Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der neurodegenerativen Erkrankungen zu beantworten, z. B. welche genetischen Faktoren und Signalwege die Toxizität von krankheitsassoziierten Proteinen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der hocheffiziente Prozess der Hefepaarung genutzt wird, um Hefemodelle gegen eine große Sammlung von Bibliotheksgenen zu vergleichen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Toxizität von Proteinen für neurodegenerative Erkrankungen geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung anderer zellulärer Prozesse in Hefe angewendet werden, wie z. B. die Toleranz gegenüber anderen Stressbedingungen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie fünf Mikroliter Plasmid-DNA pro Vertiefung aus einer angeordneten Plasmidbibliothek auf 96-Well-Platten mit rundem Boden aliquotieren. Halten Sie die Platten bei vier Grad Celsius. Anschließend werden 150 Milliliter Hefe-Pepton-Dextrose oder YPD-Medium in einem 500-Milliliter-Kolben mit einer Kolonie des haploiden Hefestamms W303 Alpha beimpft.

Inkubieren Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie über Nacht bei 200 U/min. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die Kultur nach Messung des OD600 der Nachtkultur auf einen OD600 von 0,1 in zwei Litern YPD. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bei 200 U/min für etwa fünf Stunden, bis die Kultur einen OD600 von 0,4 bis 0,6 erreicht.

Um die Hefekultur zu ernten, füllen Sie acht sterile 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen und zentrifugieren Sie sie bei 3000 xG für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Hefe wie im Textprotokoll beschrieben und verfestigen Sie die Zellen in zwei Zentrifugenröhrchen.

Jedes Zellpellet wird in 25 Millilitern einer 0,1 molaren Lithiumacetatlösung resuspendiert. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen, fügen Sie fünf Milliliter Lachsspermien-DNA hinzu und übertragen Sie sie in einen 150-Milliliter-Kolben. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie es bei 225 U/min für 30 Minuten.

Gießen Sie die Zellmischung nach 30 Minuten in ein steriles Einweg-Reagenzreservoir. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 35 Mikroliter der Zellmischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platten mit rundem Boden, die die zuvor vorbereitete Plasmid-DNA der Bibliothek enthalten. Wirbeln Sie die 96-Well-Platten eine Minute lang bei 1000 U/min vor.

Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius, ohne sie zu schütteln. Stapeln Sie die Platten nicht, damit die Wärme effizienter übertragen werden kann. Nehmen Sie die 96-Well-Platten aus dem 30-Grad-Inkubator und mischen Sie sie 30 Sekunden lang bei 1000 U/min.

Geben Sie 125 Mikroliter Transformationspuffer in jede Vertiefung und wirbeln Sie die Platten dann eine Minute lang bei 1000 U/min. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Dann die Hefe mit einem Hitzeschock foltern, indem Sie die Platten für 15 Minuten in einen 42 Grad Celsius heißen Inkubator legen.

Zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 3000 xG. Entfernen Sie den Transformationspuffer aus den Vertiefungen, indem Sie die Platten über einen Abfallbehälter drehen und den Puffer gewaltsam aus den Platten kippen. Tupfen Sie die umgedrehten Platten schnell auf ein sauberes Papiertuch, um Flüssigkeit auf den Platten zu entfernen.

Spülen Sie die Zellen, indem Sie in jede Vertiefung 200 Mikroliter minimales Dropout-Medium geben, das dem selektierbaren Marker auf dem Bibliotheksplasmid entspricht. Hier kommt synthetisches Ura-Minus-Medium zum Einsatz. Zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 3000 xG.

Entfernen Sie den Überstand über einem Mülleimer, wie zuvor gezeigt. Geben Sie 160 Mikroliter minimales Ura-Minus-Medium mit 2 % Glukose in jede Vertiefung und wirbeln Sie die Platten eine Minute lang bei 1000 U/min durch. Inkubieren Sie die Platten ohne Schütteln bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden.

Nach 48 Stunden sollte ein Pellet aus transformierter Hefe am Boden jeder Vertiefung sichtbar sein. Geben Sie mit einem Flüssigkeitsspender 100 Mikroliter Ura minus glukosehaltiges Medium in jede Vertiefung eines neuen Satzes von 96-Well-Platten. Die Platten mit der umgewandelten Hefe 30 Sekunden lang bei 1000 U/min vortexen.

Setzen Sie die Stifte mit einem sterilen 96-poligen Kunststoffreplikator in die Vertiefungen mit der transformierten Hefe ein und inokulieren Sie sie dann in die entsprechenden Vertiefungen der neuen Platten, die mit dem Medium gefüllt sind. Inkubieren Sie die neuen Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Nach 24 Stunden sollte am Boden jeder Vertiefung ein Hefepellet sichtbar sein, das erfolgreich transformierte Hefe enthält.

