Name: Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die native Massenspektrometrie zur Analyse von Protein-Komplexen und Ligandenbindungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung biomolekularer Strukturen in ihrem nativen Zustand mit hoher Empfindlichkeit.

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Wir möchte Karl-Peter Hopfner und Robert Thomas Byrne danken für die freundliche Bereitstellung von HerA und HerA-NurA Proteinproben und für ihre Hilfe mit experimentellen Design. Wir danken Dr. Eamonn Reading für seine Überarbeitung des Manuskripts. Wir dankbar anerkennen unsere Fördereinrichtungen: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] und der Royal Society [RG150216, A.P.].

Keine Interessenkonflikte erklärt.

MS spielt eine zunehmend wichtige Rolle bei der Charakterisierung der Stöchiometrie, Interaktionen und Untereinheit Architektur von Proteinkomplexen. IM-MS Daten können verwendet werden, topologische Arrangements von Untereinheiten innerhalb von Mehrkomponenten-komplexe zu definieren. Im Vergleich zu anderen bestehenden Strukturbiologie, hat MS mehrere Vorteile. Native MS ist eine schnelle und hochempfindliche Technik und kann verwendet werden, um heterogene Proteinproben Sonde. Zusammen mit in-Lösung Störung Experimente können Dissoziation Wege Protein Baugruppen überwacht werden. Zusammen mit Kristallstrukturen oder Homologie Modelle das Informationsangebot von strukturellen MS bietet ein Tool für die Untersuchung von Protein-Ligand-Interaktionen und bieten fast nativer Modelle und Montage Wege11.
Hier beschreiben wir die erforderlichen experimentellen Verfahren zur Analyse der Stöchiometrie und Zusammensetzung der Protein-Ligand-Interaktionen, mit einem oder mehreren Liganden mit integrativen MS. Dazu gehören MS Probenvorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse und die Integration von MS-Daten mithilfe von Berechnungswerkzeuge. Um dies zu tun, verwendeten wir die DNA-Resektion HerA-NurA Hetero-Oligomere Proteinkomplex, verpflichtet, drei Liganden (DNA, ATP und ADP), als unser Modellsystem. Das Protokoll zeigt die Verwendung der derzeit verfügbaren Software zur Datenanalyse und Präsentation.
Erwerb von hochwertigen Spektren ist wichtig für Ligand verbindliche Analyse, daher sind sorgfältige Vorbereitung Beispielschritte kritisch, einschließlich Proteinreinigung, Liganden Titration und Buffer Tausch. Eine Einschränkung der nESI ist native MS als Ligand Binding studierte unspezifischen Bindung. Unspezifische Bindung tritt während der zugeführten Tropfen während der Elektrospray-Prozesses. Dies erhöht die Liganden-Konzentration und verändert daher die Protein/Liganden Verhältnis29. Die Bindung von Nukleotiden führt zu einer relativ geringen Massendifferenz zwischen Apo und Nukleotid-gebundenen Protein, das sich nicht, die Ionisation Effizienz50,51 ändert.
Wir nutzten die Synapt G2-Si MS-System für unsere Arbeit, aber die Protokolle gelten für verschiedene Untersuchungen von anderen Protein-Ligand-komplexen mit anderen im Handel erhältlichen Nano-Elektrospray-Massenspektrometer. Integrative strukturelle MS spielt zunehmend eine wichtige Rolle im Hinblick auf biologische Probleme der größeren Komplexität. Der Workflow und die hier beschriebenen Methoden eignen sich für das Verständnis der strukturellen Konsequenzen und Mechanismen der Proteinkomplex und Protein-Ligand-Bildung, die sonst schwer zu studieren, mit herkömmlichen strukturelle Techniken sind Gebäude .

