Name: Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Erfahren Sie paarungsbasiertes Überexpression-Screening in Hefe zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen. Diese effiziente Methode nutzt Hefepaarung zur Analyse genetischer Faktoren und Protein-Toxizität.

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Wir sind dankbar für die nachdenkliche Gespräche mit Mitgliedern der Ju-Labor und Zhong Labor und die finanzielle Unterstützung von der Wright State University.

Hinweis: Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für screening-Bibliothek Plasmide in zehn 96-Well-Platten enthalten aber kann skaliert werden oben oder unten entsprechend. Das Protokoll muss wiederholt werden, um die gesamte Bibliothek Überprüfung abzuschließen. In der Regel kann Abschirmung gegen 10 Platten Bibliothek Gene jeweils bequem durch 1 Person behandelt werden.
1. Vorbereitung für 96-Well-Hefe-Transformation
Hinweis: Dieser Schritt ist wie zuvor beschrieben7,10durchgeführt.
<ol><li>Aliquoten 5 µL (ca. 50 – 100 ng) der Plasmid-DNA aus einer angeordneten Plasmid-Bibliothek in jede Vertiefung ein Rundboden-96-Well-Platte. Hinweis: Ein Beispiel für solch eine Bibliothek wäre eine Hefe gen Überexpression Bibliothek10.</li>
	<li>Impfen Sie 150 mL Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Medien in eine 500 mL-Flasche mit einer Kolonie (2 – 3 mm Durchmesser) von der haploiden Hefe-Stamm W303α. Brüten sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min).</li>
	<li>Am nächsten Morgen messen die OD600 der Übernacht-Kultur und verdünnen die Hefekultur OD600 = 0,1 (bis zu) 2 l YPD. Inkubieren sie bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min) ~ 5 h bis die Kultur OD600 erreicht = 0,4 – 0,6.</li>
</ol>2. Hefe-Transformation
<ol><li>Ernte die Hefekultur 8 sterile 250 mL Zentrifuge Flaschen füllen und Zentrifugieren sie bei Raumtemperatur bei 3.000 X g für 10 Minuten abgießen der Überstand ohne Unterbrechung das Pellet. Hinweis: Führen Sie alle Schritte der Zentrifugation bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Hefe mit sterilem destilliertem H2O. 100 mL sterilen H2O hinzufügen, jede Flasche Zentrifuge und Wirbel um die Zelle Pellet aufzuwirbeln. Kombinieren Sie die gewaschenen Zellen in 2 Flaschen und Zentrifuge auf 3.000 X g für 5 min. Weg des Überstands Gießen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in jeder Flasche in 100 mL der 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc, 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) und Zentrifugieren sie 3.000 x g für 5 min. Gießen aus der Überstand.</li>
	<li>Beim Zentrifugieren, 5 mL Lachs Samenzellen DNA (10 mg/mL) bei 100 ° C mit einem Block Heizung für 3 min. Kochen und dann abkühlen auf Eis.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE in jeder Flasche, kombinieren Sie die resuspendierte Zellen und übertragen Sie sie auf eine 150 mL Flasche. 5 mL der vorgekühlten Lachsen Samenzellen DNA und bei 30 ° C mit schütteln (225 u/min) für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Den Teig Zelle in eine sterile Einweg-Reagenz-Reservoir und mit einer Mehrkanal-Pipette, 35 µL der Zelle Mischung in jede Vertiefung der Rundboden-96-Well-Platte, enthält die Bibliothek Plasmid DNA übertragen. Wirbel der 96-Well-Platten mit einer Platte Vortexer für 1 min bei 1.000 u/min. Inkubieren Sie die Platten für 30 min bei 30 ° C ohne schütteln. Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht, so kann die Wärme effizienter übertragen. Wir haben festgestellt, dass aufschütteln der 96-Well-Platten bei 1.000 u/min verursacht keine Flüssigkeit, aus dem Brunnen zu verschütten, aber eine sichere Wirbel Geschwindigkeit getestet werden, sollte bevor Sie den Schritt ausführen.</li>
	<li>Bereiten Sie in einem Kolben 200 mL des Puffers Transformation, eine Endkonzentration von 40 % PEG3350, 10 % DMSO und 0,1 M LiOAc enthält. Vorbereitung des Umwandlung Puffers unmittelbar vor der Anwendung und durch Schütteln mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie 96-Well-Platten aus dem Inkubator 30 ° C und mischen sie für 30 s bei 1.000 u/min mit der Platte Vortexer. Hinzu kommen 125 µL des Puffers Transformation jedes gut und dann Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min.</li>
