Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Autophagie zu beantworten, z. B. wie die Autophagosomenbildung reguliert wird und wie sich verschiedene Zellbehandlungen und -bedingungen auf die Massenautophogie auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die endogene Ladungssequestrierung misst. Daher ist das Verfahren breit anwendbar und unabhängig von künstlicher Überexpression oder Einführung von Frachtsonden.

Das Verfahren wird von Paula Szalai und Morten Luhr, Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt. Kultivieren Sie zunächst adhärente Zellen in 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturflaschen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis sie eine nahezu konfluente Zellschicht erreichen.

Waschen Sie danach die Zellen mit drei Millilitern PBS bei 37 Grad Celsius bei pH 7,4. Entfernen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch drei Milliliter 0,25%Trypsin EDTA. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen lösen.

Anschließend werden die Zellen in sieben Millilitern Kulturmedium mit 10 % FBS resuspendiert und in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Übertragen Sie mit einer Pipettenspitze von 0,5 bis 20 Mikrolitern 10 Mikroliter Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 Mikrolitern Trypanblau. Verwenden Sie dieselbe Pipettenspitze, um sofort einen Zählkammerobjektträger zu befüllen und die Zellen in einem automatisierten Zellzähler zu zählen.

Verwenden Sie dann ein Kulturmedium mit einem Gehalt von 10 % FBS, um eine geeignete Verdünnung der Zellsuspension herzustellen. Mit aseptischen Techniken wird ein Milliliter der verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte gesät. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist.

Bei den gewünschten experimentellen Behandlungen wird ein Satz von Vertiefungen unbehandelt gelassen, um die Hintergrundwerte von sedimentierbarem LDH zu bestimmen. Drei bis vier Stunden vor der Ernte geben Sie eine sättigende Menge des Nachsequestrierungshemmers Bafilomycin A1 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Behandlungszeit saugen Sie, um das Medium abzusaugen. Geben Sie 200 Mikroliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmte Zellablösungslösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen lösen.

Geben Sie 500 Mikroliter PBS bei Raumtemperatur bei einem pH-Wert von 7,4 mit 2 % BSA in jede Vertiefung. Mit einer Pipette jede Vertiefung resuspendieren, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar sind. Übertragen Sie danach die Zellsuspension sofort in jeder Vertiefung in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu sedimentieren. Saugen Sie den Überstand gründlich ab und lassen Sie die Zellpellets so trocken wie möglich. Geben Sie dann 400 Mikroliter Lösung mit 10 % Saccharose in ultrareinem Wasser in jedes Röhrchen.

Mit einer Pipette resuspendieren Sie das Zellpellet, um eine Suspension nahezu einzelzellig zu erhalten. Übertragen Sie diese Suspension in eine vier Millimeter große Elektroporationsküvette. Legen Sie die Küvette in einen Exponentialabklingwellen-Elektroporator und entladen Sie einen einzelnen elektrischen Impuls bei 800 Volt, 25 Mikrofarad und 400 Ohm.

Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze, um den Zellaufschluss in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das 400 Mikroliter eiskalte, phosphatgepufferte Saccharoselösung enthält, und mischen Sie es kurz durch Pipettieren. Wiederholen Sie diesen Resuspensions-, Elektroaufschluss- und Mischvorgang für jede Probe. Wenn Sie das Verfahren zum ersten Mal durchführen, stellen Sie sicher, dass Sie die effiziente und selektive Elektroaufschluss der Plasmamembran überprüfen, wie im Text beschrieben.

Um sedimentierte LDH-Fraktionen zu erhalten, entfernen Sie 550 Mikroliter aus jeder verdünnten zelldisruptiven Lösung und überführen Sie sie in ein eigenes Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 900 Mikroliter eiskalten Resuspensionspuffer mit 0,5 % BSA und 0,01 % Tween 20 enthält. Zum Mischen kurz pipettieren. Zentrifugieren Sie 45 Minuten lang bei 18.000 g und vier Grad Celsius, um Pellets mit sedimentiertem LDH herzustellen.

