Name: Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Erfahren Sie die spektrale Reflektometrie zur nanoskaligen Analyse markhaltiger Axone in situ. Diese markierungsfreie Methode ermöglicht quantitative Strukturuntersuchungen im intakten Nervengewebe mit Standard-Konfokalmikroskopen.

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Diese Arbeit wurde durch die Institute der Grundlagenforschung (IBS-R015-D1) und grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch das Ministerium für Bildung (2017R1A6A1A03015642) unterstützt.

Alle chirurgischen Eingriffe wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University angenommen.
1. die Probenvorbereitung
Hinweis: Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor dem Umgang mit Tieren. Führen Sie alle chirurgische Leistung in einem Saal zu chirurgischen Eingriffen. Sterile op Kittel und Handschuhe sollten von allen Personal im OP jederzeit getragen werden.
<ol><li>
Gewebe-Fixierung
	<ol>
<li>Bereiten Sie zwei 10 mL-Spritzen, die jeweils mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer gefüllt.</li>
		<li>7-12-Wochen alten Maus (C57BL/6J oder jede Mauslinien mit beiderlei Geschlechts) durch die Gabe von einer Mischungaus aus Zoletil und Xylazin (1:1, 20 mg/kg) oder eine andere geeignete Anästhesie Regime (z.B., Mischung von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg zu betäuben Xylazin) mit einer intraperitonealen Injektion.</li>
		<li>Sobald die Maus eine chirurgische Ebene der Anästhesie (Nutzung der Zehe Pinch-Response-Verfahren) erreicht hat, setzen Sie das Herz durch das Abschneiden der Haut und den Brustkorb mit einer Schere.</li>
		<li>Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer kleinen Schere Blut ablassen und Durchspülen der PBS und PFA Lösung nacheinander durch die linke Herzkammer mit einer Nadel (Perfusion Rate = 4 mL/min, Volumen = 10 mL für jede Lösung). Hinweis: Die Maus wird steif, wenn der Vorgang erfolgreich abgeschlossen ist. Die Verwendung von Augensalbe oder Sterilisation ist nicht notwendig, da das Verfahren terminal ist. Die Fixierung Verfahren kann übersprungen werden. Dieser Schritt wird jedoch empfohlen, strukturelle Verformungen einschließlich mechanische Gewebeschäden und ischämischen axonale Schwellung zu minimieren. Finden Sie für weitere Details über Gewebe Fixierung im Artikel von Gage, G. J. Et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Gehirns Slice
	<ol>
<li>Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere durch den ventralen Thorax und Abdomen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kopfhaut und Periost mit einer entsprechend kleinen Schere bis vollständig aussetzen des Schädels.</li>
		<li>Brechen Sie die Stirnbein und schneiden Sie das Schädeldach entlang die sagittale Naht aus dem Hinterhauptsbein mit kleine Schere mit Sorgfalt nicht auf das Gehirn schädigen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das Schädeldach und die Dura Mater sequenziell mit feinen Pinzette.</li>
		<li>Extrahieren Sie das Gehirn mit einem weichen Plastiklöffel, kümmert sich nicht um das Gewebe zu beschädigen.</li>
		<li>Spülen Sie und genießen Sie die extrahierte Gehirn in einer 4 % PFA-Lösung für 30 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Schneiden Sie die feste Gehirn in 100-150 µm Abschnitte mit einem Vibratome. Hinweis: Für weitere Details auf der Gewebe-Vorbereitung finden Sie im Artikel von Segev Et al. 11. für nachfolgende Verfahren, das Gewebe sollte werden in Scheiben geschnitten in Abschnitte dünner als die Dicke der Abstandhalter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage des Gehirns Slice