	<li>Die Platten bei 30 ° C für 30 min inkubieren und dann Hitze Schock die Hefe indem man die Platten in einem Inkubator 42 ° C für 15 Minuten. Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platten für 5 min bei 3.000 X g. Entfernen des Transformation-Puffers aus den Vertiefungen durch invertieren die Platten in einem Abfallbehälter und mit Nachdruck dumping des Puffers von den Platten. Beflecken Sie schnell die invertierten Platten auf einem sauberen Papiertuch, keine Flüssigkeit auf die Oberseite der Platten zu entfernen.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen, indem Sie die Platten 200 µL des minimalen Dropout mittlere entspricht die auswählbare Markierung auf dem Plasmid Bibliothek hinzufügen. Hinweis: Wir haben ein synthetisches Ura-Medium.</li>
	<li>Die Platten für 5 min bei 3.000 X g Zentrifugieren und den überstand über einem Abfallbehälter wie in Schritt 2.10 entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 160 µL minimal Ura-Medium enthält 2 % Glukose. Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min und inkubieren sie bei 30 ° C für 48 h ohne schütteln. Beachten Sie nach 48 h, dass ein Pellet transformierte Hefe am unteren Rand jedes gut sichtbar ist.</li>
	<li>Fügen Sie mithilfe eines liquiden Dispensers 100 µL der Ura-Medien mit Glukose in jede Vertiefung einen neuen Satz von 96-Well Platten.</li>
	<li>Wirbel der Platten, die die transformierte Hefe (aus Schritt 2.13) bei 1.000 u/min für 30 s. mit einem sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator, legen Sie die Stifte in die Vertiefungen der transformierten hefehaltigen und dann in die entsprechenden Vertiefungen der neuen Platten zu impfen gefüllt mit Medien. Inkubieren Sie die neuen Platten bei 30 ° C für 24 h. Hinweis: Wenn mit 10 Platten arbeiten, kann das Medium auch verzichtet werden manuell mit Mehrkanal-Pipetten.</li>
	<li>Nach 24 Stunden sollte ein Pellet Hefe im unteren Teil jedes erfolgreich transformierten hefehaltigen gut sichtbar sein. Um diese Hefestämme Glycerin Vorrat zu speichern, fügen Sie 50 µL 50 % Glycerin in jede Vertiefung Wirbel die Platten für 30 s bei 1.000 u/min, die Platten mit Dichtungsband Abdichten und frieren sie bei-80 ° C. Hinweis: Die oben genannten Schritte müssen nur einmal durchgeführt werden. Zukünftige Vorführungen von verschiedenen Hefe Modelle gegen die gleiche Bibliothek Einweg-Reagenz Reservoir aus Glycerin-Aktien starten und sofort aus den folgenden Schritten fortfahren.</li>
</ol>3. Paarung zwischen Zellen, die Bibliothek Gene und Abfrage Hefe
<ol><li>Um die Bibliothek Stämme aus dem Glycerin bestand wieder zu beleben, nimm die 96-Well-Platten aus dem-80 ° C Gefrierschrank, entfernen die Abdichtung Band, und lassen Sie die Hefe bei etwa 30 min bei Raumtemperatur Auftauen.</li>
	<li>Einmal die Hefe aufgetaut hat, können Sie einen sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator impfen zu frischen Ura-Medien mit 2 % Glukose in 96-Well Platten 160 µL Glycerin Aktien und inkubieren sie bei 30 ° C für 24 h, sofort nachdem die Bibliothek Stämme verwendet werden , die Platten mit Dichtungsband abdichten, und wieder in die-80 ° C Gefrierschrank.</li>
	<li>Am selben Tag die Bibliothek Stämme (W303α) aufgetaut, impfen die Abfrage Hefestamm (hier der FUS in W303a), 50 mL YPD und wachsen sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln bei 250 u/min.</li>
	<li>Am nächsten Morgen Gießen Sie den Abfrage-Hefe-Stamm zu einem sterilen Einweg-Reagenz-Reservoir und aliquoten 160 µL der Abfrage Belastung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette.</li>
	<li>Mit dem liquid Dispenser, 160 µL YPD Medien verzichten Sie in jede Vertiefung der zehn 96-Well-Platten. Verwenden Sie diese Platten später für die Paarung der Abfrage-Hefe-Stamm mit der Bibliothek Hefe.</li>
	<li>Kurz Wirbel der 96-Well-Platte mit dem Abfrage-Stamm und dann mit einem sterilen 96-poligen Replikator um die Abfrage zu übertragen, die YPD-Platten belasten.</li>