Saugen Sie den Überstand gründlich ab, um die Pellets so trocken wie möglich zu halten. Lagern Sie die sedimentierten LDH-Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereit sind. Für die Gesamt-LDH-Fraktionen werden 150 Mikroliter aus jeder der verdünnten Zellaufschlusslösungen in ein eigenes neues Röhrchen überführt.

Lagern Sie diese in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereit sind. Tauen Sie sowohl die sedimentierten LDH-Proben als auch die gesamten LDH-Proben auf dem Eis auf. Nach dem Auftauen 300 Mikroliter eiskalten Resuspensionspuffer mit 1,5 % Triton X-405 zu den gesamten LDH-Proben hinzufügen.

Drehen Sie die Proben auf einer Walze in einem Kühlraum für 30 Minuten. Geben Sie anschließend 750 Mikroliter eiskalten Resuspensionspuffer mit 1 % Triton X-405 zu den sedimentierten LDH-Proben. Verwenden Sie eine Pipette, um die Pellets wieder aufzuhängen, bis die Lösung homogen ist.

Zentrifugieren Sie alle Proben fünf Minuten lang bei 18.000 g und vier Grad Celsius, um ungelöste Zelltrümmer zu sedimentieren. Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist, legen Sie die Proben auf Eis. Bestimmen Sie die LDH-Spiegel in den Überständen entweder mit einem klassischen enzymatischen Assay, wie im Text beschrieben, oder mit einem der zahlreichen kommerziell erhältlichen Kits.

In dieser Studie wird die autophagische Sequestrierungsaktivität in einer Reihe verschiedener Säugetierzelllinien überwacht. Wie hier gezeigt, werden sowohl die basale als auch die hungerinduzierte LDH-Sequestrierung und LNCaP-Zellen durch den pan-PI3-Kinase-Inhibitor 3MA vollständig aufgehoben. Der selektive PI3-Kinase-Klasse-3-Inhibitor, SAR-405, und der ER-Kalziumpumpen-Inhibitor, Thapsigargin.

In HEK293-Zellen wird die LDH-Sequestrierung unter Hungerbedingungen sowohl durch Thapsigargin als auch durch den ULK-Inhibitor MRT 67307 stark reduziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die hungerinduzierte LDH-Sequestrierung in den anderen beobachteten Zelllinien durch 3MA konsistent gehemmt wird. Als nächstes werden verschiedene ATG-Gen-Knockout-MEFs eingesetzt, um zu testen, ob Autophagie-verwandte Gene, von denen berichtet wird, dass sie für die Autophagosomenbildung essentiell sind, für die LDH-Sequestrierung erforderlich sind.

Wie zu sehen ist, ist die hungerinduzierte LDH-Sequestrierung bei ATG5-Knockout-MEFS aufgehoben. Darüber hinaus ist es auch in ATG7- und ATG9A-Knockout-MEFs abgestumpft. Schließlich werden die Auswirkungen des RNAi-vermittelten Silencings von wichtigen ATG-Gentranskripten bestimmt.

Es wird gezeigt, dass die Transfektion mit einer ATG9A-Targeting-siRNA oder mit kombiniertem Targeting von ULK1 und ULK2 die LDH-Sequestrierung in LNCaP-Zellen stark reduziert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, bei allen Pipettierschritten genau zu sein. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. der Long-Lived Protein Degradation Assay, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. ob Veränderungen in der Sequestrierungsaktivität beobachtet wurden, die zu vergleichbaren Veränderungen der autophagischen Abbauaktivität führten.

Nachdem wir diese Methode in Säugetierzelllinien etabliert hatten, haben wir damit gezeigt, dass die Bulk-Autophagie unabhängig von der LC3-Proteinfamilie ist und stattdessen GABARAPs benötigt. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, LC3-unabhängige Methoden zur Überwachung der Autophagieaktivität einzusetzen.