können.In diesem Video zeigen wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung von Arteriolen aus der Netzhaut von Ratten, das in Patch-Clamp-, Calcium-Imaging- und Druckmyographie-Studien verwendet werden kann. In den letzten Jahren wurde dieses Präparat verwendet, um weitere Einblicke in die Regulation der Kontraktilität der vaskulären glatten Muskulatur und des Blutflusses in der Netzhaut sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit zu erhalten. Stellen Sie eine Ein-Liter-Lösung mit niedrigem Kalziumgehalt her, die Hanks'or LCH enthält, wie in der Materialtabelle gezeigt.Montieren Sie die Isolationsausrüstung vor der Entnahme von Gewebe. Die Glaspasteurpipette muss feuerpoliert werden, um die Spitze zu glätten, aber nicht zu verengen. Schneiden Sie eine Kunststoffpipette auf eine Öffnung von etwa fünf bis sieben Millimetern ab.Legen Sie die Augen auf die Sezierschale, die in LCH-Lösung getaucht ist. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Auge an der Schale zu verankern, indem Sie die Orbitamuskelansätze oder den Sehnerv festhalten. Stellen Sie sicher, dass der Verankerungspunkt so nah wie möglich an der Sklera liegt, um das Auge zu stabilisieren.Schneiden Sie mit der Klinge die Hornhaut entlang der Ora serrata durch und entfernen Sie die Linse, indem Sie mit einer Pinzette leicht auf die Sklera drücken. Die kleine, kreisförmige Region, die wir auf diesem Bild im hinteren Teil des Auges sehen, ist der Sehnerv. Schneiden Sie mit der Klinge die Augenmuschel symmetrisch durch die Sehscheibe in zwei Hälften.Bürsten Sie mit einer geschlossenen Pinzette vorsichtig die Netzhaut aus den beiden Hälften der Augenmuschel heraus und achten Sie darauf, alle verbleibenden Ansätze an der Sehscheibe zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Auge und übertragen Sie die präparierten Netzhäute mit der Kunststoffpipette und einem kleinen Tropfen LCH-Medium in das Reagenzglas. Füllen Sie das Reagenzglas mit der Kunststoffpipette auf etwa fünf Milliliter mit LCH und lassen Sie die Netzhaut am Boden des Röhrchens absetzen.Waschen Sie das Tuch etwa dreimal, indem Sie etwa vier Milliliter Lösung aus dem Röhrchen entfernen und mit der Kunststoffpipette frisches LCH hinzufügen. Falls erforderlich, sollte Fremdgewebe entfernt werden. Waschen Sie die Innenseite der Pasteur-Pipette aus Glas mit polierter Spitze mit LCH, um zu verhindern, dass das Gewebe an der Pipette kleben bleibt.Nehmen Sie mit derselben Pipette etwa vier Milliliter Lösung aus dem Reagenzglas und fügen Sie etwa zwei Milliliter frisches LCH hinzu. Dissoziieren Sie die Netzhaut vorsichtig, indem Sie das Gewebe langsam durch die Spitze der Glaspipette ziehen und den Inhalt in das Reagenzglas ausstoßen. Versuchen Sie, in diesem Stadium keine Blasen einzuführen, und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Netzhaut auf die Größe von etwa zwei bis drei Quadratmillimetern aufgebrochen ist.Waschen Sie das Innere der Pipette mit etwa zwei Millilitern LCH und geben Sie dieses in das Reagenzglas. Lassen Sie den Inhalt über fünf bis 10 Minuten auf dem Boden absetzen. Wiederholen Sie den Verreibungsvorgang wie zuvor beschrieben mit etwas mehr Kraft, bis die Gewebestücke etwa einen Quadratmillimeter groß sind.Lassen Sie das Gewebe sich absetzen und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal mit noch mehr Kraft, bis der Inhalt vollständig homogenisiert ist und keine Netzhautstücke mehr übrig sind. Die Lösung sollte in diesem Stadium milchig aussehen. Diese Technik liefert bis zu acht Arteriolensegmente pro Isolierung mit einer Länge von 200 bis 2.500 Mikrometern.Die Kanülierung eines Endes der Arteriole mit einem Verschluss des gegenüberliegenden Endes ermöglicht die Messung der druckinduzierten Vasokonstriktion, die