	<ol>
<li>Jedes Gewebe Segment 1 Objektträger und 2 quadratischen Deckgläser (22 × 22 × 0,17 mm) vorbereiten.</li>
		<li>Eines der quadratischen Deckgläser in die Hälfte geschnitten (zwei rechteckige Stücke) mit einem Glasschneider.</li>
		<li>Befestigen Sie die beiden von der halbierten Deckgläser mit einem super-Klebstoff auf die Folie-Glas. Hinweis: Der Abstand zwischen den zwei halbierte Gläser sollte etwas größer als die Größe des Segments Gewebe.</li>
		<li>Ernten Sie die Gehirn-Scheibe mit einem Pinsel oder einer Pipette zu und legen Sie das Gewebe auf der Folie Glas zwischen den Abstandhalter. Achten Sie darauf, nicht das Gewebe Falten.</li>
		<li>100 μl PBS auf der Gewebeoberfläche zu verzichten.</li>
		<li>Legen Sie das Quadrat Deckglas auf der Oberseite des Gewebes. Einschluss von Luftblasen während dieser Phase zu vermeiden.</li>
		<li>Dichtung rund um das Deckglas mit einem Nagellack (oder alternativ geeigneter Klebstoffe) zur Verdampfung des PBS und Verunreinigung durch Staub während der anschließenden Bildbearbeitung Sitzung zu verhindern. Hinweis: In diesem Stadium kann der Experimentator pausieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kalibrierung
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop mindestens 1 h vor der Bildgebung erlauben thermische Stabilisierung des Lasers Quelle (siehe Tabelle der Materialien). Dann schalten Sie die Software für die Spektral Scannen (siehe Tabelle der Materialien) und klicken Sie auf erfassen , auf der Oberseite GUI (Abbildung 3a).
</li>
	<li>Schalten Sie den Software-Auslöser für die Weißlicht-Laser (WLL) und Photomultiplier Tube (PMT) (Abb. 3a).</li>
	<li>Wählen Sie den xyΛ-Modus auf das Drop-Down-Liste im Kauf-Modus, dann der Laser-Eingabemodus automatisch von Konstanten Prozent auf Konstanter Leistunggeändert. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatische SP-Bewegung. Und legen Sie dann die spektrale Fenster Eingabe Laser auf 470-670 nm und die spektrale Schrittweite bis 4 nm auf Λ-Erregung Lambda Scannen Einstellungen (Abb. 3 b).</li>
	<li>Legen Sie die spektrale Bandbreite PMT auf 450-690 durch einen Doppelklick oder verschieben die Schieberegler für Spektralbereich (Abb. 3 c). Hinweis: Diesem Spektralbereich gehören die komplette Bandbreite der Eingangsquelle.</li>
	<li>Wählen Sie ein Eintauchen in Wasser Objektiv passend mit hoher numerischer Apertur (NA > 0,7) und geben einen Wert an die PMT und Laser macht AOBS Konfiguration und Live-Scan -Taste aktivieren. Schalten Sie den Strahlengang durch Reflexion in der AOBS Konfiguration (Abbildung 3d) überprüfen.</li>
	<li>Einen Referenz-Spiegel zu montieren (siehe Tabelle der Materialien) auf den Mikroskoptisch. Die Spiegelfläche sollte gegen das Objektiv konfrontiert werden. Wenn es nicht einfach, den Spiegel auf den Mikroskoptisch zu setzen ist, binden Sie einen Spiegel auf den flachen Teller (z. B. Folie Glas).</li>
	<li>Kontrolle der Mikroskoptisch die Brennebene auf der Spiegelfläche ausrichten.</li>
	<li>Passen Sie die PMT-Verstärkung und die Laserleistung, die unter Berücksichtigung den dynamischen Bereich des Detektors und ändern Sie den Eingabemodus Laser von Konstanten Prozent auf Konstanter Leistung. Hinweis: Wie üblich, eine PMT einen Gewinn von 500 (V) und eine relative Laserleistung von 0,1 % dienen bei 570 nm.</li>
