Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung von Anfallsmechanismen zu beantworten, wie z. B. welche neuronalen Subpopulationen für den Beginn und die Beendigung der elektrografischen Anfälle verantwortlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie elektrografische Anfallsereignisse auf Abruf sowie in vivo- und in-vitro-Modelle reproduzieren kann, die an die klinisch beobachteten erinnern. Diese Technik kann auch verwendet werden, um nach potenziellen Anti-Seizure-Therapien zu suchen, indem versucht wird, elektrografische Anfallsereignisse während der Anwendung verschiedener Anti-Seizure-Kandidaten auszulösen.

Um die kortikalen Scheiben vorzubereiten, kleben Sie das präklinische Hirngewebe mit sofortigem Klebekleber auf die Vibratome-Stufe. Legen Sie den Specimin-Halter vorsichtig in das Pufferfach. Stellen Sie sicher, dass der dorsale Teil des Gehirns der Klinge des Vibratom gegenübersteht.

Schneiden Sie das Gehirn in 450 Mikrometer dicke Abschnitte, in der dorsalen bis ventralen Richtung. Machen Sie den ersten Schnitt im präklinischen Tierhirn, um die olfaktorische Glühbirne zu entfernen. Machen Sie dann nachfolgende Schnitte, bis der somatosensorische Motorbereich beobachtet wird.

Verwenden Sie eine Breitbohrungspipette. Die gezielten koronalen Scheiben in eine Petrie-Schale mit kalter Dissektionslösung geben. Für die koronalen Scheiben, machen Sie einen Querschnitt direkt unter der neokortikalen Kommissure, und dann an der Mittellinie schneiden, um die Hemisphären zu trennen.

Verwenden Sie dann eine neue Rasierklinge, um überschüssiges Gewebe von den Scheiben abzuschneiden. Es ist wichtig, das Gehirn-Slicing-Verfahren effizient durchzuführen. Jeder Moment, in dem das Hirngewebe nicht in ACSF getaucht ist, ist schädlich für seine Qualität.

Beschädigtes, minderwertiges Gehirngewebe ist weniger wahrscheinlich, elektrografische Anfallsereignisse zu erzeugen. Übertragen Sie den dorsalen Teil der koronalen Scheiben, die den Neo-Kortex enthalten, für einen Moment auf eine zweite Petrie-Schale, die mit 35 Grad Celsius ACSF gefüllt ist. Dann übertragen Sie die Scheiben umgehend in eine Inkubationskammer, die 35 Grad Celsius karierte ACSF enthält.

Lassen Sie die Gehirnscheiben leicht in der Inkubationskammer bei 35 Grad Celsius für 30 Minuten untergetaucht. Entfernen Sie dann die Inkubationskammer aus dem Wasserbad und lassen Sie sie auf Raumtemperatur zurückkehren. Warten Sie eine Stunde, bis sich die Gehirnscheiben erholen, bevor Sie elektrophysiologische Aufnahmen durchführen.

Schneiden Sie bei diesem Verfahren Linsenpapier aus, das etwas größer ist als die Gehirnscheibe. Verwenden Sie eine Breitbohrpipette oder eine Detaillierungsbürste, um eine Gehirnscheibe auf das ausgeschnittene Linsenpapier zu übertragen, das mit einer Zahnpinzette an Ort und Stelle gehalten wird. Übertragen Sie dann das Linsenpapier mit einer Gehirnscheibe in die Aufnahmekammer und sichern Sie es mit einem Harfenbildschirm in Position.

Anschließend die Hirnscheibe in der Aufnahmekammer mit kariertem ACSF bei 35 Grad Celsius bei einer Rate von drei Millilitern pro Minute überaus. Verwenden Sie ein digitales Thermometer, um sicherzustellen, dass die Aufnahmekammer 33 bis 36 Grad Celsius beträgt. Dann füllen Sie die Glaselektroden mit 10 Mikroliter ACSF, mit einer Hamilton Spritze.

Führen Sie unter dem 20-fachen Stereomikroskop die Aufnahmeglaselektrode mit manuellen Manipulatoren in die oberflächliche kortikale Schicht, zwei, drei. Sehen Sie sich die elektrische Aktivität der Gehirnscheibe mit Standardsoftware an. Um elektrographische Anfalls-ähnliche Aktivitäten zu induzieren, übereignen Sie die Gehirnscheibe mit ACSF, das 4-AP bei 100 Mikromolaren enthält.

Sehen Sie sich die elektrische Aktivität der Gehirnscheibe mit Standardsoftware an. Um elektrografische anfallartige Ereignisse zu erzeugen, die die optogenetische Strategie auf den Gehirnscheiben von optogenetischen Mäusen verwenden, verwenden Sie einen manuellen Manipulator, um eine optische Faser mit einem Kabeldurchmesser von 1 000 Mikron direkt über dem Aufnahmebereich zu positionieren. Wenden Sie einen kurzen Puls des blauen Lichts an, um ein ictales Ereignis zu initiieren.

Ein benutzerfreundliches MATLAB-basiertes Programm wurde speziell entwickelt, um die verschiedenen Arten von epileptiformen Ereignissen zu erkennen und zu klassifizieren, die in den in vitro- und in vivo 4-AP-Anfallsmodellen auftreten. Dieses Erkennungsprogramm ist über das Valiante Labs GitHub-Repository verfügbar. Die Anwendung von 100 Mikromolaren 4-AP auf hochwertige 450 Mikron große kortikale Gehirnscheiben aus einer juvenilen VGAT-Kanalrhodopsinmaus, die zuverlässig rezidivierende ictalähnliche Ereignisse innerhalb von 15 Minuten induzierte.

Die Anwendung von 100 Mikromolaren 4-AP auf Scheiben von schlechter Qualität, führte zu platzenden Ereignissen oder Spiking-Aktivität. Im Durchschnitt erzeugten 40% der Scheiben aus jedem sezierten präklinischen Gehirn ictalähnliche Ereignisse. Darüber hinaus führten 83 % der sezierten Mäuse zu mindestens einer Gehirnscheibe, die erfolgreich ictalähnliche Ereignisse erzeugte.

In Hirnscheiben mit spontan auftretenden ictalartigen Ereignissen löste die Anwendung eines kurzen 30 Millisekunden-Lichtimpulses auf die Hirnscheibe zuverlässig ein ictalartiges Ereignis aus, das in der Morphologie identisch war. Die gleichen Befunde wurden in Gehirnscheiben von Thy ein Channelrhodopsin zwei Mäuse gemacht. Unabhängig davon, welche neuronale Subpopulation aktiviert wurde, führte also jedes kurze Synchronisationsereignis im isolierten kortikalen neuronalen Netzwerk zum Beginn eines ictalartigen Ereignisses.

Diese ictalartigen Ereignisse bestanden aus einer Sentinelspitze, tonischem Feuer, konisch-ähnlichem Abfeuern und platzartigen Aktivitäten gegen Ende. Sie ähnelten der Natur der elektrographischen Signaturen, die mit klinischen Anfällen verbunden sind. Nach diesem Verfahren, andere Arten von Gehirnzustand Übergänge können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, wie, Was sind die neurobiologischen Mechanismen zugrunde Gehirn Zustand Übergänge?

Und wie können wir diese Übergänge regulieren, um das Eindringen in verschiedene pathologische Hirnzustände zu verhindern?