	<li>Wirbel der Bibliothek kurz belasten Platten und für jede Bibliothek Stamm Platte verwenden einen neue sterilen 96-poligen Replikator übertragen die Bibliothek Stämme auf die YPD-Platten, die mit dem Abfrage-Stamm geimpft worden. Hinweis: Zellen in Glycerin verlieren ihre Keimfähigkeit nach mehreren Zyklen der Tauwetter-Freeze. Rückkehr der Bibliothek-Stämme in die Langzeitspeicherung (-80 ° C Gefrierschrank) so bald wie möglich halten Sie die Bibliothek in guter Qualität und für eine spätere Verwendung bereit. Richtig gepflegt, können Sie die Glycerin-Aktie eingefroren und wieder aufgetaut mindestens 10 mal. Wir empfehlen außerdem, eine Arbeitskopie und backup-Kopien von Glycerin-Lager zu halten. Bei der Arbeit bestand nicht funktioniert, sofort eine neue Arbeitskopie aus der Sicherungskopie.</li>
	<li>Inkubieren Sie die YPD-Platten bei 30 ° C für 24 h. Beachten Sie, dass ein Pellet Hefe nach 24 h im unteren Teil jeder gut sichtbar sein wird.</li>
	<li>Füllung-96-Well-Platten mit einem minimalen Dropout-Medium mit 2 % Raffinose, entspricht die wählbaren Markierungen auf dem Plasmid in der Abfrage-Belastung sowie auf die Bibliothek Plasmid (z. B.- seine - hier Ura).</li>
	<li>Verwenden Sie einen sterilen 96-poligen Replikator Hefe von der YPD Paarung Kulturen zu den selektiven Medien übertragen. Die 96-Well-Platten bei 30 ° C für 48 h Inkubation; nur Hefezellen gedeckt haben und gebildeten diploiden Zellen und daher sowohl die Abfrage Plasmid enthalten und die Bibliothek Plasmid werden sich in diesem Medium wachsen. Feststellen Sie nach 2 Tagen, dass ein Pellet auf dem Boden der Näpfchen sichtbar ist.</li>
</ol>(4) Schmierblutungen Assay
<ol><li>
Nach 48 h des Wachstums in der Raffinose-haltigen selektivmedien vor Ort die Hefe auf Agarplatten.
	<ol>
<li>Bereiten Sie 2 Sets von Ura seine ausfallende Platten mit 2 % Agar mit klaren Polystyrol-Platten, eine mit 2 % Galaktose und das andere mit 2 % Glukose.</li>
		<li>Wirbel der 96-Well-Platten für 1 min bei 1.000 u/min, dann vor Ort die Hefe, die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Galaktose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene induziert) und die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Glukose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene unterdrückt) mit einem Roboter-spotting Maschine, durch die die Kultur in den einzelnen gut auf Agarplatten in vervierfacht fleckig ist (d. h., die Kultur in 1 gut ist gesichtet um 4 Punkte auf der Agarplatte).</li>
		<li>Lassen Sie nach dem Absetzen die Agarplatten trocknen, und dann legen Sie sie kopfüber in einem 30 ° C Brutschrank. Fotografieren Sie die Agarplatten alle 24 h eine schneller/mehr Hefe Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung gerettet wird, oder eine langsamer/weniger Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung noch verstärkt wird. 4 Tage inkubieren Sie die Platten. Hinweis: Die Kultur in jedem kann gut auf Agarplatten 1-zu-1 gesichtet werden, wie in einer vorherigen Umwandlung basierende Methode10gezeigt. Jedoch, die 1 bis 4 hier Schmierblutungen (die bequem aufgestellt werden kann der Roboter spotting maschinenbenutzung) deutlich erhöht die Robustheit des Tests durch die Reduzierung von Fehlalarmen. Positive Treffer gelten nur, wenn alle 4 Kolonien aus der gleichen nun einen ähnlichen Phänotyp zeigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
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<li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+links+between+Abeta+toxicity%2C+endocytic+trafficking%2C+and+Alzheimer%27s+disease+risk+factors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li>
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<li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li>
<li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies%3A+the+first+15+years+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir ein Protokoll um ein Plasmid Überexpression Bildschirm in der Hefe, die zur Einführung der Plasmid-Bibliothek in der Hefe-Modell mit Paarung durchzuführen. Mithilfe dieses Ansatzes können mehrere Hefe-Modelle der Neurodegenerative Krankheit Protein Toxizität gezeigt mit der gleichen Sammlung von Hefe mit einem Plasmid-Bibliothek umgewandelt. Der mühsame Prozess der Transformation muss nur durchgeführt werden, sobald nach dem hocheffizienten Hefe Paarung verwendet wird, um der Plasmid-Bibliothek in de...

