Name: Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H+ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Analyse von N-Glykanen aus Raphanus sativus mit PNGase H+. Diese Technik ermöglicht die effiziente Charakterisierung pflanzlicher Glykane ohne Pufferwechsel.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch den Natural Science Foundation of China (Zuschuss Zahlen 31471703, A0201300537 und 31671854, j.v. und l.l., Anzahl 31470435 gewähren, G.Y.), und die 100 ausländische Talente Plan (Grant-Nummer JSB2014012, j.v.).

1. die Probenahme
<ol><li>Verschiedene Sorten von frischem Rettich (Raphanus Sativus L.) zu erwerben.</li>
</ol>2. Isolierung von Proteinen aus Rettich
<ol><li>Ca. 100 g frische Radieschen mit einem Küche Mixer für 10 min zu homogenisieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gülle 50 mL Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C für 20 min die unlösliche Material zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen des Überstands vorsichtig in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen 2 M Trichloressigsäure Säure (TCA) Lösung. Hinweis: Hinzufügen von TCA wird löslich (Glyco) Proteine ausgefällt.</li>
	<li>Bei 14.000 × g bei 4 ° C für 30 min zentrifugieren und den überstand von gebeizte (Glyco) Proteine zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie die Pellets mit 20 mL entionisiertem Wasser und Zentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C für 5 min, lösliche Oligosaccharide und Polysaccharide zu entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5. vier Mal.</li>
	<li>Wieder aussetzen Sie, die Pellets in 1 mL entionisiertem Wasser und Übertragung auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der N- Glykane
<ol><li>Mix 50 µL Proteinlösung aus Schritt 2.7. (Dies entspricht 5 g frische Radieschen) mit 0,2 mU von rekombinanten PNGase H+ in 10 mM-Essigsäure.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C für 12 h. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation bei 14.000 × g für 5 min um die extra-Protein und Enzym zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
</ol>4. Reinigung des N- Glykane
<ol><li>Vorbereiten der Festphasen-Extraktion (SPE) Spalte zu bereichern die N- Glykane und Salze und andere Verunreinigungen zu entfernen, aus dem Reaktionsgemisch, Erhöhung der Selektivität des Fluorogenic 2-aminobenzamid (2-AB) Kennzeichnung Agenten für N- glycan Derivatisierung.<ol>
<li>Fügen Sie 3 mL deionisiertes Wasser, waschen Sie die Spalte hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 3 mL 80 % Acetonitril Lösung mit Trifluoroacetic Säure (TFA, 0,1 % V/V), um aktiv die SPE-Spalte hinzu.</li>
		<li>Hinzugeben Sie 3 mL deionisiertes Wasser für den SPE-Säulen equilibrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Probe von Schritt 3.3 auf die Säule übertragen und die Durchströmung zu verwerfen.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 1,5 mL deionisiertes Wasser, waschen Sie die Spalte und entsorgen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>Eluieren freigegeben N- Glykane aus der Spalte mit 1,5 mL 20 % Acetonitril Wasserlösung mit 0,1 % TFA (V/V) in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel durch zentrifugale verdunsten bei Raumtemperatur. Verdampfen Sie, bis die Probe vollständig trocken ist.</li>
</ol>(5) Fluoreszenz Derivatisierung von N- Glykanen
<ol><li>Bereiten Sie 1 mL 2-AB-Lösung, bestehend aus 35 mM 2-AB und 0,1 M-Natrium-Cyanoborohydride in Dimethyl Sulfoxid/Essigsäure Säurelösung (7:3, V/V).</li>
	<li>Fügen Sie sechs verschiedene Radieschen 5 µL 2-AB-Lösung für die getrockneten Proben (Schritt 4.5.) abgeleitet. Vortex: jede Probe, bis Sie vollständig aufgelöst.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 65 ° c</li>
	<li>Lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur für 5 min abkühlen, und fügen Sie 5 µL deionisiertes Wasser und 40 µL Acetonitril. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 x g für 3 min.</li>
	<li>Übertragen Sie 48 µL aus der Überstand in ein 300 µL High-Erholung-HPLC-Fläschchen. Speichern Sie die derivatisierte N- Glycan Proben bei-20 ° C bis zu einem Monat.</li>
</ol>6. HILIC-UPLC Profilierung der N- Glykane
<ol><li>Analysieren Sie die Proben unter Verwendung eines Standardsystems UPLC bzw. an eine Online-Fluoreszenz-Detectorset bei der Anregung/Emission Wellenlängen von 330 nm/420 nm, angeschlossen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine hydrophobe Wechselwirkung Flüssigkeitschromatographie (HILIC)-UPLC Glycan Spalte an eine Spalte Temperatur von 60 ° C für die Analyse.</li>
	<li>Bereiten Sie Lösungsmittel A durch Verdünnung 50 mL der Stammlösung (1 M Ammonium-Formiat Lösung, pH 4,5) mit 950 mL flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCMS)-Wasser zu benoten. Bereiten Sie die Stammlösung wie folgt:<ol>
<li>700 mL LCMS-Klasse H2O. 43 mL Ameisensäure hinzufügen</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 4,5 durch tropfenweise Zugabe von wässrigen Ammoniaklösung (25 % w/w).</li>
		<li>Das Lösungsmittel auf ein Messzylinder übertragen und LCMS-Klasse H2O. Store bei 4-6 ° C für bis zu 3 Monaten bis zu 1000 mL einfüllen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie LCMS-Grade Acetonitril als Lösungsmittel B.</li>
	<li>N- Glykane mit folgenden Farbverlauf Elution zu trennen:<ol>
<li>Durch das Hinzufügen von 95 % der Lösungsmittel B in Lösungsmittel A. Set die Durchflussmenge bei 0,5 mL/min von 0 bis 44,5 min starten.</li>
		<li>Von 0 min bis 6 min verringern Sie allmählich den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf to78 %.</li>
		<li>Von 6 min bis 44,5 min verringern Sie allmählich den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf auf 55,9 %.</li>
		<li>Von 44,5 min bis 46,5 min schnell verringern Sie den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf von 55,9 % auf 0 % bei 0 % für 2 min halten Sie und initiieren Sie Waschen der Spalte zu. Reduzieren Sie die Durchflussmenge auf 0,25 mL/min von 44,5 auf 55 min.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte weiter durch Lösungsmittel B auf 95 % von 48,5 min bis 50,5 min erhöhen und bei 95 % für 4,5 min halten.</li>
		<li>Re equilibrate der Spalte um die Startbedingungen des 95 % Lösungsmittel B mit 0,5 mL/min von 50,5 auf 57 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie 45 µL der Probe in der UPLC-System.</li>
	<li>Eluieren Sie die N- Glykane von UPLC mit Retentionszeiten zwischen 15 und 40 min.</li>
	<li>Jeder beobachteten UPLC Peak Bruch mit 2 mL Zentrifuge Röhren sammeln und Trocknen der Proben durch zentrifugale verdampfen.</li>
	<li>Injizieren Sie ungefähr 1 Pmol 2-AB mit der Bezeichnung Dextran standard (2−20 Glucose-Einheiten), die Pflanze -N- Glycan Profilierung zu kalibrieren und ihre Elution Zeiten in standardisierten Glucose-Einheiten zuweisen.</li>
</ol>(7) MALDI-TOF-MS-Analyse
<ol><li>Auflösen der Proben aus Schritt 6,8 in 5 µL LCMS-Wasser zu benoten. Mix 1 µL der Probenlösung und 1 µL 6-Aza-2-Thiothymine (ATT) Lösung (0.3 % w/V in wässrigem Acetonitril 70 % V/V) und die Mischung auf die MALDI-TOF-Probenträger Pipette.</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben mit einem MALDI-TOF Massenspektrometer Instrument im positiven Ionen-Modus durch Drücken der Schaltfläche " starten ".</li>
	<li>Analysieren Sie die Massenspektren mithilfe der begleitenden MALDI-TOF-MS-Analyse-Software.</li>
	<li>Interpretieren Sie die Spektren, die mit einer open-Source Glycan Auslegung Software19. Legen Sie die Suchparameter für 2-AB Kennzeichnung [M + Na]+, und legen Sie den Parameter Genauigkeit 2.0 da.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll, die, das wir hier vorgestellt haben, erlaubt den Vergleich der N- Glycan Profile von verschiedenen Sorten von Rettich. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Protokolle ist, dass keine Puffer Änderungen zwischen die enzymatische Freisetzung von N- Glykanen und der Derivatisierung Reaktion mit 2-AB erforderlich sind. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Reinigung von N- Glykanen mit der Spalte "SPE" als Verstoß gegen Salze zu entfernen oder...

