Name: Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Lernen Sie die Methode zur Beschriftung neu synthetisierter mRNA in Saccharomyces cerevisiae mit 4-Thiouracil zur Quantifizierung der RNA-Polymerase-II-Aktivität. Dieses Protokoll ermöglicht genaue Transkriptionsmessungen unabhängig vom RNA-Abbau.

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Wir danken Laszlo Tora für seine Unterstützung und V. Fisher, K. Schumacher und F. El Saafin für ihre Gespräche. T.B. wurde unterstützt durch ein Stipendium der Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) und der Fondation Bogen. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Agence Nationale De La Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) unterstützt. Diese Studie wurde auch von ANR-10-LABX-0030-INRT, französische Staat von der Agence Nationale De La Recherche unter den Rahmen Programm Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 verwalteten Fonds unterstützt.

(1) Zelle Kultivierung und Rapamycin Erschöpfung der SAGA-Untereinheit
<ol><li>Für jede S. Cerevisiae -Stamm und replizieren impfen einschließlich der Wildtyp oder vergleichslinien, eine einzige Kolonie von einem frischen Teller auf 5 mL YPD Medium (2 % Pepton, Hefeextrakt 1 % und 2 % Glukose).</li>
	<li>S. Cerevisiae Zellen über Nacht bei 30 ° C mit ständiger Bewegung (150 u/min) wachsen.</li>
	<li>Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 von ca. 0,1 in 100 mL YPD Medium und lassen es wachsen, bis die OD600 um 0,8 ist.</li>
	<li>Parallel, impfen eine einzige Kolonie von S. Pombe Zellen aus einem frischen Teller auf 50 mL ja Medium (0,5 % Hefeextrakt; 250 mg/L Adenin, Histidin, Uracil, Leucin und Lysin; 3 % Glukose) und wachsen die Zellen über Nacht bei 32 ° C mit ständiger Bewegung (150 u/min).</li>
	<li>Messen die OD600 S. Pombe über Nacht Kultur und verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 von ca. 0,1 in 500 mL ja Medium und lassen es wachsen, bis die OD600 ca. ist 0,8.</li>
	<li>Für jeden Anker-away S. Cerevisiae -Stamm und replizieren impfen einschließlich der Wildtyp oder vergleichslinien, eine einzige Kolonie von einem frischen Teller auf 5 mL YPD Medium (2 % Pepton, Hefeextrakt 1 % und 2 % Glukose).</li>
	<li>Wachsen Sie die Zellen über Nacht bei 30 ° C mit ständiger Bewegung (150 u/min).</li>
	<li>Am nächsten Morgen Messen Sie OD600, verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 von ca. 0,1 in 100 mL YPD Medium und lassen Sie es wachsen, bis die OD600≈ 0,8.</li>
	<li>Die Kultur von einer Stammlösung von 1 mg/mL (endgültige Rapamycin Konzentration von 1 µg/mL) 100 µL Rapamycin hinzu und lassen Sie die Zellen, die bei 30 ° C mit ständiger Bewegung für die notwendige Zeit für das Protein von Interesse für bedingt aufgebraucht sein, aus dem Zellkern (inkubieren in der Regel reicht 30 min). Verwenden Sie für das Steuerelement eine ähnliche Hefekultur, aber anstatt Rapamycin hinzuzufügen, fügen Sie die gleiche Menge an Dimethyl Sulfoxid (DMSO).</li>
</ol>2. 4tU Etikettierung mit S. Pombe als Spike-in (zählen)
<ol><li>
Bereiten Sie eine frische Lösung von 2 M 4-Thiouracil. Nachdem vorbereitet, halten Sie es bei Raumtemperatur und vor Licht.