Die angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae hat in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung1 verbreitet, um zelluläre Prozesse, die direkt im Zusammenhang mit Krankheiten des Menschen zu verstehen. Darüber hinaus hat es als Modellorganismus verwendet worden für Studium menschlichen krankheitsassoziierten Proteine, wie diejenigen, die am häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und Amyotrophe verbunden Lateralsklerose (ALS)2. Ein Vorteil der Hefe-Modells ist die Leichtigkeit, mit der ein genomweite Bildschirm ausgeführt werden kann, um zelluläre Signalwege, die im Zusammenhang mit der Toxizität von krankheitsbezogenen Proteine, wodurch Einblicke in den Mechanismus der Toxizität zu identifizieren. Ein solcher Bildschirm nennt einen Überexpression Bibliothek Bildschirm, in dem jedes 5.500 Hefe-Gene in einer angeordneten Bibliothek umgewandelt ist ein Hefe-Modell zu identifizieren, welche Gene Toxizität bei überexprimiert ändern können. Dieses Screening-Methode wurde erfolgreich in den Hefe-Modellen der mehrere Neurodegenerative Krankheit-verbundenen Proteine, einschließlich Huntingtin für Chorea Huntington3, α-Synuclein für Parkinson-Krankheit4,5 angewendet , Aβ für Alzheimer-Krankheit6, und FUS und TDP-43 ALS7,8,9. Während es in der Regel in einer Weise Hochdurchsatz-10erfolgt, ist die aufwändigste Schritt des Bildschirms individuell 5.500 Hefe-Gene aus einer angeordneten Bibliothek verändern. Dieser Schritt muss jedes Mal, wenn das Screening wiederholt durchgeführt werden, und wenn ein neu gegründeten Hefe-Modell untersucht werden muss. Es ist wichtig, einen effizienteren Weg, um diese Aufgabe zu finden.
Hefezellen können stabil in haploide und diploide Formen existieren. Es gibt zwei gegenüberliegende Paarung Arten von haploiden Zellen, Paarung Typ ein und α. haploiden Zellen von jeder Paarung produzieren und sezernieren ihre eigenen spezifischen Paarung Pheromon, auf die nur die entgegengesetzte Paarung Typ Zellen reagieren. Dies ermöglicht die Paarung zwischen ein und α Zellen, stabile diploide Zellen, a/α zu produzieren. Dieser Prozess ist spontan und hocheffiziente11. Wir profitieren von dieser einzigartigen Lebenszyklus von S. Cerevisiae , Plasmid-Bibliothek einzuführen. Genauer gesagt, wird jedes Gen in der angeordneten Plasmid-Bibliothek in haploiden Zellen eine Paarung Art, d. h., α Zellen umgewandelt werden. Diese Zellen mit den Genen der Bibliothek werden dann auf Glycerin Lager in einem angeordneten 96-Well-Format gespeichert werden. Für jedes Modell der Hefe, die untersucht werden muss, können Hefezellen mit den Bibliothek-Genen aus dem Glycerin bestand aufgetaut werden und das Screening kann erfolgen durch Paarung mit dem Hefe-Modell des Interesses an der gegenüberliegenden Paarung Typ, d.h.Paarung ein. Diese Idee der Verwendung Paarung von zwei Gene in der Hefe zusammenzubringen ist nicht neu. Es wurde erfolgreich in der Hochdurchsatz-Hefe angewendet, die zwei-Hybrid-Screening, in dem ein Köder zu konstruieren (d.h.Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionen) in einer Paarung zusammen gebracht wird, durch Paarung mit einer Beute-Konstrukt aus einer angeordneten Bibliothek 12. jedoch wurde diese Strategie nie in Überexpression Bibliothek Vorführungen, derer immer traditionelle Transformationsmethoden angewendet.