	<li>In einem Pseudo-Farbmodus zu überprüfen, dass es keine Sättigung im gesamten Wellenlängenbereich zu bestätigen. Wenn Sättigung beobachtet wird, senken Sie die Laserleistung (Abb. 3a).</li>
	<li>Laufen Sie mit dem Lambda zu scannen .</li>
	<li>Entfernen Sie den Spiegel von der Bühne, und wiederholen Sie den gleichen Erwerb ohne eine Probe um die dunkle Referenz (d.h. dunkle Versatz) zu erhalten.</li>
	<li>Sichern Sie die Daten in einem Multistacked TIF -Format.</li>
</ol>(3) brange Bildaufnahme
<ol><li>Legen Sie das montierte Gewebe auf Mikroskoptisch. Um etwa das Gewebe auf der Brennebene der Objektivlinse auszurichten, verwenden Sie die Weitfeld-Fluoreszenz-Modus durch ein Okular.</li>
	<li>Mit der Live-Scan auf, Kontrolle der Mikroskoptisch ausrichten die Brennebene auf die Region des Interesses im Gewebe. Um die Hintergrundgeräusche aus dem Deckglas zu vermeiden, wählen Sie die Zielregion mindestens 15 μm Tiefe aus dem Glas-Gewebe-Interface.</li>
	<li>Erwerben Sie die spektrale Bildstapel für die Zielregion mit dem gleichen Verfahren wie in 2.1-2.10 beschrieben.</li>
	<li>Sichern Sie die Daten für das Gewebe und die dunklen Offset im Multistacked TIF -Format. Hinweis: In diesem Stadium kann der Experimentator pausieren.</li>
</ol>4. Verarbeitung und Analyse von Bildern
<ol><li>Öffnen Sie die spektralen Daten (multistacked TIF) für den Referenz-Spiegel und das Hirngewebe in ImageJ.</li>
	<li>Wählen Sie die ROIs (Regionen von Interesse) für das geöffnete Bild Stacks – den zentralen Bereich für den Referenz-Spiegel und das Segment von einem Axon Faser für das Hirngewebe.</li>
	<li>Die rohen Spektren für die ausgewählten ROIs durch laufende Bild → Stapel → erwerben Plot z-Profil im Menü ImageJ.</li>
	<li>Öffnen Sie die dunklen Offset Daten, eine für den Referenz-Spiegel und die anderen besessenen für das Hirngewebe genommen.</li>
	<li>Erwerben Sie die Spektren für die dunklen Offsets von laufenden Bild → Stapel → Plot z-Profil im Menü ImageJ.</li>
	<li>Speichern Sie alle erworbenen Spektren mittels Kopieren und Einfügen -Optionen. Hinweis: Für die brange Bildgebung ist die zentrale Bildfeld einfallenden optische Aberrationen minimieren empfohlen. Die Axon-Fasern können strukturell heterogenen entlang ihrer Länge sein. Daher empfiehlt sich den ROI auf einem kleinen Axon-Segment auswählen, in der Regel < 5 µm, teilweise-Volumen Artefakt zu minimieren.</li>
</ol>5. Basislinienkorrektur und brange Signalanalyse
<ol><li>Subtrahieren Sie die Offset Spektren aus den Spektren des Referenz-Spiegels und das Hirngewebe.</li>
	<li>Jedes Spektrum durch die Aufteilung der maximalen Intensität des Spektrums zu normalisieren.</li>
	<li>Teilen Sie das normalisierte Spektrum des Axons durch die normalisierten Spektrum des Referenz-Spiegels und subtrahieren Sie DC-Offset aus dem normalisierten Spektrum.</li>
	<li>Messen Sie die Wellenzahl Frequenz durch den Einbau der erworbenen Spektrum an einer sinusförmigen Kurve (siehe Tabelle der Materialien) und dann konvertieren Sie die erworbenen Wellenzahl, Periodizität durch Einnahme von Gegenseitigkeit.</li>
	<li>Konvertieren Sie die Wellenzahl Periodizität in den Axon Durchmesser unter Verwendung der Gleichung in Abbildung 4 c.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren erklären konkurrierende Interessen: J. Kwon und M. Choi sind Erfinder der zum Patent angemeldete Technologie in diesem Artikel beschrieben.