Native massenspektrometrische Analyse von intakten Proteinen und ihre komplexe erfolgt mit Electrospray und Nano-Elektrospray-Ionisation (nESI), die Proteinfaltung zu bewahren und nicht-kovalente Wechselwirkungen während der Ionisation Prozess1, 2. In native MS die Struktur der Proteine und ihre komplexe in einem in der Nähe von nativen Zustand in der Gasphase3,4festgehalten. Native MS erkennt mehrere geladene Protein-Ionen, die nach ihrer Masse Verhältnis (m/Z), so dass die Masse des Eiweiß oder Protein-Ligand laden getrennt sind komplexe berechnet werden. Diese Information ermöglicht die Bestimmung der einer intakten Proteins Stöchiometrie, Untereinheit Zusammensetzung Ligand-Bindung und Interaktion Netze3,4,5,6. Native MS hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen Techniken solche Röntgenkristallographie und magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie-5. Erstens ist native MS eine schnelle und hochempfindliche Technik erfordert nur wenige Mikroliter (2-3 µL) der Probe bei relativ niedrigen komplexe Endkonzentrationen im hohen nM zu niedrigem µM Bereich6. Zweitens kann native MS verwendet werden, um heterogene Proteinproben macht es möglich, mehrere Proteine und Oligomere Staaten gleichzeitig analysieren zu verhören. Drittens erfordert die native MS keine Proteinproben vor der Analyse durch chemische Vernetzung oder Protein Kennzeichnung geändert werden. Diese Vorteile haben strukturelle MS ein leistungsfähiges Werkzeug für die strukturelle Untersuchung von Proteinkomplexen gemacht.
Native MS kombinierbar mit IONENBEWEGLICHKEIT (IM), eine Technik, die die Zeit misst braucht eine Eiweiß-Ionen durch ein elektrisches Feld, Reisen ermöglichen die Elektronenstruktur Querschnitt (CCS) bestimmt werden. CCS bietet mit niedriger Auflösung Strukturinformationen, die Topologie und Konformationsänderungen Heterogenität Informationen von Proteinen zu erreichenden ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung von Protein Strukturmodelle durch rechnerische Ansätze generiert.
Gasphase proteinstabilität kann mit Kollision induzierte Entfaltung (CIU) gemessen von IM-MS untersucht werden. Während des Prozesses CIU sind Eiweiß-Ionen beschleunigt und aktiviert durch erhöhte Beschleunigung Kollisionen mit einem inerten Puffer Gas innerhalb eines Massenspektrometers7,8,9. Diese Elektronenstruktur Aktivierung bewirkt, dass das Protein zu teilweise entfalten, was zu einem Anstieg der CCS übersetzt. Diese Änderung in CCS und die Energie für das Protein entfalten kann, gemessen IM-MS. mithilfe dieses Ansatzes, die Wirkung der Liganden bindend proteinstabilität kann gemessene10. Subcomplexes können in Lösung mit in Lösung Störung Methoden wie die Zugabe von organischen Lösungsmitteln, Native-ähnlichen Topologien von Proteinkomplexen überwachen generiert werden. Störung der Proteinkomplexe ist vor allem wegen der Störung der Intra nicht-kovalente Wechselwirkungen. Die Sub-komplexe Native-ähnlichen Topologien zu erhalten und bei MS-Detektion, Aufschluss über Inter Untereinheit Konnektivität.
Integrative Ansätze in der Strukturbiologie kombinieren verschiedene Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik der Proteine und ihre komplexe3,4,5,6. Native MS und IM-MS wurden verwendet, um die molekularen Details anspruchsvolle biologische Systeme zu entdecken. Es wurden mehrere Beispiele von Anwendungen, einschließlich der Untersuchung von Protein Montage Wege11,12,13,14, Studium der Proteinprotein Interaktion Netze15 , 16 , 17, Membran Proteine6,18,19,20,21und Protein-Ligand-Interaktionen wie Nukleinsäuren22,23 ,24.