	<ol>
<li>Genau wiegen Sie 64,1 mg 4-Thiouracil für jede Kultur S. Cerevisiae und lösen Sie es in 250 µL Dimethylformamid (DMF) oder 250 µL von DMSO.</li>
		<li>Für die S. Pombe Kultur als Spike-in verwendet werden wiegen 320,5 mg 4-Thiouracil und in 1.250 µL von DMSO auflösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S. Cerevisiae und S. Pombe Kulturen für eine Endkonzentration von 5 mM 4-Thiouracil-Lösung hinzu und inkubieren sie 6 min mit ständiger Bewegung bei 30 ° C und 32 ° C, beziehungsweise.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 6 min eine kleine Aliquot der jeweiligen Kultur für Zellzählung. Zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zelle Zähler oder eine Neubauer-Kammer.</li>
	<li>Sammeln der Zellen durch Zentrifugation (2.500 X g) für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand, waschen Sie die Zellen mit eiskalten 1 X PBS und Zentrifuge wieder (2.500 X g, 4 ° C, 5 min).</li>
	<li>Die Gesamtzahl der Zellen in jedem der S. Cerevisiae und S. Pombe Proben zu berechnen.</li>
	<li>Die Zellen in 5 mL eiskaltes 1 X PBS aufschwemmen und S. Cerevisiae mit S. Pombe Zellen mit einem Verhältnis von 3:1 mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellen (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), entfernen Sie die PBS Schockfrosten der Zellen in flüssigem N2und die Probe bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.</li>
</ol>(3) RNA-Extraktion und DNase-Behandlung
<ol><li>Auftauen der Zellen für ca. 20-30 min auf Eis.</li>
	<li>Fahren Sie mit der RNA-Extraktion mit einem Hefe-RNA-Extraktion-Kit (Table of Materials) mit ein paar Anpassungen.</li>
	<li>Pro jede Probe Gießen Sie 750 µL eiskalte Zirkonia Perlen in ein 1,5 mL Schraubverschluss-Röhrchen mit dem Kit geliefert. Denken Sie daran, dass pro jedes Rohr RNA aus bis zu 109 Zellen effizient extrahiert werden kann. Bereiten Sie daher die Anzahl der Rohre notwendig für jede Probe. Beispielsweise kann eine Kultur von S. Cerevisiae 100 ml (OD600≈ 0,8) ca. 2 x 10-9 , 3 x 10-9 -Zellen, im Vorfeld insgesamt 2,7 x 10 Rendern9 , 4 x 10-9 -Zellen insgesamt (nach dem Spike-in einem Drittel der S. Pombe Zellen). In diesem Fall wäre bis zu 3-4 Reaktionsgefäßen pro jede Probe/Zustand/Mutant/Replikation erforderlich.</li>
	<li>Fügen Sie pro jeweils 1 x 10-9 -Zellen 480 µL des Puffers Lyse zur Verfügung gestellt mit dem Kit, 48 µL 10 % SDS und 480 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1, V/V/V).</li>
	<li>Mischen Sie die Zellen mit einem Vortex-Mixer und übertragen Sie sie auf das Röhrchen mit der eiskalten Zirkonia Perlen.</li>
	<li>Platz für die Rohre auf einen Vortex-Mixer-Adapter, drehen Sie den Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit und schlagen für 10 min in die Hefezellen (in einem Raum bei 4 ° C) zu lösen. Alternativ führen Sie Lyse der Zellen in eine automatische Wulst-Schläger.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Rohre bei 16.000 X g für 5 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie sorgfältig die obere Phase (RNA-haltigen Phase) zu einem frischen 15 mL Falcon-Röhrchen. Das Volume wiederhergestellt pro jedes Rohr ist in der Regel um 500 – 600 µL.</li>