N- Glykane in Pflanzen haben erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren gezogen, wie die bisherige Forschung N- Glykane als eine potenzielle Quelle für immunologische Kreuzreaktionen hervorhob, die allergische Reaktionen1,2 provozieren kann . Es nachweislich bereits, dass N- Glykane auf Pflanze Glykoproteine katalytische Aktivität3,4, Thermostabilität und klappbare5,6 oder subzelluläre Lokalisierung beeinflussen kann und Sekretion7. Um die Glycan-Strukturen mit ihren jeweiligen Funktionen zu korrelieren, muss N- Glykane zuerst aus Glykoproteinen entweder chemisch oder enzymatisch entlassen werden. Die klassische chemische Methode für die Freigabe von N- und O- Glykanen ist β-Eliminierung, in denen alkalische Probenbehandlung durch Reduktion mit Natriumborhydrid ein Alditol8weichen begleitet wird. Jedoch dieses Verfahren schließt mit einem Fluorophore beschriften und verursacht erhebliche Verfall der Monosaccharid-Einheiten aus der reduzierenden Ende der Glycan Struktur. Chemische Deglycosylation basierend auf Ammonium Hydroxid/Carbonat Behandlung ist auch eine häufig verwendete alternative Methode9. Keines dieser Verfahren chemische Freisetzung verschlechtert intakte Proteine, die massenspektrometrische Analyse der unbeschrifteten Glycan Pools ohne die Einmischung von Peptid-Fragmente in den gleichen Massenbereich ermöglicht. Ein Nachteil dieser Methoden ist jedoch die erhöhte Abbaurate von α1, 3-Fucosylated N- Glykane, eine gemeinsame Struktur der Kohlenhydrate in Pflanzen10gefunden. Alternativ, enzymatischen Freisetzung von Methoden mit Peptid:N- Glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) werden auch eingesetzt. Rekombinante PNGase F (von Flavobacterium Meningosepticum) ist die häufigste Wahl und erlaubt die Freigabe aller Arten von N- Glykanen, außer die Strukturen mit einem Kern α1, 3 Fucose11,12. PNGase A (isoliert aus Mandel Samen) ist daher in der Regel für die Analyse der Anlage N- Glykane13verwendet. Jedoch dieses Enzym Deglycosylates nur proteolytisch abgeleitete Glykopeptide, und ist nicht in der Lage, Deglycosylate native Glykoproteine14. Daher ist eine mehrstufige Probe Aufarbeitung vor weiteren Analyse erforderlich, die umfangreichen Verlust von Glykoproteinen, insbesondere der niedrige Fülle15führt. Das übergeordnete Ziel der Methode ist, einen optimierten Arbeitsfluss für N- Glycan Release und Fluoreszenz-Beschriftung in eine einfache und robuste Art und Weise zu präsentieren. Die zugrunde liegende Logik ist, dass PNGase H+, das war vor kurzem in Terriglobus Roseus entdeckt und in E. Colirekombinant ausgedrückt werden kann, können N- Glykane direkt aus dem Protein-Gerüst in sauren hydrolyseneigung Bedingungen-16. Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von PNGase H+ gegenüber alternativen Methoden ist, dass fluoreszierende Kennzeichnung Reaktionen in der selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden können, ohne die Reaktion Puffer17,18. Die einfache Zubereitung Bedingungen und hohe Rückgewinnung von niedrig-Fülle Oligosaccharide machen diese Methode ein wertvolles Werkzeug in der Analyse von N- Glykanen. Dieses Protokoll eignet sich für die Analyse der N- Glykane von verschiedenen Pflanzenarten.