Native MS hat jedoch auch seine Grenzen. Native MS-Messungen erfolgen oft in flüchtigen Puffer wie wässrigen Ammoniumacetat, in denen einige Proteine nicht ihre gefalteten nativen Zustand3,25 behalten. Dennoch hat die jüngsten Arbeiten gezeigt, dass diese Einschränkung kann, durch die Optimierung überwunden werden des Sprühens Nadel Kopfkreis (Tipps, 0,5 mm), so dass Eiweiß und Protein-Komplex-Ionen direkt aus einem nichtflüchtigen Puffern mit hohen Ionenstärke gebildet werden können, die besser die physiologische Umgebung26zu imitieren. Darüber hinaus nutzt native MS Electrospray ionisieren und nicht-kovalente Baugruppen aus Lösung in der Gasphase übertragen; Daher kann die relative Häufigkeit der erkannten komplexe nicht vollständig in Lösung5,27darstellen. Darüber hinaus im Vergleich zu in Lösung, die Gas Phase hydrophobe Wechselwirkungen schwächer und elektrostatische Wechselwirkungen stärker geworden und daher3,28begünstigt.
In diesem Artikel bieten wir Protokolle, Datenanalyse und Interpretation für Proteinidentifizierung und Liganden binden mit native MS, IM-MS, CIU, in Lösung Störung und Modellierung. Die DNA-Repair-Komplex, HerA-NurA, dient als Modellsystem. DNA-Doppelstrang-Brüchen (DSB) sind eines der zytotoxischen und schädlichen Formen von DNA-Schäden in genetische Instabilität und die spätere Entwicklung von Krebs beim Menschen. Homologe Rekombination ist der Repair-Mechanismus der DSB, einen Prozess beseitigt, die durch die ATP abhängige Helikase-Nuklease Komplex, HerA-NurA22orchestriert.
Kombination von native MS und IM-MS mit funktionellen Assays und Modellierung erlaubt die Untersuchung von: (i) die Rolle der NurA in der Montage, Anpassung und Stabilität des Komplexes, (Ii) die Interaktion zwischen DsDNA und der Komplex und seinen Einfluss auf den Gesamteindruck Stabilität des Komplexes, und Iii) die Stöchiometrie und die Auswirkungen der ATP-Bindung auf die Montage-22. Insgesamt führte diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der molekularen Grundlagen des HerA-NurA-komplexes durch die Verknüpfung von Protein Komplex Konformationsänderungen und Stabilität mit Nukleotid-Bindung. Dieses Protokoll ist für jedes Protein-complex(es), die in Wechselwirkung mit einem oder mehreren Ligand(s) Arten generisch.

<table><tbody><tr><td>Adenosin 5&prime;-(3-Thiotriphosphat)-Tetralithiumsalz</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-diphosphat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Spin Chromatographie-Säulen</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin Konzentrator</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillaren</td><td>Harvard-Gerät</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von protein-architekturen und protein-ligand-komplexen durch integrative strukturelle massenspektrometrie

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteine sind eine wichtige Klasse von biologischen Makromolekülen, die viele wichtige Rollen im zellulären Funktionen einschließlich der Genexpression spielen, katalysieren Stoffwechselreaktionen, DNA-Reparatur und Replikation. Daher ein detailliertes Verständnis dieser Prozesse bietet wichtige Informationen darüber, wie Zellen funktionieren. Integrative strukturelle MS-Methoden bieten strukturelle und dynamische Informationen über Protein komplexen Baugruppe, komplexe Verbindungen, Untereinheit Stöchiometrie, Protein Oligomerisierung und Ligand-Bindung. Jüngste Fortschritte in der integrativen strukturelle MS haben für die Charakterisierung von anspruchsvollen biologische Systeme, einschließlich große DNA-bindende Proteine und Membranproteine erlaubt. Dieses Protokoll beschreibt die vielfältigen MS Daten zu integrieren, wie z. B. native MS und Ionen-Mobilität-Massenspektrometrie (IM-MS) mit Molekulardynamiksimulationen Einblicke in eine Helikase-Nuklease DNA Reparatur-Protein-Komplex. Der daraus resultierende Ansatz bietet einen Rahmen für detaillierte Studien der Liganden Bindung an andere Proteinkomplexe wichtige biologische Prozesse beteiligt.