Brange ist eine neue markierungsfreie imaging-Modalität basierend auf spektrale Interferometrie, die zum ersten Mal im Leben Markhaltige Axone der nanoskaligen Informationen bietet. In der aktuellen Übernahme-Protokoll ist die räumliche Auflösung für den Axon Durchmesser des Ordens 10 nm. Darüber hinaus nutzt brange der Größenordnungen niedriger Lichtdosis im Vergleich zu anderen super-Resolution-Microscopies; Somit ist es frei von Phototoxizität und Immunofluoreszenz. Brange böte eine neue Allee für nanoskalige Dynamik ...

In den Säugetieren Nervensystem bietet Myelin rasche Nervenleitung und axonalen Integrität durch hüllt die Axon-Fasern mit vielschichtigen häutigen scheiden. Seine vielschichtige Struktur besteht aus abwechselnd nanoskaligen Dünnschichten bestehend aus Plasmamembranen (~ 5 nm), Zellflüssigkeit (~ 3 nm), und extrazellulären Raum (~ 7 nm)1,2. Optische Mikroskopie, einschließlich der jüngsten Höchstauflösung Mikroskopie, eignen sich nicht für die Beobachtung der nanoskaligen Myelin Dynamik aufgrund ihrer unzureichenden Auflösung aufgrund der optischen Beugung3,4,5. Obwohl Elektronenmikroskopie feine Details der Myelin Nanostruktur bereitstellen können, ist es nicht kompatibel mit den lebenden biologischen Systemen aufgrund sehr invasive Probe Vorbereitungen mit chemischen Fixierung und Ultrasectioning6,7 . Bis vor kurzem gab es keine Technik anwendbar, nanoskaligen Dynamik der Markhaltige Axone in Situzu beobachten.
Schain Et Al. berichtete zuvor, dass Markhaltige Axone bunte Lichtreflexion8aufweisen. Durch die Annahme der Spektralanalyse auf das reflektierte Licht, haben wir eine neue bildgebende Modalität für nanoskalige Bildgebung Markhaltige Axone, benannt spektrale Reflectometry (brange)9entwickelt. Brange basiert auf der Dünnschicht-Störungen, die in den mehrschichtigen Aufbau der Myelinscheide (Abbildung 1). Durch optische Simulation auf verschiedenen Axone haben wir gezeigt, dass das Reflexionsvermögen-Spektrum eine periodische Funktion der Wellenzahl und seiner Periodizität ist (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) ist umgekehrt proportional zu den Axon-Durchmesser (d). Diese einfache Beziehung (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) bietet einfache Quantifizierung der Axon Durchmesser aus den Daten der brange. Nutzen dies, offenbart wir das vorherrschende Axon prall unter milden traumatischen Hirnverletzungen in unserem vorherigen Bericht.
Die brange System basiert auf konfokalen Mikroskopie und besteht aus einer speziellen Laserquelle und Filter (Abbildung 2). Die Eingabequelle ist ein Weißlicht-Laser, Breitband spektrale Leistung für Infrarot-Regionen sichtbar. Für die Spektral Scan, das System ist ausgestattet mit zwei Akusto-optische Geräte: ein Akusto-optischen Durchstimmbare Filter (Aventurien) für die Bereitstellung einer ausgewählten Wellenlänge von Breitband-Eingangsquelle und eine Akusto-optischen Strahlteiler (AOBS) für die Führung der ausgewählten reflektiert Wellenlänge zum Detektor. Die Software für die Hyperspektrale konfokalen Mikroskopie bietet (siehe Tabelle der Materialien) eine anpassbare spektrale Scanoption nacheinander die Reflexion Bilder bei verschiedenen Wellenlängen Eingang erwerben. Darüber hinaus können die chromatische Aberration kritisch in der spektralen Messung beeinträchtigen. Daher ist ein Apochromat Objektiv empfohlen.
Der Hinweis Weißlicht-Laser erzeugen eine ungleichmäßige spektrale Leistung und die optischen Komponenten beeinflussen auch die spektrale Profil. Daher müssen die erworbenen Spektren für die anschließende Quantitative Analyse kalibriert werden. Eine geschützte Silberspiegel dient in der Regel als Referenz, die eine nahezu konstante Reflexion (&gt; 97 %) bietet über den vollen und sichtbaren Bereich. Die erworbenen Spektren werden dann durch die Referenz-Spektren aus dem Spiegel unterteilt.
Die spektrale Schrittweite für die Spektral Scan bestimmt die Geschwindigkeit, Erwerb; Es muss daher optimiert werden. Wie eine größere Axon eine höhere spektrale Periode wurde, erfordert es feiner spektrale Probenahme. Zum Beispiel hat ein Axon mit einem Durchmesser von 10 µm, eines der größten physiologischen Axone spektrale beträgt ca. 8 nm. Nach Nyquist Sampling Kriterien, wir Beschäftigten die spektrale Samplingintervall von 4 nm um die physiologischen Axone in die Maus Nervengewebe zu decken. Dieser Ansatz dauert in der Regel über mehrere Sekunden für eine volle spektrale Scan und damit ist nicht geeignet für in-Vivo Anwendungen, wo stört die physiologische Bewegung (z.B. Atmung und Herzschlag) stabile spektralen Erwerb. Wir lösten vorher dieses Problem durch Instrumentieren maßgeschneiderte aufrechte Mikroskop, entworfen, um das gesamte Spektrum für jeden Punkt mit einem Array Spektrometer (Erwerb Geschwindigkeit ≈ 30 ms pro Pixel) zu erwerben.
In diesem Bericht beschreiben wir ein detailliertes Protokoll auf der brange Bildgebung auf einer festen Gehirn-Scheibe, die in einem kommerziellen Hyperspektrale Mikroskop ausgeführt werden können (siehe Tabelle der Materialien). Somit kann das Protokoll von Experimentatoren ohne Fachkenntnisse in optischen Instrumenten erfolgen. Wir decken auch die potenziellen Probleme und Problembehandlung für Erfassung und Analyse von Daten der brange.