Unser Labor gegründet zuvor ein Hefe-Modell von ALS-assoziierten Protein FUS7. Durch Überexpression Bibliothek Screening mit der Transformationsmethode entdeckten wir fünf Hefe-Gene (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1und VHR1), die Toxizität von FUS bei überexprimiert zu retten. Diese Ergebnisse waren unabhängig von einer anderen Gruppe8mit einer ähnlichen Studie bestätigt. hUPF1, eine menschliche Homolog des ECM32, wurde später gezeigt, Toxizität in primären Nervenzellen13 und im Tiermodell ALS14 sowie zu unterdrücken. Mit diesen fünf Gene als Kaufnachweis Prinzip, zeigen wir, dass alle fünf Gene ebenso FUS Toxizität zu retten, wenn sie bei der Paarung in die FUS-Hefe-Modell eingeführt werden. Da Hefezellen mit den Bibliothek-Genen können dauerhaft in Glycerin Lager gespeichert und wiederbelebt, wenn nötig, wird diese Paarung basierende Methode den zeitaufwendigsten Schritt der Transformation jedes Mal entfernen braucht die Bibliothek gegen untersucht werden. Da die Paarung hocheffiziente ohne Plasmid Transformation beteiligt ist, verringert sich diese Strategie auch erheblich die Kosten für Reinigung und Transformation einer großen Plasmid-Bibliothek. Wir wenden diese Methode erfolgreich zu einer Bibliothek screening gegen Hefe Modell des FUS.
Das Verfahren für die Paarung-basierten Screening ist in Abbildung 1kurz beschrieben. Zunächst die angeordneten Plasmid-Bibliothek verwandelt sich in einen haploiden Hefe-Stamm der Paarung Typ α mit einem Hochdurchsatz-Hefe Umwandlung Protokoll, in dem jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer bestimmten Bibliothek Plasmid transformiert Hefe enthält. Diese Sammlung von transformierten Hefe wird als Glycerin Stapel gespeichert, die aufgetaut und für den Einsatz später wiederbelebt werden kann. Das Hefe-Modell von Interesse, in diesem Fall FUS Toxizität muss in einem haploiden Hefestamm mit der gegenüberliegenden Paarung Art erzeugt werden (Typ Paarung ein). In gewissem Hochdurchsatz-mit sterilen 96-poligen Replikatoren die FUS Belastung und Hefestämme mit Plasmid-Bibliothek auf 96-Well-Platten mit rich-Media übertragen und erlaubt zu Paaren. Folgende Paarung, ein kleines Volumen von jedem Brunnen der Paarung Kultur wird in 96-Well-Platten mit synthetischen ausfallende Medien in welche nur diploid Hefe enthält sowohl die FUS übertragen und Bibliothek Gene wachsen können. Eine Roboter-spotting Maschine dient dann Hefekultur von jedem Bohrloch auf Agarplatten zu übertragen, wo der Ausdruck der FUS und die Bibliothek Gene induziert wird.  Darüber hinaus ist Hefekultur gesichtet, um Agarplatten zu steuern, wo FUS und die Bibliothek Gene nicht zum Ausdruck kommen. Nach einem Wachstum auf Agarplatten werden Gene, die zu retten oder verschlimmern FUS Toxizität identifiziert werden.

Lachs <table><tbody><tr><td>Spermien-DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldbsp</td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD-Bouillon</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulierter Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose-Pentahydrat</td><td>Forschungsprodukte International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisches Ura-Drop-out-Medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-Aminosäure-Drop-out-Ergänzung -Histidin/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat</td><td>Forschungsprodukte International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat, wasserfrei</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96-poliger Replikator</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 Well Assay Platte, runder Boden mit Deckel</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>unbehandelt, steril</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Forschung plus Mehrkanalpipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul Volumen</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Isotemp Digital Trockenbäder/Blockheizkörper</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Zentrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Zentrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sänger Instrumente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paarung-basierte Überexpression bibliothek screening in der hefe

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Angehende Hefe hat als Modell bei der Untersuchung von Proteinen verbunden mit menschlicher Krankheiten verbreitet. Genomweite genetisches Screening ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig in Hefe Studien verwendet. Der Ausdruck einer Reihe von neurodegenerativen Krankheit-assoziierte Proteine in Hefe verursacht Zytotoxizität und Aggregatbildung, Rekapitulation Befunde bei Patienten mit diesen Erkrankungen gesehen. Hier beschreiben wir eine Methode für das screening ein Hefe-Modell des Amyotrophic Lateral Sclerosis-assoziierten Proteins FUS für Modifikatoren von seiner Giftigkeit. Anstelle von Transformation, setzt diese neue Screening-Plattform auf die Paarung von Hefe eine angeordneten Bibliothek von Plasmiden in der Hefe-Modell einführen. Die Paarung Methode hat zwei Vorteile: Erstens ist es sehr effizient; Zweitens kann die bereits transformierte angeordneten Bibliothek der Plasmide für langfristig als ein Glycerin-Lager, und schnell auf andere Bildschirme ohne den arbeitsintensiven Schritt der Transformation in das Hefe-Modell angewendet jedes Mal gespeichert werden. Wir zeigen, wie erfolgreich diese Methode verwendet werden kann zum Bildschirm für Gene, die die Toxizität von FUS zu ändern.