	<li>Die 15 mL-Röhrchen mit teilweise gereinigtes RNA, die Bindung Puffer zur Verfügung gestellt mit dem Kit und Mischung gründlich. Pro jeweils 100 µL RNA-Lösung hinzufügen 350 µL Puffer Bindung (d. h., wenn die wässrige Phase Lösung Volumen 600 µL, 2,1 mL des Puffers Bindung sollte hinzugefügt werden).</li>
	<li>Zu den vorherigen Mischung die 100 % Ethanol und mischen Sie gründlich. Pro jeweils 100 µL RNA-Lösung hinzufügen 235 µL 100 % Ethanol (d. h., wenn die wässrige Phase Lösung Volumen 600 µL addieren 1,41 mL Ethanol).</li>
	<li>Bewerben Sie bis zu 700 µL der Mischung aus Schritt 3,9 zu eine Filterpatrone montiert in einem Sammelrohr, beide mit dem Kit versehen.</li>
	<li>Zentrifuge für 1 min bei 16.000 X g. Wenn die Zentrifugation Dauer nicht genug für das Gesamtvolumen der Filter durchlaufen wurde, wiederholen Sie die Zentrifugation für 30 s.</li>
	<li>Die Flow-through zu verwerfen Sie und wiederverwenden Sie, die gleiche sammelröhrchen. Am Filter und Zentrifuge wieder bei 16.000 X g für 1 min eine weitere 700 µL RNA-bindende Puffer-Ethanol-Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Verwerfen Sie der durchströmten und wiederholen Sie die Schritte 3.11 und 3.12 bis die RNA-Lösung abgeschlossen ist.</li>
	<li>Waschen Sie den Filter 2 X mit 700 µL Waschlösung 1. Sammeln Sie waschen Lösung per Zentrifugation bei 16.000 X g für 1 min zu und behalten Sie immer das sammelröhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie den Filter 2 X mit 500 µL Waschlösung 2. Sammeln Sie waschen Lösung per Zentrifugation bei 16.000 X g für 1 min zu und behalten Sie immer das sammelröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei 16.000 X g für 1 min den Filter vollständig trocknen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Filterpatrone auf dem endgültigen Sammelrohr (RNA-geeignete Röhre) und eluieren Sie RNA mit 50 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O (bis 100 ° C vorgewärmt).</li>
	<li>Zentrifuge für 1 min bei 16.000 X g.</li>
	<li>Eluieren Sie RNA wieder (mit dem gleichen Rohr) mit 50 µL vorgewärmten DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O. Stellen Sie sicher, dass das Volumen des Filters durchlaufen hat; Zentrifugieren Sie andernfalls über einen längeren Zeitraum.</li>
	<li>Wenn mehrere Rohre für ein einzelnes Sample verwendet werden, bündeln sie alle in eine Röhre.</li>
	<li>Quantifizieren Sie und überprüfen Sie die Reinheit der Probe mit der entsprechenden Ausrüstung. Hinweis: Während 4tU nur innerhalb neu synthetisierte RNA eingebaut wird, gibt es eine Chance, kleine Verunreinigungen mit DNA. Aus diesem Grund, es ist immer ratsam, die Proben mit DNase behandeln ich. Verwenden Sie die Reagenzien zur Verfügung gestellt mit dem RNA-Extraktion Kit (Table of Materials) nach den Empfehlungen des Herstellers.</li>
</ol>4. Thiol-spezifische Biotinylierungen neu synthetisierte RNA
<ol><li>Passen Sie die Konzentration der RNA mit Abschnitt 3 des Protokolls bis 2 mg/mL erzielt. Aliquoten 200 µg von Gesamt-RNS, für 10 min bei 60 ° C erhitzen und kühlen es sofort für 2 min auf Eis.</li>
	<li>
Hinzufügen der RNA aliquoten, Reagenzien, die in der folgenden Reihenfolge unten genannten: 600 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O, 100 µL biotinylierungen-Puffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] und 10 mM EDTA, in DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O) und 200 µL Biotin-HPDP aus einem Bestand von 1 mg/mL Biotin-HPDP in DMSO oder DMF.