<table><tbody><tr><td><stark>Chemikalien: </stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure&nbsp;</td><td>SCR, Shanghai</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure Gletscher</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Allgemeines Reagenz</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Energiechemikalie</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-Aminobenzamid</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydrid</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB-markierte Dextranleiter, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>Werkzeuge/Materialien: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küchenmixer</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalverdampfer</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE Säule</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE Säule</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Massenspektrometer</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Analyse:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-Recovery HPLC Fläschchen</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzdetektor für HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Säulenofen</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Säule</td><td>Wasser</td><td>Acquity UPLC BEH Glykansäule</td><td>2,1 & mal 150 mm, 1,7 &mu; m Partikelgröße</td></tr><tr><td>Wasser in LCMS-Qualität</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril in LCMS-Qualität</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniaklösung</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der n- glykane von raphanus sativus sorten verwenden pngase h+

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

In den letzten Jahren haben die Kohlenhydrat-Moieties Pflanzen beträchtliche Aufmerksamkeit empfangen, da sie eine potentielle Quelle von kreuzreaktiven, Allergie provozieren Immunantworten sind. Darüber hinaus auch spielen Kohlenhydrat-Strukturen eine entscheidende Rolle im Stoffwechsel der Pflanze. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode für die Vorbereitung und Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus) mit einem N- Glycanase speziell für die Freisetzung von pflanzliche Kohlenhydrat-Strukturen. Um dies zu erreichen, wurden grobe Trichloressigsäure Säure Ausscheidungen von Rettich Homogenates mit PNGase H+behandelt und mit 2-aminobenzamid als fluoreszierende Tag gekennzeichnet. Die beschrifteten N- Glycan Proben wurden anschließend durch ultra-Performance liquid Chromatography (UPLC) Trennung und Matrix-assisted Laser Desorption ionisation-Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF) für eine detaillierte Struktur-analysiert. Bewertung und die relative Abundancies der Rettich abgeleitet N- Glycan Strukturen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auch für die Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen anderen Pflanzenarten verwendet werden und kann für weitere Untersuchungen der Funktion und Wirkung von N- Glykanen auf die menschliche Gesundheit nützlich sein.