Das ALS-assoziierten Protein FUS, eine RNA/DNA-bindendes Protein, war vorher im haploiden Hefe7,8studiert. Genetisches screening mit der Umwandlung basierende Methode entdeckte mehrere Hefe-Gene, die FUS Toxizität zu unterdrücken. Das menschliche Homolog von eines der Hefe Gene zeigte später wirksam zu unterdrücken Toxizität bei einer primären neuronale Zelle und Rattenmodell ALS13sein. Hier verwenden wir d...

Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der neurodegenerativen Erkrankungen zu beantworten, z. B. welche genetischen Faktoren und Signalwege die Toxizität von krankheitsassoziierten Proteinen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der hocheffiziente Prozess der Hefepaarung genutzt wird, um Hefemodelle gegen eine große Sammlung von Bibliotheksgenen zu vergleichen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Toxizität von Proteinen für neurodegenerative Erkrankungen geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung anderer zellulärer Prozesse in Hefe angewendet werden, wie z. B. die Toleranz gegenüber anderen Stressbedingungen.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie fünf Mikroliter Plasmid-DNA pro Vertiefung aus einer angeordneten Plasmidbibliothek auf 96-Well-Platten mit rundem Boden aliquotieren. Halten Sie die Platten bei vier Grad Celsius. Anschließend werden 150 Milliliter Hefe-Pepton-Dextrose oder YPD-Medium in einem 500-Milliliter-Kolben mit einer Kolonie des haploiden Hefestamms W303 Alpha beimpft.Inkubieren Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie über Nacht bei 200 U/min. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die Kultur nach Messung des OD600 der Nachtkultur auf einen OD600 von 0,1 in zwei Litern YPD. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bei 200 U/min für etwa fünf Stunden, bis die Kultur einen OD600 von 0,4 bis 0,6 erreicht.Um die Hefekultur zu ernten, füllen Sie acht sterile 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen und zentrifugieren Sie sie bei 3000 xG für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Hefe wie im Textprotokoll beschrieben und verfestigen Sie die Zellen in zwei Zentrifugenröhrchen.Jedes Zellpellet wird in 25 Millilitern einer 0,1 molaren Lithiumacetatlösung resuspendiert. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen, fügen Sie fünf Milliliter Lachsspermien-DNA hinzu und übertragen Sie sie in einen 150-Milliliter-Kolben. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie es bei 225 U/min für 30 Minuten.Gießen Sie die Zellmischung nach 30 Minuten in ein steriles Einweg-Reagenzreservoir. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 35 Mikroliter der Zellmischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platten mit rundem Boden, die die zuvor vorbereitete Plasmid-DNA der Bibliothek enthalten. Wirbeln Sie die 96-Well-Platten eine Minute lang bei 1000 U/min vor.Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius, ohne sie zu schütteln. Stapeln Sie die Platten nicht, damit die Wärme effizienter übertragen werden kann. Nehmen Sie die 96-Well-Platten aus dem 30-Grad-Inkubator und mischen Sie sie 30 Sekunden lang bei 1000 U/min.Geben Sie 125 Mikroliter Transformationspuffer in jede Vertiefung und wirbeln Sie die Platten dann eine Minute lang bei 1000 U/min. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Dann die Hefe mit einem Hitzeschock foltern, indem Sie die Platten für 15 Minuten in einen 42 Grad Celsius heißen Inkubator legen.Zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 3000 xG. Entfernen Sie den Transformationspuffer aus den Vertiefungen, indem Sie die Platten über einen Abfallbehälter drehen und den Puffer gewaltsam aus den Platten kippen. Tupfen Sie die umgedrehten Platten schnell auf ein sauberes Papiertuch, um Flüssigkeit auf den Platten zu entfernen.Spülen Sie die Zellen, indem Sie in jede Vertiefung 200 Mikroliter minimales Dropout-Medium geben, das dem selektierbaren Marker auf dem Bibliotheksplasmid entspricht. Hier kommt synthetisches Ura-Minus-Medium zum Einsatz. Zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 3000 xG.Entfernen Sie den Überstand über einem Mülleimer, wie zuvor gezeigt. Geben Sie 160 Mikroliter minimales Ura-Minus-Medium mit 2 % Glukose in jede Vertiefung und wirbeln Sie die Platten eine Minute lang bei 1000 U/min durch. Inkubieren Sie die Platten