auch als myogene Reaktion bezeichnet wird. Die arterioläre Druckmyographie wird wie folgt durchgeführt. Ein Aliquot des retinalen Homogenats wird in eine physiologische Aufnahmekammer überführt, die auf dem Tisch eines inversen Mikroskops montiert ist.Lassen Sie das Homogenat mindestens fünf Minuten lang auf dem Boden der Kammer absetzen. Scannen Sie visuell durch die Aufnahmekammer, um Arteriolen zu identifizieren, die mehr als 200 Mikrometer lang sind und ein offenes Ende besitzen, durch das das Gefäß kanüliert werden kann. Ankern Sie an einem Ende des Gefäßes mit einer feinen Pinzette und einem kleinen Wolframdrahtstreifen, der über das Gefäß gelegt wird.Manövrieren Sie das Gefäß unter Verwendung der überlappenden Enden des Wolframdrahtes so, dass es horizontal über das Bad verläuft, so dass das offene Ende in einer Linie mit der Druckkanüle liegt. Die Kammer mit null Kalzium-Hanks'bei 37 Grad Celsius durchbluten. Die Kanülierungen werden mit Glaspipetten durchgeführt.Die Kanüle wird mit Hilfe eines feinen Mikromanipulators am offenen Ende des Gefäßes positioniert. Die Spitze wird unmittelbar neben der Öffnung positioniert, wie durch Einstellen der Fokusebene am Mikroskop beurteilt, so dass sowohl das Ende des Gefäßes als auch die Kanülenspitze gleichzeitig scharf sind und die Druckkabine in die Gefäßöffnung vorgeschoben wird. Eine Hilfspipette ist erforderlich, um den Kanülierungsprozess zu unterstützen, und wird verwendet, um die Arteriole sanft zurückzuhalten und die arterioläre Wand über die Druckkanüle zu führen, während die Kanüle gleichzeitig in das Gefäßlumen vorgeschoben wird.Dieses Verfahren erfordert eine gleichzeitige, kontrollierte Bewegung beider Manipulatoren und viel Übung, um eine hohe Erfolgsquote zu erzielen. Nach einer Minute der Aufzeichnung bei null Millimeter Quecksilbersäule wird der intraluminale Druck auf 40 Millimeter Quecksilbersäule erhöht, und das Gefäß sollte sich schnell erweitern, was eine erfolgreiche Kanülierung bestätigt. Die druckinduzierte Vasokonstriktion, also die myogene Reaktion, entwickelt sich anschließend über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten.Die Aufzeichnung von Patch-Clamp-Zellen aus retinalen vaskulären glatten Muskelzellen ermöglicht die Untersuchung der Ionenströme der Plasmamembran, die das intrazelluläre Kalzium und damit die zelluläre Kontraktilität regulieren. Eine Ganzzell- und Einkanalaufzeichnung ist von einzelnen glatten Muskelzellen, die noch in ihren Elternarteriolen eingebettet sind, wie folgt möglich. Die retinalen Arteriolen werden isoliert und mit Wolframdrahtschlickern in der Aufzeichnungskammer verankert.Die Basallamina muss wegverdaut werden, damit eine hochohmige Abdichtung zwischen der Patch-Pipette und der arteriolären glatten Muskelzellmembran gebildet werden kann. Die Arteriolen werden mit einer sequentiellen Reihe von Enzymlösungen bei 37 Grad Celsius überflogen, was auch zu einer elektrischen Entkopplung benachbarter Zellen führt, wie die Pfeile auf dem Bild zeigen. Der Grad der Verdauung wird zunächst anhand der visuellen Trennung von endothelialen und glatten Muskelschichten während des Kollagenase-Schritts bewertet.Die Entfernung aller verbleibenden Stränge der Basallamina und/oder des peripheren Neuropiles wird erreicht, indem die geschlossenen Spitzen der feinen Pinzette vorsichtig über die Oberfläche des Gefäßes gestrichen werden. Für das Patch-Klemmen wird die Spitze der Patch-Pipette vertikal über der interessierenden Zelle positioniert und mit der feinen, langsamen Bewegung des Mikromanipulators allmählich abgesenkt, um Kontakt mit der arteriolären glatten Muskelmembran aufzunehmen. Dies wird anhand der Zellbewegung und einer Änderung des Pipettenwiderstands beurteilt, die mit Hilfe