<table><tbody><tr><td>Glasschneider</td> <td>-</td><td></td> <td>Kann in einem örtlichen Supermarkt oder in Online-Shops gekauft werden.</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td></td> <td>-</td> <td>Kann in einem örtlichen Supermarkt oder in Online-Shops gekauft werden.</td></tr><tr><td>Apochromat-Objektiv 40-fach, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Wasser-Immersionstyp</td></tr><tr><td>Fluormyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternativ kann Fluoromyelin Red (F34652) verwendet werden.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td> Weitere <td>Informationen finden Sie unter "Konfiguration des Mikroskops" im Abschnitt Einführung.</td></tr><tr><td>Imaging-Software</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Beschichtet mit geschütztem Silber.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136-Paraformaldehyde</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Dicke: #1 (0,13 bis 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Objektträgerglas</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Dicke: ~1 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Verwenden Sie ein Dosiergerät, um Haut- oder Augenkontakt zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL-Vibratome</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td></td> <td>VT1200S-Weißlichtlaser</td></tr> <tr><td></td><td>NKT Photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 wurde abgekündigt und durch EXU-6 ersetzt.</td></tr></tbody></table>

spektrale reflectometric mikroskopie auf markhaltige axone in situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In einem Säugetier Nervensystem bietet Myelin eine elektrische Isolierung durch hüllt die Axon-Fasern in einer vielschichtigen Spirale. Inspiriert durch seine hoch organisiert subzelluläre Architektur, entwickelten wir vor kurzem eine neue bildgebende Modalität, benannt spektrale Reflectometry (brange), die noch nie da gewesenen markierungsfreie nanoskaligen Bildgebung von live Markhaltige Axone in Situermöglicht. Das Prinzip beruht auf nanostruktureller Auskunft durch die Analyse der Reflexion Spektrum der vielschichtigen subzelluläre Struktur. In diesem Artikel beschreiben wir ein detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Durchführung einer grundlegenden brange Bildgebung der nervösen Gewebe mit einem kommerziellen konfokale mikroskopische System, ausgestattet mit einem Weißlicht-Laser und einen durchstimmbaren Filter. Wir decken die Verfahren der Probenvorbereitung, Erwerb von Spektraldaten und Bildverarbeitung für nanostruktureller Informationsbeschaffung.