ohne Schütteln bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden.Nach 48 Stunden sollte ein Pellet aus transformierter Hefe am Boden jeder Vertiefung sichtbar sein. Geben Sie mit einem Flüssigkeitsspender 100 Mikroliter Ura minus glukosehaltiges Medium in jede Vertiefung eines neuen Satzes von 96-Well-Platten. Die Platten mit der umgewandelten Hefe 30 Sekunden lang bei 1000 U/min vortexen.Setzen Sie die Stifte mit einem sterilen 96-poligen Kunststoffreplikator in die Vertiefungen mit der transformierten Hefe ein und inokulieren Sie sie dann in die entsprechenden Vertiefungen der neuen Platten, die mit dem Medium gefüllt sind. Inkubieren Sie die neuen Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Nach 24 Stunden sollte am Boden jeder Vertiefung ein Hefepellet sichtbar sein, das erfolgreich transformierte Hefe enthält.Um diese Hefestämme als Glycerinbrühen zu speichern, geben Sie 50 Mikroliter 50%iges Glycerin in jede Vertiefung, wirbeln Sie die Platten 30 Sekunden lang bei 1000 U/min, verschließen Sie die Platten mit Aluminiumfolie und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein. Um die Bibliotheksstämme aus dem Glycerinvorrat wiederzubeleben, nehmen Sie die 96-Well-Platten aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank, entfernen Sie die Aluminiumfolie und lassen Sie die Hefe etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auftauen. Sobald die Hefe aufgetaut ist, verwenden Sie einen sterilen 96-poligen Kunststoffreplikator, um die Glycerinbrühen auf 160 Mikroliter frisches Ura-Minus-Medium mit 2 % Glukose in 96-Well-Platten zu impfen und 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius zu inkubieren.Verschließen Sie die Platten sofort nach der Verwendung der Bibliotheksstämme und geben Sie sie wieder in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Am selben Tag, an dem die Bibliotheksstämme aufgetaut werden, inokulieren Sie den Abfragehefestamm in 50 Milliliter YPD und wachsen bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min über Nacht. Gießen Sie am nächsten Morgen den Abfragehefestamm in ein steriles Einweg-Reagenzreservoir und aliquotieren Sie 160 Mikroliter des Abfragestamms in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.Geben Sie mit dem Flüssigkeitsspender 160 Mikroliter YPD-Medien pro Vertiefung in 96-Well-Platten ab. Werfen Sie die 96-Well-Platten, die den Abfragestamm und die Bibliotheksstammplatten enthalten, kurz vor und übertragen Sie dann mit einem sterilen 96-Pin-Replikator die Bibliotheksstämme auf die YPD-Platten, die mit dem Abfragestamm inokuliert wurden. Inkubieren Sie die YPD-Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.Nach 24 Stunden ist ein Hefepellet am Boden jeder Vertiefung sichtbar. Füllen Sie 96-Well-Platten mit minimalem Drupout-Medium, das 2 % Raffinose enthält, entsprechend den selektierbaren Markern auf dem Plasmid im Abfragestamm sowie auf dem Bibliotheksplasmid. Verwenden Sie einen sterilen 96-Pin-Replikator, um Hefe aus den YPD-Paarungskulturen auf das Selektivmedium zu übertragen.Inkubieren Sie die 96-Well-Platten 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Nur Hefezellen, die sich gepaart und diploide Zellen gebildet haben und daher sowohl das Abfrageplasmid als auch das Bibliotheksplasmid enthalten, können in diesem Medium wachsen. Nach 48 Stunden Wachstum in dem Raffinose-haltigen Selektivmedium ist zu beobachten, dass ein Pellet am Boden der Vertiefungen sichtbar ist, die diploide Zellen enthalten.Wirbeln Sie die 96-Well-Platten eine Minute lang bei 1000 U/min vor. Verwenden Sie eine Spottmaschine, um die Hefe auf Agarplatten in vierfacher Ausfertigung auf Ura-his-Droupout-Platten mit 2 % Galaktose und 2 % Agar und auf Ura-his-Droupout-Platten mit 2 % Glukose und 2 % Agar zu setzen. Lassen Sie die Agarplatten nach dem Schmieren trocknen und legen Sie sie dann kopfüber für vier Tage in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator.Fotografieren Sie alle 24 Stunden die Agarplatten, um das Wachstum der Hefe festzuhalten. Die Toxizität des ALS-assoziierten Proteins FUS wurde zunächst bei diploider Hefe untersucht. Wie die Agarplatte, die Galaktose enthält, die FUS induziert, zeigt, ist die FUS-Toxizität sowohl bei diplod als auch bei haploider Hefe konsistent.Fünf Gene, die zuvor als Suppressoren der FUS-Toxizität aus einer transformationsbasierten