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die beschriebene Protokoll, einschließlich der Isolierung von Proteinen (Glyco-) aus Rettich, der Vorbereitung von N- Glykanen, UPLC Analyse und die MALDI-TOF-MS-Analyse dieser Komponenten. Abbildung 2 zeigt repräsentative UPLC Chromatogramme von derivatisierte N- Glykane der analysierten Rettich Sorten. Abbildung 3 zeigt die erzi...

Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode für die Aufbereitung und Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus).

Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der pflanzlichen Glykowissenschaften zu beantworten, z. B. wie N-Glykane pflanzlichen Ursprungs schnell analysiert und charakterisiert werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine Pufferänderungen zwischen der enzymatischen Freisetzung von N-Glykanen und den Derivatisierungsreaktionen mit 2-Aminobenzamid erfordert. Die Prozedur wird von Frau Ya-Min Du und Frau Shen-Li Zhen demonstriert; zwei Doktoranden des Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center an der Nanjing Agricultural University.Um mit der Isolierung der Proteine zu beginnen, verwenden Sie einen Küchenmixer, um etwa 100 Gramm frischen Rettich zehn Minuten lang zu homogenisieren. Übertragen Sie die resultierende Auffrischung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei der 14.000-fachen Schwerkraft bei vier Grad Celsius, um das unlösliche Material zu entfernen.Danach wird der Überstand vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie die gleiche Menge einer zwei molaren Trichloressigsäurelösung hinzu. Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei der 14.000-fachen Schwerkraft bei v

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Eine schnelle Art und Weise beschrieben, Einblicke in die Struktur der Polysaccharide in einer extrazellulären Matrix zu gewinnen. Die Methode nutzt die Spezifität von Glykosylhydrolasen und die Empfindlichkeit der Massenspektrometrie ermöglicht winzige Mengen von Materialien analysiert werden. Diese Technik ist anpassungsfähig, um direkt auf das Gewebe selbst verwendet werden.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

Mit Hilfe spezifischer Glycosidasen um Zucker aus Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE gefolgt zu entfernen, ist eine wertvolle Methode, um glycan Modifikationen am Protein-Proben erkannt und ist eine gute Wahl für die erste Glykobiologie Studien. Veränderungen nach Deglykosylierung kann als Verschiebungen in Gel-Mobilität oder durch Färbung mit glycan empfindliche Reagenzien nachgewiesen werden.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Es wurde ein Hochdurchsatzprotokoll für die kombinierte Proteomik- und Glykomik-Aufreinigung und die LC-MS/MS-Quantifizierung im Plasma entwickelt. Die Deamidierungsanalyse von N-verknüpften Glykosylierungsmotiven war spezifisch für deglykosylierte Stellen. Eine genaue Quantifizierung der N-Glykane wurde durch die Kopplung der filtergestützten N-Glykan-Trennung an die Individualitätsnormalisierung bei der Markierung mit der Glykanhydrazid-Tag-Strategie erreicht.

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Dieser Artikel stellt eine verbesserte Form einer neuartigen Bottom-up-Glykomics-Technik vor, die entwickelt wurde, um das gepoolte Zusammensetzungsprofil von Glykanen in unfraktionierten Bioflüssigkeiten durch die chemische Zerlegung von Glykanen in ihre konstituierenden bindungsspezifischen Monosaccharide für den Nachweis durch GC-MS zu analysieren. Mögliche Anwendungen sind die Früherkennung von Krebs und anderen glykan-affektiven Störungen.

Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Ein Protokoll für die Strukturanalyse von Polysacchariden durch Gelelektrophorese (PACE), mit Mannan als Beispiel, wird beschrieben.

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Immunglobulin G (IgG) N-Glycanwird durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie UPLC charakterisiert. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt. Hier wird eine Einführung in diese experimentelle Methode vorgestellt, so dass sie in der Forschung weit verbreitet werden kann.

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

Das Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) ist eine Hochdurchsatztechnik für die Analyse der Zusammensetzung von Glykanen in biologischen Proben.

Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) für die Hochdurchsatz-Glykananalyse

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Freisetzung von O-Glykanen aus Muzinen und die anschließende Entsalzung, Permethylierung und Analyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie vor.

Profilierung von permethylierten Mucin-O-Glykanen mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie

Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Analyse von N-Glykanen aus Raphanus sativus mit PNGase H+. Diese Technik ermöglicht die effiziente Charakterisierung pflanzlicher Glykane ohne Pufferwechsel.

Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H⁺

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