Nach dem Protokoll wurde eine feste Gehirn-Scheibe mit exogenen beflecken, einem Myelin-targeting Fluorophor vorbereitet (siehe Tabelle der Materialien). Brange Bildgebung erfolgte auf die Gehirn-Scheibe mit einem kommerziellen Hyperspektrale confocal Mikroskop in Verbindung mit konfokale Fluoreszenz imaging (Abb. 4a). Für brange wurde Eingangs optischen Intensität auf 5 µW/µm2 mit einer Pixel-Verweilzeit von ~ 1 µs festgelegt. Die...

Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt für Schritt Protokoll für imaging Markhaltige Axone in einer festen Gehirn-Scheibe mit imaging-Technik basierend auf spektrale Reflectometry markierungsfreie Nanobereich.

Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen im Myelinbereich zu beantworten, wie z. B. Myelinplastizität und Demyelinisierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Nanostruktur von myelinisierten Axonen in intaktem Hirngewebe ohne komplexe Markierung oder Probenvorbereitung ermöglicht. Hier werden wir die Anwendung in einem Gehirnschnitt demonstrieren, aber diese Technik kann auf lebende Tiere ausgeweitet werden.Nach dem Fixieren und Schneiden des Gehirngewebes der Maus gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie für jede Gewebescheibe einen Objektträger und zwei Deckgläser vor. Schneide mit einem Glasschneider eines der quadratischen Deckgläser in zwei Hälften. Stelle dann einen Abstandshalter her, indem du die beiden Teile mit Sekundenkleber auf der Glasschiene befestigst.Entnehmen Sie mit einem Pinsel oder einer Pipette eine Gehirnscheibe und legen Sie das Gewebe auf einen Objektträger zwischen den Abstandshalter, wobei Sie darauf achten, dass das Gewebe nicht gefaltet wird. Geben Sie 100 Mikroliter PBS auf die Gewebeoberfläche. Platzieren Sie dann das zweite quadratische Deckglas auf der Oberseite des Taschentuchs und vermeiden Sie dabei das Eindringen von Luftblasen.Verwenden Sie Nagellack, um das Deckglas abzudichten, um eine Verdunstung von PBS und eine Kontamination durch Staub während der anschließenden Bildgebungssitzung zu verhindern. Schalten Sie das Mikroskop mindestens eine Stunde vor der Bildgebung ein, um eine thermische Stabilisierung der Laserquelle zu ermöglichen. Schalten Sie dann die Software für spektrales Scannen ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" oben in der GUI.Schalten Sie den Software-Shutter für den Weißlichtlaser und die Photomultiplier-Röhre ein. Wählen Sie unter Erfassungsmodus den XY-Lambda-Modus in der Dropdown-Liste aus. Der Lasereingabemodus wird dann automatisch von konstantem Prozentsatz auf konstante Leistung umgestellt.Deaktivieren Sie unter Lambda-Anregung, Lambda-Scan-Einstellungen, das Kontrollkästchen für die automatische SP-Bewegung und stellen Sie das Spektralfenster für den Eingangslaser auf 470 bis 670 Nanometer und die spektrale Schrittweite auf vier Nanometer ein. Stellen Sie den Spektralbereich von PMT auf 450 bis 690 Nanometer ein, indem Sie auf den Spektralbereich doppelklicken oder die Einstellleiste verschieben. Wählen Sie ein Wasserimmersionsobjektiv mit einer hohen numerischen Apertur.Geben Sie der PMT- und Laserleistung einen beliebigen Wert, um die AOBS-Konfigurations- und Live-Scan-Taste zu aktivieren. Wechseln Sie unter AOBS-Konfiguration zum optischen Pfad, indem Sie die Reflexion überprüfen. Montieren Sie als Nächstes einen Referenzspiegel auf dem Tisch des Mikroskops, wobei die Oberfläche zur Objektivlinse zeigt.Wenn es nicht einfach ist, den Spiegel auf den Mikroskoptisch zu stellen, kleben Sie einen Spiegel auf die flache Platte. Stellen Sie den Tisch des Mikroskops so ein, dass die Brennebene an der Spiegeloberfläche ausgerichtet ist. Passen Sie dann die PMT-Verstärkung und die Laserleistung unter Berücksichtigung des Dynamikbereichs des Detektors an.