Methode identifiziert worden waren, wurden mit der Paarungsmethode getestet. Spur eins ist ein Kontrollhefestamm, der mit zwei leeren Vektoren transformiert wurde. Spur zwei ist der diploide FUS-Hefestamm mit einem leeren Vektor, bei dem die Expression von FUS sehr toxisch ist.Die Spuren drei bis sieben zeigen diploide Hefe, die FUS exprimiert, sowie ein Suppressionsgen. Alle fünf Gene retten die Toxizität von FUS in diploider Hefe, was darauf hindeutet, dass die Paarungsmethode effektiv war. Diese paarungsbasierte Methode wurde dann auf ein Überexpressions-Bibliotheksscreening von 940 Genen angewendet.Und es wird ein Foto von einem repräsentativen Schild gezeigt. Wie auf der Galaktoseplatte, auf der FUS und Bibliotheksgene exprimiert werden, angedeutet, war FUS für die Diplod-Hefezelle toxisch. Das Bibliotheksgen, das durch das grüne Quadrat gekennzeichnet ist, rettete die FUS-Toxizität.Während das Bibliotheksgen, das durch das rote Quadrat gekennzeichnet ist, die Toxizität erhöhte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 120 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, vorher zu überprüfen, ob der für das Screening verwendete Phänotyp nicht vom haploiden Paarungstyp abhängt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie genetische Faktoren bei Überexpression identifizieren können, die die Toxizität krankheitsassoziierter Proteine in Hefe retten. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik Forschern auf dem Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen den Weg ebnen, um die Mechanismen der Zytotoxizität von krankheitsassoziierten Proteinen im Hefemodell zu erforschen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie der Beta-Galactosidase-Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Rettung spezifisch ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

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Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

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Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

Batch-Verarbeitung von Hefe-2-Hybrid-Bildschirme ermöglicht direkten Vergleich der Interaktion profile mehrere Köder Proteine mit einem hoch komplexen Satz von Fusionsproteinen Beute. Hier beschreiben wir verfeinerten Methoden, neue Reagenzien und ihre Verwendung für solche Bildschirme zu implementieren.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Wir präsentieren eine einfache Suppressor Bildschirm Protokoll in Kernspaltung Hefe. Diese Methode ist effizient, Mutagen-frei und selektiv für Mutationen, die oft auf einen einzigen genomischen Locus auftreten.  Das Protokoll ist geeignet für die Isolierung von Unterdrücker, die Wachstumsstörungen in Flüssigkultur lindern, die durch eine Mutation oder ein Medikament verursacht werden.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Hier präsentieren wir Ihnen eine erweiterte Hefe One-Hybrid screening Protokoll um den Transkriptionsfaktoren (TFs) zu identifizieren, die an einer menschlichen DNA-Region of Interest binden können. Diese Methode nutzt eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die die Bindung von Verhören kann &gt; 1.000 TFs in einem einzigen Experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.

Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

Die Wechselwirkungen von Biomolekülen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, sind die molekulare Grundlage biologischer Funktionen. Wenn interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten, denen die relevante Interaktion spezifisch fehlt, isoliert werden können, werden sie wesentlich dazu beitragen, die Funktion(en) dieser Interaktion zu verstehen. Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten vor.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte für die Durchführung von Auswahlkampagnen für Hefeoberflächendisplays zur Anreicherung von Proteinvarianten, die an ein Antigen von Interesse binden.

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Erfahren Sie paarungsbasiertes Überexpression-Screening in Hefe zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen. Diese effiziente Methode nutzt Hefepaarung zur Analyse genetischer Faktoren und Protein-Toxizität.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

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