	<ol>
<li>In einigen Situationen tendenziell die Biotin-HPDP-Lösung auszufällen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Löslichkeit in Wasser. In diesem Fall erhöhen Sie die Lautstärke von DMSO/DMF bis zu 40 % das Reaktionsvolumen (RNS-Probe hinzufügen 400 µL DEPC-behandeltem H2O, 100 µL biotinylierungen-Puffer und 400 µL Biotin-HPDP aus einem Bestand von 0,5 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Probe bei Raumtemperatur inkubieren und lichtgeschützt für 3 h, mit sanften Agitation.</li>
	<li>Nach der Inkubation der Rohre ein etwa gleiches Volumen von Chloroform hinzu und mischen Sie kräftig.</li>
	<li>Drehen Sie die Probe bei 13.000 X g für 5 min bei 4 ° C. Dieser Schritt erlaubt die Entfernung von überschüssigen Biotin, die nicht Biotinylate die RNA hat. Alternativ führen Sie diesen Schritt mit Phase-Lock Röhren (schwer). Dafür spin-down Phase-Lock Röhren für 1 min bei 13.000 X g, fügen Sie die RNA-Mischung und eine gleiche Menge von Chloroform, mischen sie kräftig und Zentrifugieren sie 13.000 x g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie die obere Phase in neuen 2 mL Röhrchen sorgfältig.</li>
	<li>Ein Zehntel des Volumens von 5 M NaCl und Mischen der Probenmaterials.</li>
	<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen von Isopropanol, durchmischen der Probenmaterials und drehen es mit 13.000 X g für mindestens 30 min, bei 4 ° c</li>
	<li>Vorsichtig entfernen Sie den überstand zu und fügen Sie 1 mL eiskaltem 75 % Ethanol.</li>
	<li>Drehen Sie mit 13.000 X g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Sorgfältig überstand, Quick-Spin den Schlauch entfernen Sie und die restlichen Ethanol-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die RNA-Pellet nicht eintrocknet.</li>
	<li>Hängen Sie die RNA in 100 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O.</li>
</ol>5. Reinigung der neugebildete Bruchteil von insgesamt und unbeschriftete RNA mit magnetischen Beads Streptavidin beschichteten
<ol><li>Erhitzen Sie biotinylierte RNA für 10 min bei 65 ° C und dann kühlen Sie die Proben für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Die biotinylierte RNA (bei einem Endvolumen von 200 µL) 100 µL Streptavidin beschichteten magnetische Beads hinzufügen. Insbesondere empfiehlt es sich, die Perlen, die in der Tabelle der Materialien, da nach Gesprächen mit anderen Labors, diese schien angegeben verwenden, um die konsistente und zuverlässige.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe mit leichten Schütteln für 90 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Legen Sie die Spalten mit dem Kit (Table of Materials) in den Magnetstativ zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Fügen Sie 900 µL Raumtemperatur waschen Puffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, und 0,1 % Tween 20 in DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O) auf die Spalten (Pre-laufen und equilibrate).</li>
	<li>Perlen/RNA Mischung (200 µL) auf die Spalten anwenden.</li>
	<li>Der Durchfluss in 1,5 mL Röhrchen sammeln und wieder auf die gleiche magnetische Spalte anwenden. Bei Bedarf halten Sie diese durchströmten da es den unbeschrifteten RNA-Anteil darstellt.</li>
	<li>Waschen Sie die Spalten 5 X mit steigender Datenmengen Waschpuffer (600, 700, 800, 900 und 1.000 µL).</li>
	<li>Eluieren Sie die neugebildete RNA mit 200 µL 0.1 M DTT.</li>
	<li>Führen Sie eine zweite Elution, 3 min später mit ein gleiches Volumen von 0,1 M DTT.</li>
	<li>Nach eluierenden RNA, 0,1 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,2), 3 Bände von eiskalten 100 % Ethanol und 2 µL von 20 mg/mL Glykogen (RNA-Klasse) und lassen Sie die RNA Niederschlag über Nacht, bei-20 ° C.</li>
	<li>Wiederherstellen der RNS durch Zentrifugieren (13.000 X g für 10 min bei 4 ° C) und in 15 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H20 aufzuwirbeln. Der Anteil der beschriftet, Total RNA wird voraussichtlich rund 2 % - 4 % (in der Regel mehr am unteren Ende), ca. 2,0 µg neu synthetisierte RNA rendern. Diese Menge reicht mehrere qPCR-Experimente, sowie für Microarray/Sequenzierung Analysen machen.</li>