eines Zellversiegelungstestprotokolls in der Erfassungssoftware gemessen werden.Wenn die Pipette auf die Zelle abgesenkt wird, erhöht sich der Dichtungswiderstand um das Fünffache. Auf der Rückseite der Pipette wird vorübergehend Unterdruck ausgeübt, und nach und nach bildet sich ein Gigaseal. Dies erfordert wiederholte Anwendungen von Unterdruck über einen Zeitraum von ein bis fünf Minuten.Für die Ganzzellaufzeichnung wird überwiegend die perforierte Patch-Clamp-Methode verwendet. Mit einer Pipette, die intrazelluläre Lösung und Amphotericin B enthält, wird, wie zuvor beschrieben, ein Gigaseal gebildet. Der Zugangswiderstand wird mit Hilfe des Membrantestprotokolls in der Erfassungssoftware überwacht. Sobald der Zugangswiderstand auf weniger als 15 Megaohm fällt, wird eine Serienwiderstandskompensation durchgeführt.Typischerweise ist es möglich, den Serienwiderstand im perforierten Patch-Modus um ca. 75% zu kompensieren. Spannungsstufen oder Rampenprotokolle können dann verwendet werden, um Ganzzellenströme zu messen. Nach der Dissoziation der Netzhaut können primäre, sekundäre und präkapilläre Arteriolen anhand ihres Kalibers und der Anordnung der vaskulären glatten Muskelzellen identifiziert werden.Die Arteriolen erster und zweiter Ordnung erscheinen in der Hellfeldmikroskopie optisch ähnlich, können aber anhand ihrer Größe unterschieden werden. Die präkapillären Arteriolen sind die kleinsten arteriellen Gefäße in der Präparation und sind durch die intermittierende Anordnung der vaskulären glatten Muskelzellen leicht zu erkennen. Die isolierten Arteriolen können innerhalb der Isolierung deutlich von Kapillaren und Venolen unterschieden werden.Die Kapillaren sind als ein Geflecht aus kleinkalibrigen Gefäßen mit einem Durchmesser von etwa vier bis 10 Mikrometern sichtbar, während die Venolen dünnwandig sind und keine glatte Muskelzellabdeckung aufweisen. Primäre, sekundäre und präkapilläre Arteriolen eignen sich für Druckmyographie, Kalziumbildgebung und Patch-Clamp-Untersuchungen. Mit Hilfe von druckbeaufschlagten Arteriolen haben wir die molekularen Mechanismen untersucht, die an der Entstehung der myogenen Reaktion beteiligt sind.Die Mikroaufnahmen in diesem Bild zeigen eine retinale Arteriole der Ratte zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf eines Druckmyographie-Experiments. Das untenstehende Zeitverlaufsdiagramm zeigt die Änderungen des Gefäßdurchmessers während des gesamten Verlaufs des Experiments. Unmittelbar nach der Druckbeaufschlagung erweitert sich das Gefäß, woraufhin eine aktive myogene Verengung folgt, die nach 15 Minuten ein Steady-State-Niveau erreicht.Die Zugabe von Wortmannin in einer kalziumfreien Hanks-Lösung am Ende des Experiments erweitert das Gefäß zu Normalisierungszwecken auf seinen passiven Durchmesser. Diese Folie zeigt ein Beispiel für eine einkanalige Patch-Clamp-Aufzeichnung einer glatten Muskelzelle der Netzhautarteriole vor und nach der Membrandehnung. Dieses On-Cell-Pflaster enthält zwei dehnungsaktivierte TRPV2-Kanäle, deren Aktivität mit dem Anlegen von Unterdruck auf die Patch-Pipette zunimmt.Die hier beschriebenen Protokolle erfordern Übung, sollten aber mit minimaler Fehlerbehebung erreichbar sein. Wir empfehlen, die isolierten Arteriolen am selben Tag wie die Isolierung zu verwenden. Die Methode ist für retinale Arteriolen der Ratte optimiert, kann aber auch auf die Netzhaut von Mäusen angewendet werden.Nun haben wir dieses Präparat ausgiebig verwendet, aber wo es möglich ist, versuchen wir auch, unsere wichtigsten Ergebnisse mit ex vivo retinalen Ganzhalterungen und in vivo Messungen des Blutgefäßdurchmessers und des Blutflusses zu validieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

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