Native MS Ergebnisse zeigten die Oligomere Zustand, die Zusammensetzung und die Topologie des HerA-NurA-komplexes (Abbildung 1). Als nicht-kovalente Wechselwirkungen in der Gasphase konserviert werden, native MS ATP-γ-S und ADP Titrationen Experimente bestimmt die paarweisen Nukleotid-Bindung an HerA-NurA (Abbildung 2) und, die Erhöhung der ATP-γ-S-Konzentration erhöht sich die relative Intensität der Hexameric HerA (Abbildung 3). Strukturelle Informationen über Untereinheit Interaktionen wurden von in-Lösung Störung gefolgt von native MS erhalten und wurden in Absprache mit und theoretischen Massen (Abbildung 4 und Tabelle 1).
Die experimentelle CCS-Werte der Proteine und ihre komplexe stammt aus IM-MS Experimente (Abbildung 5). Diese Werte sind rotatorisch gemittelten Gasphase Cross-Sectional Berechnungen der molekularen Form und beschreiben den dimensionalen Zustand des Proteins. CCS-Werte sind im Vergleich zu theoretischen Messungen von Röntgen-Kristallographie und ein gutes Abkommen folgert, dass die native Form in in der Gasphase (Tabelle 1)erhalten. Dies überprüft mit CCS Werten für Gebäudemodelle mit niedriger Auflösung des Proteins Montage48.
Experimentelle CCSs können für jedes kostenlos Zustand Ion berechnet werden. Eine Native-Like Protein Anpassungsvorrichtung kann staatliche Ionen mit ähnlichen CCS Werten berechnen führen. Allerdings erhöht höhere Gebühr Zustand Ionen Coulomb Abstoßungen Protein Gasphase Entfaltung und größeren CCS Werte im Vergleich zu den theoretischen CCSs führen. Die CCS-Wert des niedrigsten Ladezustands Ionen sind daher in der Regel verwendet49. HerA-NurA, aufgefordert, in Lösung Störung Experimente an HerA und HerA-NurA mit und ohne DNA-Generation von einer Versammlung Weg beginnend mit Monomeren, dann bilden die gesamte Hexameric HerA (HerA6)-dimeres NurA (NurA2) Komplex mit der DNA (Abbildung 6).
Unterschiede in den CIU entfaltenden Parzellen der Apo (Liganden-frei) und Liganden gebunden definieren die Änderung im Komplexstabilität bei Ligand-Bindung. Eine höhere CV50 oder KECOM Wert bedeutet eine mehr stabilisierte Ionen in der Gasphase. CIU und KECOM -Analyse ergab, dass DNA-gebundene HerA-NurA ist stabiler als DNA-freie Komplex (Abbildung 7Aii). Von CIU-MS-Analyse in den jeweiligen Staaten ATP-Bindung die vier-ATP-γ-S Bindungszustand reduzierte Komplexstabilität in der Gasphase und die sechs -ATP-γ-S Bindungszustand wo alle Plätze sind belegt, sind die meisten war stabil (Abbildung 7Bii). Native MS kann die diskrete Nukleotid verbindliche Staaten von HerA offenbaren; jedoch kann es nicht unterscheiden, welche HerA Untereinheiten ATP bindend sind und wo diese Bindung stattfindet. Diese Informationen kann von expliziten Lösungsmittel MD-Simulationen auf der Hexameric HerA und der HerA-NurA nach der zusammengefassten Workflow (Abbildung 8) abgeleitet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Abbildung 1. Befragen die Oligomere Zustand, die Zusammensetzung und die Topologie des HerA-NurA nicht-kovalente Komplexes. (A) Massenspektren von HerA, HerA-NurA und HerA-NurA im Beisein von DNA (15,4 kDa 25 bp doppelsträngige DNA). Der HerA-Sub-Komplex existiert als ein Hexamer und eine Heptamer. NurA Dimer bindet und eine HerA Hexamer imposante Oligomere Konvertierung. Die DNA bindet den gebildeten HerA - NurA-Komplex (adaptiert von Z. Ahdash Et Al., 201722Ergebnisse). (B) relative Intensitäten der identifizierten Arten werden mit UniDec32berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Abbildung 2. Native ESI-MS zeigt den Mechanismus der Nukleotid-Bindung an HerA-NurA. Massenspektren (A) HerA-NurA und (B) HerA-NurA-DNA mit steigenden Konzentrationen von (i), ATP-γ-S und (Ii) ADP. Gemessenen Massen sind im Vergleich zu theoretischen Massen und die Menge von ATP-γ-S oder ADP gebunden werden ermittelt. Gemessenen Massen und Anzahl der gebundenen Nukleotide sind die Spektren angezeigt. ATP-γ-S und ADP Titrationen Experimente bestimmt die paarweisen Nukleotid-Bindung an HerA-NurA allein und im Komplex mit DNA zeigt einen zyklischen Reaktionsmechanismus (adaptiert von Z. Ahdash Et Al., 201722Ergebnisse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Abbildung 3. Messung der Wirkung von steigenden Konzentrationen von ATP-γ-S HerA Oligomere Zustand. (A) Massenspektren von HerA bei steigenden Konzentrationen von ATP-γ-S. (B) zeigt die relativen Intensitäten der verschiedenen Arten von native MS Graph mit UniDec Dekonvolution Software32berechnet. Wie die ATP-γ-S-Konzentration steigt, steigt auch die relative Intensität der Hexameric HerA. Anzahl der ATP-γ-S-Moleküle gebunden ist auf die Spektren (adaptiert von Z. Ahdash Et Al., 201722Ergebnisse) angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Abbildung 4. Mass Spectra und Sub-komplexe Dissoziation Produkte von HerA (A) und (B) HerA-NurA (i) allein und in der Gegenwart (Ii) DNA folgende Störungen in Lösung. In Lösung Störung Experimente wurden durchgeführt, mit 10-40 % der Acetonitril, Methanol (MeOH) oder Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und führte zur Bildung von verschiedenen Subcomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Abbildung 5. Ionen-Mobilität Ankunft Zeit Distributionen auf eine CCS-Achse für komplexe und generierten Sub komplexe gezeigt. Symbol für jede Sub-komplexe korrelieren mit denen kommentiert auf den Spektren in Abbildung 4. Experimentellen und berechneten Massen und CCS-Werte der Sub-komplexe sind in Tabelle 1 aufgeführten alle davon eine Vereinbarung zwischen experimentellen und berechneten Werte zeigten (nach Prüfung der typischen Unsicherheit in der Entschließung des Reisens Welle ion Mobilität-Massenspektrometrie von ±5 - 8 %37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Abbildung 6. Montage Weg der HerA-NurA-Anlage erzeugt aus in-Lösung Unterbrechung native MS und IM-MS. farbige Kreise zeigen Bedingungen wo jeder Sub-Komplex wurde beobachtet: Native (grün, vor der Störung), Methanol (gelb), DMSO (lila) oder Acetonitril (rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Abbildung 7. Die stabilisierende Wirkung der DNA (A) auf HerA-NurA und (B) ATP-Bindung an HerA-NurA-DNA untersucht. (i) Gasphase CIU-MS Grundstücke und (Ii) Massenmittelpunkt Kollision Energien (KEcom) Berechnung zeigen, dass, dass das Vorhandensein von DsDNA des HerA-NurA-komplexes stabilisiert und die sechs ATP-γ-S Staat gebunden die stabilste ist. Stabilisierung für unterschiedliche Ladungszustände wird angezeigt. Grundstücke wurden mit PULSAR 33erzeugt. Ergebnisse von (A) adaptiert von Z. Ahdash Et Al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Abbildung 8. Workflow für die Modellierungen Verfahren für differenzielle Molekulardynamik-Simulationen. (A) erzeugen des Komplexes unter Untersuchung durch den Bau der Topologie von vorhandenen Untereinheiten und Wiederaufbau der fehlenden Rückstände. (B) Workflow für Molekulardynamik-Simulationen auf dem Proteinkomplex mit und ohne Liganden ausgeführt. Molekulardynamik Simulationen sind lief für das Protein nur welche Handlungen als Referenz und die Simulation von Protein plus Liganden subtrahiert wird. Danach erfolgt die Berechnung der differentiellen Root-Mean-Square Fluktuation (RMSF) zwischen den Simulationen und Bestimmung der Wirkung der Liganden Bindung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Komplexe / Sub-Komplex</td>
			<td>Theoretischen Masse (kDa)</td>