</ol>(6) RT-qPCR Validierung der verschiedenen Fraktionen
<ol><li>CDNA von 2 µg Gesamt-RNS oder 10 µL beschrifteten RNA mit zufälligen Hexamers und die Reverse Transkriptase Wahl, nach den Anweisungen des Herstellers (Table of Materials) zu synthetisieren.</li>
	<li>Verstärken Sie die cDNA durch Echtzeit-qPCR Standardprotokolls (Table of Materials). Hinweis: Alle Beispiele sollten in dreifacher Ausfertigung von einem Minimum von zwei biologischen Wiederholungen ausgeführt werden. Korrigieren Sie alle Rohwerte für den Ausdruck von S. Pombe Tubulin.</li>
</ol>(7) Microarray-Hybridisierung
<ol><li>Hybridisieren RNA-Proben auf bevorzugte Microarray-Chips nach den Anweisungen des Herstellers (für dieses spezielle Protokoll Siehe Tabelle of Materials). Kurz, bereiten biotinylierte cRNA Ziele von 150 ng RNA mit dem Premier RNA Amplifikation Kit (Table of Materials), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Hybridisieren Sie 4 mg fragmentierten cRNAs für 16 h bei 45 ° C und 60 u/min auf Microarray-Chips.</li>
	<li>Waschen Sie, Färben Sie, und Scannen Sie die Chips unter Verwendung der angegebenen Station und Scanner (Table of Materials). Extrahieren Sie die Rohdaten (CEL-Intensität-Dateien) aus den gescannten Bildern unter Verwendung der Befehlskonsole (AGCC, Version 4.1.2).</li>
	<li>Die CEL-Dateien mit Ausdruck Konsole Softwareversion 1.4.1 berechnen Sonde Signalintensitäten, mit den Statistiken basierende Algorithmen MAS 5.0 mit Standardeinstellungen und global-scaling-als Normalisierung Methode gesetzt weiter zu verarbeiten. Hinweis: Die getrimmte mittlere Ziel Intensität jeder Chip wurde willkürlich auf 100 festgelegt. Durchführen Sie alle Experimente mit mindestens zwei unabhängige biologische Wiederholungen. Raw-Daten mit dem S. Pombe Signal zu normalisieren und Falte Veränderungen im gesamten und neu synthetisierte RNA-Ebene zu berechnen.</li>
</ol>8. Daten Analyse mit einer bestehenden R-Pipeline
<ol><li>Berechnen Sie Synthese und Verfall der Preise mit einer Rohrleitung und R/Bioconductor Paket öffentlich zugänglich, wie zuvor beschrieben8,10.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während genomweite Tools, um Veränderungen in der Transkription zu analysieren noch zu verbessern sind, könnte die einzige Analyse des transkriptoms durch die Quantifizierung der Steady-State Ebenen der RNA nicht Änderungen in RNA Polymerase II Aktivität widerspiegeln. MRNA-Niveaus sind in der Tat nicht nur durch die RNA-Synthese, sondern auch durch ihre Reifung und Abbau geregelt. Zur Messung der mRNA-Synthese von mRNA Abbau abgekoppelt wurden unterschiedliche Protokolle in den letzten Jahren für die Analyse der im Ents...

Zellen reagieren auf endogene und exogene Signale durch die dynamische Veränderung ihrer Gen-Ausdruck-Programm. In den letzten Jahren ermöglicht eine enorme Entwicklung der genomweiten Methoden die genaue und umfassende Beschreibung der Transkriptom Änderungen unter verschiedenen Bedingungen. In den meisten transkriptomischen Studien Microarray-Hybridisierung oder Hochdurchsatz-Sequenzierung werden verwendet, um RNA Levels von einem gesamten stationären RNA Bruchteil zu quantifizieren. Transcriptional Änderungen unter einer bestimmten Störung können eine Vielzahl von Möglichkeiten, mit Veränderungen der spezifischen Genexpression oder ein großes Spektrum von Genen wird entweder auf- oder herunterreguliert anzeigen. Gen-Ausdrucks ergibt sich aus einem fein abgestimmten Gleichgewicht – oder stationären — zwischen RNS-Synthese von RNA-Polymerasen und andere Prozesse, die RNA-Ebene. RNA-Polymerase II Transkription, einschließlich seiner drei Phasen (Einleitung, Verlängerung und Kündigung) ist hoch und aufwendig mit mRNA Verarbeitung, zytoplasmatischen Export, Übersetzung und Abbau verbunden.