Um diese Hefestämme als Glycerinbrühen zu speichern, geben Sie 50 Mikroliter 50%iges Glycerin in jede Vertiefung, wirbeln Sie die Platten 30 Sekunden lang bei 1000 U/min, verschließen Sie die Platten mit Aluminiumfolie und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein. Um die Bibliotheksstämme aus dem Glycerinvorrat wiederzubeleben, nehmen Sie die 96-Well-Platten aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank, entfernen Sie die Aluminiumfolie und lassen Sie die Hefe etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auftauen. Sobald die Hefe aufgetaut ist, verwenden Sie einen sterilen 96-poligen Kunststoffreplikator, um die Glycerinbrühen auf 160 Mikroliter frisches Ura-Minus-Medium mit 2 % Glukose in 96-Well-Platten zu impfen und 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius zu inkubieren.

Verschließen Sie die Platten sofort nach der Verwendung der Bibliotheksstämme und geben Sie sie wieder in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Am selben Tag, an dem die Bibliotheksstämme aufgetaut werden, inokulieren Sie den Abfragehefestamm in 50 Milliliter YPD und wachsen bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min über Nacht. Gießen Sie am nächsten Morgen den Abfragehefestamm in ein steriles Einweg-Reagenzreservoir und aliquotieren Sie 160 Mikroliter des Abfragestamms in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.

Geben Sie mit dem Flüssigkeitsspender 160 Mikroliter YPD-Medien pro Vertiefung in 96-Well-Platten ab. Werfen Sie die 96-Well-Platten, die den Abfragestamm und die Bibliotheksstammplatten enthalten, kurz vor und übertragen Sie dann mit einem sterilen 96-Pin-Replikator die Bibliotheksstämme auf die YPD-Platten, die mit dem Abfragestamm inokuliert wurden. Inkubieren Sie die YPD-Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.

Nach 24 Stunden ist ein Hefepellet am Boden jeder Vertiefung sichtbar. Füllen Sie 96-Well-Platten mit minimalem Drupout-Medium, das 2 % Raffinose enthält, entsprechend den selektierbaren Markern auf dem Plasmid im Abfragestamm sowie auf dem Bibliotheksplasmid. Verwenden Sie einen sterilen 96-Pin-Replikator, um Hefe aus den YPD-Paarungskulturen auf das Selektivmedium zu übertragen.

Inkubieren Sie die 96-Well-Platten 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Nur Hefezellen, die sich gepaart und diploide Zellen gebildet haben und daher sowohl das Abfrageplasmid als auch das Bibliotheksplasmid enthalten, können in diesem Medium wachsen. Nach 48 Stunden Wachstum in dem Raffinose-haltigen Selektivmedium ist zu beobachten, dass ein Pellet am Boden der Vertiefungen sichtbar ist, die diploide Zellen enthalten.

Wirbeln Sie die 96-Well-Platten eine Minute lang bei 1000 U/min vor. Verwenden Sie eine Spottmaschine, um die Hefe auf Agarplatten in vierfacher Ausfertigung auf Ura-his-Droupout-Platten mit 2 % Galaktose und 2 % Agar und auf Ura-his-Droupout-Platten mit 2 % Glukose und 2 % Agar zu setzen. Lassen Sie die Agarplatten nach dem Schmieren trocknen und legen Sie sie dann kopfüber für vier Tage in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator.

Fotografieren Sie alle 24 Stunden die Agarplatten, um das Wachstum der Hefe festzuhalten. Die Toxizität des ALS-assoziierten Proteins FUS wurde zunächst bei diploider Hefe untersucht. Wie die Agarplatte, die Galaktose enthält, die FUS induziert, zeigt, ist die FUS-Toxizität sowohl bei diplod als auch bei haploider Hefe konsistent.

Fünf Gene, die zuvor als Suppressoren der FUS-Toxizität aus einer transformationsbasierten Methode identifiziert worden waren, wurden mit der Paarungsmethode getestet. Spur eins ist ein Kontrollhefestamm, der mit zwei leeren Vektoren transformiert wurde. Spur zwei ist der diploide FUS-Hefestamm mit einem leeren Vektor, bei dem die Expression von FUS sehr toxisch ist.

Die Spuren drei bis sieben zeigen diploide Hefe, die FUS exprimiert, sowie ein Suppressionsgen. Alle fünf Gene retten die Toxizität von FUS in diploider Hefe, was darauf hindeutet, dass die Paarungsmethode effektiv war. Diese paarungsbasierte Methode wurde dann auf ein Überexpressions-Bibliotheksscreening von 940 Genen angewendet.

Und es wird ein Foto von einem repräsentativen Schild gezeigt. Wie auf der Galaktoseplatte, auf der FUS und Bibliotheksgene exprimiert werden, angedeutet, war FUS für die Diplod-Hefezelle toxisch. Das Bibliotheksgen, das durch das grüne Quadrat gekennzeichnet ist, rettete die FUS-Toxizität.

Während das Bibliotheksgen, das durch das rote Quadrat gekennzeichnet ist, die Toxizität erhöhte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 120 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, vorher zu überprüfen, ob der für das Screening verwendete Phänotyp nicht vom haploiden Paarungstyp abhängt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie genetische Faktoren bei Überexpression identifizieren können, die die Toxizität krankheitsassoziierter Proteine in Hefe retten. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik Forschern auf dem Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen den Weg ebnen, um die Mechanismen der Zytotoxizität von krankheitsassoziierten Proteinen im Hefemodell zu erforschen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie der Beta-Galactosidase-Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Rettung spezifisch ist.