			<td>Experimentelle Masse (kDa)</td>
			<td>Theoretischen CCS (Å2)</td>
			<td>Experimentelle CCS (Å2) [kostenlos]</td>
			<td>Zustand HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45]</td>
			<td>10-20 % ACN, 10-40 % DMSO, 10 % MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>10 % ACN, 10 % MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40 % ACN, 10 % MeOH, 20-40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA2
</td>
			<td>78,24</td>
			<td>78,36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, 20-40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16]</td>
			<td>10-40 % ACN, 40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40 % Meth, 10-40 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, können 10-40 %, 40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226,2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, 10-40 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA-6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339,3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, 10-40 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45]</td>
			<td>30 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA-7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, 10-40 % ACN, 10-40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7 + DNA</td>
			<td>409,8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45] 14641 [46 +]</td>
			<td>10 % ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Experimentellen und berechneten Massen und CCS-Werte der HerA-NurA und seine Sub-komplexe Form in Lösung Störung Studien generiert.

Massenspektrometrie (MS) hat als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Struktur und Dynamik der makromolekularen Versammlungen entstanden. Hier integrieren wir MS-basierte Ansätze, um komplexe Proteinbildung und Liganden Bindung zu befragen.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Heute spielt die Massenspektrometrie eine wichtige Rolle in der Strukturbiologie. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über wichtige biologische Makromoleküle in ihrem nativen Zustand zu beantworten, insbesondere Proteine und Proteinkomplexe. Native Massenspektrometrie ist weit verbreitet auf eine Vielzahl von biomolekularen Baugruppen einschließlich Multiprotein- und Nukleinsäuresysteme anwendbar.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnell und hochsensibel ist. Es kann verwendet werden, um heterogene Proteinproben zu verhören, machen es möglich, mehrere Proteine im oligomeren Zustand gleichzeitig zu analysieren. Demonstriert wird das Verfahren von Andy Lau, einem Doktoranden in meiner Fraktion.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die hauseigenen Kapillaren für Nanoelektrospray vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine ligaandfreie Probe als Steuerelement für jeden Lauf als Pufferaustausch in Ammoniumacetat vor. Wählen Sie als Nächstes die TOF-Modi für Empfindlichkeit, positive Ionenerfassung und Mobilität aus.Aktivieren Sie als Nächstes die Trap-, API- und IMS-Gase. Für die IM-Trennung die hier gezeigten Stickstoff- und Argon-Startpunkte verwenden und bei Bedarf anpassen. Legen Sie einen geeigneten m/z Erfassungsbereich fest.Für ein unbekanntes Protein sollten die ersten Optimierungsschritte einen weiten Bereich verwenden. Setzen Sie die goldbeschichtete Kapillare in einen Kapillarhalter ein. Dann zwischen zwei und drei Mikroliter der proteinkomplexen Lösung von Interesse in die Kapillare laden.Ziehen Sie die Kapillare vorsichtig fest und legen Sie sie auf die Elektrospray-Quellenstufe. Schieben Sie die Bühne in position, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Wenden