Mehrere neuere Studien gezeigt, dass mRNAs Synthese und Verfall gekoppelten Mechanismen und zeigte, dass transkriptionelle Effekte auf Mutation oder unter Reize bei der Quantifizierung der gesamten stationären RNA übersehen werden können. Erstens hängt die Erkennung von transcriptional Änderungen durch die Analysen der Steady-State Ebenen der mRNA immer mRNAs Halbwertszeit. Sobald die Störung eingeführt wird, werden die Steady-State Ebenen der mRNAs mit langen Halbwertszeiten viel weniger als die der mRNAs mit kurzen Halbwertszeiten betroffen sein. Daher ist die Nachweisbarkeit der Veränderungen in der RNS-Synthese stark zu Gunsten der kurzlebigen Transkripte, voreingenommen, während die Analyse der langlebigeren mRNA-Spezies Scheitern könnte, um dynamische Veränderungen der Transkription Rate zu offenbaren. Zweitens: mehrere Berichte haben gezeigt, dass sowohl in Hefe und Säugetiere, globale Veränderungen in der Transkription übersehen werden könnten, wenn die Steady-State Ebenen der mRNA zu analysieren. Dies ist wahrscheinlich auf die Mechanismen, die mRNA-Synthese und Degradation mRNA Pufferung zu verknüpfen. Dies veranlasste die Entwicklung neuer Protokolle, mRNA-Synthese, die losgelöst vom Abbau durch die Analyse der neu transkribierte mRNA zu quantifizieren. In den letzten Jahren wurden mehrere Alternativen vorgestellt, darunter globale Nachlauf Sequenzierung (GRO-Seq)1und native Dehnung Transkript Sequenzierung (NET-Seq)2,3. Hier präsentieren wir ein Protokoll zunächst in Säugerzellen4,5,6 entwickelt und dann an Hefe7,8,9,10, 11, basiert auf RNA, die Kennzeichnung mit einem Thiolated Nukleosid oder base Analog, 4-Thiouridine (4sU) oder 4-Thiouracil (4tU), beziehungsweise.
Diese Methode reinigt speziell neu transkribierten RNA aus den Zellen in die RNA mit 4sU mit praktisch keine Einmischung in die Zelle Homöostase Puls gekennzeichnet sind. Daher, sobald die Zellen 4sU ausgesetzt sind, ist das Molekül schnell Uptaken, um 4sU-Triphosphat phosphoryliert, und in RNA transkribiert wird. Sobald Puls-Label, es ist möglich, insgesamt zelluläre RNA (entsprechend Steady-State Ebenen der RNA) extrahieren und anschließend mit der Bezeichnung von 4sU RNA ist Thiol-speziell modifiziert, was zur Bildung einer Disulfid Bindung zwischen Biotin und die neu transkribierten RNA4,5. 4sU kann jedoch nur Uptaken durch die Zellen einen Nukleosid-Transporter, wie der menschliche equilibrative Nukleosid-Transporter (hENT1), verhindert den unmittelbaren Einsatz in Knospung oder Spaltung Hefe zum Ausdruck zu bringen. Während eines hENT1 in S. Pombe oder S. Cerevisiaeausdrücken könnte, kann ein einfacher Ansatz erreicht werden durch die modifizierte base 4tU da 4tU, ohne die Notwendigkeit des Ausdrucks eines Nukleosid-Transporter-10, Hefe-Zellen aufnehmen kann 11 , 12 , 13. In der Tat, der Stoffwechsel von 4tU erfordert die Aktivität des Enzyms Uracil-Phosphoribosyltransferase (UPRT). In einigen Organismen, einschließlich Hefe aber keine Säugetiere ist UPRT für eine Pyrimidine Salvage Pathway recycling Uracil, Uridin Monophosphate.