Überprüfen Sie unter einer Pseudofarbe, ob im gesamten Wellenlängenbereich keine Sättigung vorhanden ist. Wenn eine Sättigung beobachtet wird, verringern Sie die Laserleistung. Führen Sie dann die Lambda-Scan-Erfassung aus.Nehmen Sie den Spiegel vom Tisch und wiederholen Sie die gleiche Aufnahme ohne Probe, um die dunkle Referenz zu erhalten. Speichern Sie die Daten dann in einem mehrfach gestapelten TIF-Format. Um die SpeRe-Bildaufnahme durchzuführen, legen Sie das gefasste Gewebe auf den Tisch des Mikroskops.Um das Gewebe grob auf die Brennebene der Objektivlinse auszurichten, verwenden Sie über ein Okular den Weitfeld-Fluoreszenzmodus. Wenn der Live-Scan eingeschaltet ist, steuern Sie den Tisch des Mikroskops, um die Brennebene auf den interessierenden Bereich im Gewebe auszurichten. Um Hintergrundgeräusche durch das Deckglas zu vermeiden, wählen Sie einen Zielbereich von mindestens 15 Mikrometern Tiefe aus der Glasgewebegrenzfläche.Erfassen Sie den spektralen Bildstapel für den Zielbereich mit dem gleichen Verfahren, das zuvor in diesem Video gezeigt wurde. Speichern Sie dann die Daten für das Gewebe und den dunklen Offset im mehrfach gestapelten TIF-Format. Um die Bilder in ImageJ zu verarbeiten, öffnen Sie die Spektraldaten für den Referenzspiegel und das Hirngewebe.Wählen Sie die ROIs für die geöffneten Bildstapel, den zentralen Bereich für den Referenzspiegel und das Segment einer Axonfaser für das Hirngewebe aus. Führen Sie dann das Z-Achsen-Profil aus, stapeln und plotten, um die Rohspektren für die ausgewählten ROIs zu erfassen. Die Axonfasern können entlang ihrer Längen strukturell heterogen sein, daher wird empfohlen, den ROI auf einem kleinen Axonsegment von typischerweise weniger als fünf Mikrometern zu wählen, um Teilvolumenartefakte zu minimieren.Öffnen Sie die Dunkelversatzdaten, von denen eine für den Referenzspiegel und die andere für das Hirngewebe aufgenommen wurde, und stellen Sie das Profil der Z-Achse wie gerade gezeigt dar. Verwenden Sie dann die Optionen Kopieren und Einfügen, um alle erworbenen Optionen zu speichern. Um die Basislinienkorrektur und die SpeRe-Signalanalyse durchzuführen, subtrahieren Sie die Offset-Spektren von den Spektren des Referenzspiegels und des Gehirngewebes.Normalisieren Sie jedes Spektrum, indem Sie die maximale Intensität des Spektrums dividieren. Geben Sie die Wellenzahl ein, indem Sie den Kehrwert der im Experiment verwendeten Wellenlänge nehmen, normalisieren Sie das Spektrum des Axons, indem Sie das des Referenzspiegels dividieren, und subtrahieren Sie den Gleichstromversatz vom normalisierten Spektrum. Und dann erhalten Sie die Wellenzahlfrequenz, indem Sie das erfasste Spektrum an eine Sinuskurve anpassen.Wandeln Sie die erfasste Wellenzahlfrequenz in Periodizität um, indem Sie den Kehrwert nehmen und die Wellenzahlperiodizität mit der hier gezeigten Gleichung in den Axondurchmesser umwandeln. In diesem Experiment wurden fixierte Hirnschnitte fluoreszenzgefärbt gegen Myelin und die SpeRe-Bildgebung mit einer Lichtdosis durchgeführt, die eine Größenordnung niedriger war als bei der herkömmlichen konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Das SpeRe-Signal wurde entlang des Zentrums der myelinisierten Axone lokalisiert, wie von der Geometrie der optischen Reflexion erwartet.Aus dem Reflexionsspektrum eines Axonsegments wurde die Wellenzahlperiodizität erhalten, die anschließend in den Axondurchmesser umgerechnet wurde. Diese Grafik zeigt ein transversales Profil der Fluoreszenzintensität aus dem hier geschachtelten Bereich, und es wurde festgestellt, dass der von SpeRe gemessene Durchmesser in guter Übereinstimmung mit der fluoreszenzbasierten Messung ist. Die SpeRe-Bildgebung basiert auf optischer Reflexion.Daher kann ein Deckglas auf Kieselsäurebasis erhebliche Hintergrundgeräusche verursachen. Bei der Optik war das Hintergrundrauschen erheblich, wenn die Abbildungstiefe vom Deckglas weniger als fünf Mikrometer betrug, wurde jedoch vermieden, wenn die Abbildungstiefe mehr als 15 Mikrometer beträgt. Der Kalibrierungsschritt ist nicht für jedes Experiment erforderlich, wird aber mindestens einmal pro Woche empfohlen.Sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist, kann das Bildgebungsverfahren in der Regel innerhalb von 20 Sekunden für jedes Sichtfeld abgeschlossen werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die dynamische Latenz des Detektors für die Abtastung von Vollspektren zu berücksichtigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Nanostruktur aus myelinisierten Axonen mithilfe von Reflexionsbildern erhalten können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Quelle: Kwon, J., et al., Spektralreflektometrische Mikroskopie an myelinisierten Axonen in situ.  J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video demonstriert die Verwendung der spektralen Reflektometrie mit einem hyperspektralen konfokalen Mikroskop zur Analyse von Interferenzmustern und zur Bestimmung myelinisierter Axondurchmesser in fixierten Hirngewebeschnitten.