Sie einen niedrigen Nanostrom-Gasdruck an, bis sich an der Spitze der Kapillare ein Tropfen bildet.Bewegen Sie die Kapillare in Bezug auf den Kegel und überwachen Sie den Ionenstrom, um einen stabilen Ionenstrom zu erreichen. Wenden Sie eine Kapillarspannung im Bereich zwischen 0,9 und 1,6 Kilovolt an. Legen Sie dann den Probenahmekegel, den Quellversatz, die Quelltemperatur und den Kegelgasstrom so fest, wie im Textprotokoll beschrieben.Um ein gut aufgelöstes Massenspektrum und eine maximierte Ionenübertragung zu erhalten, passen Sie die MS-Parameter an und überwachen Sie die resultierende Veränderung in den Spektren. Stellen Sie die Fallkollisionsenergie auf einen anfänglichen Startpunkt zwischen 10 und 50 Volt ein. Wenn die Spannungsversätze nicht ausreichen, stellen Sie die Trapkollisionsenergien ein.Stellen Sie die Falle über ihre Spannung auf einen anfänglichen Startpunkt zwischen 20 und 45 Volt ein. Verbessern Sie die Verwüstung, indem Sie diese Spannung optimieren. Danach optimieren Sie die Wellengeschwindigkeit und Wellenhöhe, wie im Text beschrieben, um die beste Mobilitätstrennung zu erreichen.Für Studien mit HerA und NurA verwenden Sie eine Wellengeschwindigkeit von 40 Metern pro Sekunde und eine Wellenhöhe zwischen 550 und 650 Volt. Für die DNA-Bindungsanalyse mischen Sie Protein und DNA in einem Molverhältnis, das eine Protein-DNA-Komplexbildung ermöglicht. Fügen Sie immer größere Mengen von einer der folgenden, 5'O-3-Thio-Triphosphat, Tetralithiumsalz, oder ADP.Mit entsprechender Software messen Sie die Massen der erzeugten Arten und identifizieren Sie die Ligandenbindung, wie ATP und ADP Bindung und oligomere Staaten. Verwenden Sie dann die Ionenintensitäten, die in den rohen ESI MS-Spektren beobachtet wurden, um die entsprechende relative Häufigkeit von Arten zu quantifizieren. Nach der Optimierung der Gerätebedingungen für eine stabile Übertragung reduzieren Sie die Kollisionsenergie und den Probenkegel so gering wie möglich, wobei die Qualität der Spektren erhalten bleibt.Verwenden Sie die zuvor ermittelte optimierte Wellengeschwindigkeit und Wellenhöhe, um IM MS zu erfassen. Messen Sie die Ionendriftzeit bei drei verschiedenen Wellengeschwindigkeiten unter Beibehaltung der gleichen Wellenhöhe. Um das Protein-Ionen ZU bestimmen CCS messen vier Protein-Kalibratoren, zwei mit der Masse über dem protein untersuchten und zwei mit der Masse unten, mit den gleichen Instrumentationsbedingungen. Zunächst bereiten Sie die Proteinproben vor und tauschen sie in Ammoniumacetat aus, wie im Textprotokoll beschrieben.Fügen Sie Lösungsmittel in 10%-Schritten hinzu, bis die gewünschte Menge erreicht ist. Eine Stunde lang auf Eis bebrüten. Danach erwerben Sie ein IM-MS-Spektrum für jede Probe.Mit der SUMMIT-Software weisen Sie Protein-Subkomplexe zu und erzeugen Protein-Interaktionsnetzwerke. Alternativ können Sie manuell eine Liste theoretischer Massen für die erwartete Art erstellen. Um mit der Untersuchung der Proteinkomplexstabilität zu beginnen, erfassen Sie IM-MS-Daten und erhöhen sie gleichzeitig die Trapbeschleunigungsspannung von 10 Volt auf 200 Volt, die sich schrittweise auf das Protein und die Gasphase ausdukt.Analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Software und generieren Sie zweidimensionale Entfaltungsdiagramme, indem Sie die intensitätsnormalisierten CCS-Verteilungen bei jeder Beschleunigungsspannung für jeden Ladezustand stapeln. Native MS-Ergebnisse zeigen den oligomeren Zustand, die Zusammensetzung und die Topologie des HerA- und NurA-Komplexes. Da nichtkovalente Wechselwirkungen in der Gasphase erhalten bleiben, werden native MS von ATP-Gamma-S- und ADP-Titrationsexperimenten verwendet, um die paarweise Nukleotidbindung im HerA und NurA zu bestimmen.Massenspektren der HerA-Oligomerzustände zeigen, dass die Erhöhung der ATP-Gamma-S-Konzentration die relative Intensität von hexameric HerA erhöht. Die experimentellen CCS-Werte für die Proteine und ihre Komplexe werden dann aus den IM-MS-Experimenten abgeleitet. Diese Werte gelten als gut mit theoretischen Messungen aus der Röntgenkristallographie, die die Verwendung von CCS-Werten für den Aufbau von Modellen der Proteinassembly mit niedriger Auflösung validiert.Die CIU- und KEcom-Analyse zeigt, dass die DNA-gebundene HerA-NurA stabiler ist als der DNA-freie Komplex. Die CIU-MS-Analyse und die jeweiligen ATP-Bindungszustände zeigen, dass der vier ATP-Gamma-S-gebundene Zustand die komplexe Stabilität in der Gasphase reduziert. Der sechs ATP-Gamma-S-gebundene Zustand, in dem alle Standorte belegt sind, gilt jedoch als der stabilste.Genaue Messungen der Molekularmasse eines intakten Komplexes liefern wertvolle Einblicke in die biomolekulare Charakterisierung. Wir können Informationen über komplexe Montagewege, Proteinoligomerisierung und Ligandenbindung erhalten. Die Kombination all dieser Informationen ermöglicht die Generierung detaillierter Modelle funktioneller biologischer Baugruppen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie ist eine aufstrebende Gas-Phasen-Technologie, die Ionen trennt, auf der Grundlage ihrer Kollision Querschnitt und Masse. Die Methode liefert dreidimensionale Informationen über die gesamte Topologie und Form der Protein-Komplexen. Hier skizzieren wir ein grundlegendes Verfahren für die Geräteeinstellung und Optimierung, Kalibrierung der Drift Zeiten, und die Interpretation der Daten.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Festkörper-Amid-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und die Festkörper-Photolytische Markierungs-Massenspektrometrie (ssPL-MS) für Proteine in festen Pulvern. Die Methoden liefern hochauflösende Informationen über die Proteinkonformation und -wechselwirkungen im amorphen Festkörper, die für das Formulierungsdesign nützlich sein können.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Die gezielte Vernetzungsmassenspektrometrie erstellt quartäre Proteinstrukturmodelle unter Verwendung von Massenspektrometriedaten, die mit bis zu drei verschiedenen Erfassungsprotokollen erfasst wurden. Wenn sie als vereinfachter Workflow auf dem Cheetah-MS-Webserver ausgeführt werden, werden die Ergebnisse in einem Jupyter Notebook gemeldet. Hier zeigen wir die technischen Aspekte, wie das Jupyter Notebook für eine tiefergehende Analyse erweitert werden kann.

Quartäre Strukturmodellierung durch chemische Vernetzungsmassenspektrometrie: Erweiterung der TX-MS Jupyter-Berichte

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Die experimentellen Verfahren zur Durchführung einer diethylpyrocarbonat-basierten kovalenten Markierung mit massenspektrometrischem Nachweis werden beschrieben. Diethylpyrocarbonat wird einfach mit dem interessierenden Protein oder Proteinkomplex gemischt, was zur Modifikation von lösungsmittelzugänglichen Aminosäureresten führt. Die modifizierten Rückstände können nach proteolytischem Aufschluss und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie identifiziert werden.

Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

Erfahren Sie die native Massenspektrometrie zur Analyse von Protein-Komplexen und Ligandenbindungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung biomolekularer Strukturen in ihrem nativen Zustand mit hoher Empfindlichkeit.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

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