Verwendung der spektralen Reflektometrie zur Bestimmung myelinisierter Axondurchmesser in einem fixierten Maushirnschnitt

Quelle: McCullagh, E. A., et al. Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Hirnschnitten. J. Vis. Exp. (2022)Das Video zeigt die Fluoreszenz und die Bildgebung der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) zur Visualisierung der neuronalen Architektur im Hirngewebe von Nagetieren. Die Nissl-Färbung markiert Zellkörper durch Bindung an ribosomale RNA, während die CARS-Bildgebung durch laserinduzierte Signale auf lipidreiches Myelin...

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie zur Visualisierung myelinisierter Neuronen im Hirngewebe von Mäusen

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zwei-Photonen-Anregungs-Zeitraffermikroskopie verwendet, um gleichzeitig die Dynamik von Axon- und Myelinverletzungen in Echtzeit zu visualisieren. Dieses vorgeschlagene Protokoll ermöglicht die Untersuchung sowohl intrinsischer als auch extrinsischer Faktoren, die das Schicksal des zentralen myelinisierten Axons nach einer Verletzung beeinflussen und zu einer dauerhaften klinischen Behinderung beitragen können.

Ein Ex vivo Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung von Motoneuron-Projektion und Axon Arborization in transgenen Hb9::GFP -Maus-Embryonen. Nach Immunostaining für Motoneuronen verwendeten wir Fluoreszenz lichtblattmikroskopie Bild Embryonen für anschließende Quantitative Analyse. Dieses Protokoll gilt für andere Neuron Navigation Prozesse in das zentrale Nervensystem.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Die Visualisierung der Myelinisierung ist ein wichtiges Ziel für viele Forscher, die das Nervensystem untersuchen. CARS ist eine Technik, die mit der Immunfluoreszenz kompatibel ist und nativ Lipide in Geweben wie dem Gehirn abbilden kann, die spezialisierte Strukturen wie Myelin beleuchten.

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Gehirnschnitten

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell der Multiplen Sklerose. Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Bewertung von Rückenmarksentzündungen, Demyelinisierung und axonalen Verletzungen bei EAE. Darüber hinaus wird eine Methode zur Quantifizierung des löslichen Neurofilament-Lichtspiegels im Mäuseserum vorgestellt, die die Beurteilung der axonalen Schädigung in lebenden Mäusen erleichtert.

Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen des Zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Erfahren Sie die spektrale Reflektometrie zur nanoskaligen Analyse markhaltiger Axone in situ. Diese markierungsfreie Methode ermöglicht quantitative Strukturuntersuchungen im intakten Nervengewebe mit Standard-Konfokalmikroskopen.

Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ

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