Eine wichtige Voreingenommenheit in transkriptomischen Studien kann durch die Normalisierung zwischen verschiedenen Proben analysiert parallel eingeführt werden. In der Tat können viele abweichende Faktoren beeinflussen die vergleichende Analyse des transkriptoms Mutanten und Wildtyp Stämme: die Effizienz der Zelle Lysis, Unterschiede in der Gewinnung und Verwertung von RNA und Abweichungen in der Scanner-Kalibrierung für Microarray Analysen , unter anderem. Wie oben besprochen, können solche Schwankungen besonders irreführend sein, wenn globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription zu erwarten sind. Eine eleganteste Mittel genau mRNA Synthese Preise zwischen verschiedenen Proben vergleichen wurde mithilfe der weitläufig verwandten Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe als interner Standard entwickelt. Dafür eine feste Anzahl von S. Pombe beschriftet S. Cerevisiae Proben, Wildtyp oder mutierte Zellen vor der Zelle Lysis und RNA-Extraktion10Zellen hinzugefügt wird. Anschließend werden Steady-State und neugebildete RNAs von S. Pombe und S. Cerevisiae durch RT-qPCR oder über die Verwendung von Microarray-Chips oder Hochdurchsatz-Sequenzierung10quantifiziert. Zusammenführung dieser Daten mit kinetische Modellierung, können absolute Preise der mRNA-Synthese und des Verfalls in der angehenden Hefe gemessen werden.
Im Rahmen dieser Handschrift zeigen wir, wie die Analyse der neu transkribierten RNA erlaubt, um eine globale Rolle zu offenbaren, weil die Coactivator komplexe SAGA und TFIID RNA Polymerase II Transkription in angehende-14,15Hefe, 16. Wichtig ist, frühere Studien Steady-State mRNA-Niveaus in S. Cerevisiae quantifiziert und vorgeschlagen, dass SAGA spielt eine vorherrschende Funktion auf eine begrenzte Anzahl von Hefe Gene die stark betroffenen durch Mutationen im SAGA, aber relativ resistent gegenüber TFIID Mutationen,17,18,19. Überraschenderweise zeigten die SAGA enzymatischen Aktivitäten auf dem gesamten transkribierten Genom, was auf eine größere Rolle für diese Coaktivator in RNA Polymerase II Transkription handeln. Verminderte RNA Polymerase II Rekrutierung an am meisten exprimierten Genen wurde beobachtet, bei der Inaktivierung von SAGA oder TFIID, was darauf hindeutet, dass diese Koaktivatoren auf die meisten Gene zusammenarbeiten. Daher zeigte die Quantifizierung der neu transkribierte mRNA, SAGA und TFIID für die Transkription von fast allen Genen durch RNA-Polymerase II14,15,16erforderlich. Die Umsetzung der Kompensationsmechanismen entpuppt sich als eine Möglichkeit für die Zellen mit einem globalen Rückgang der mRNA-Synthese durch eine gleichzeitige weltweite Abnahme der mRNA Abbau gepuffert ist zu kämpfen. SAGA fügt in die Liste der Faktoren, die eine globale Auswirkung auf RNA Polymerase II Transkription, wie z. B. RNA Pol II Untereinheiten10, der Mediator Coactivator Komplex20, die allgemeine Transkription Faktor TFIIH21,22 , und indirekt, Elemente der mRNA Abbau Maschinen9,10,23. In SAGA Mutanten, Bilanzierung von bescheiden und begrenzte Änderungen im Steady-State mRNA-Niveaus trotz eines globalen und schweren Rückgangs der mRNA-Synthese-14wurden allgemein solche kompensatorische Ereignisse beobachtet. Ähnliche Untersuchungen wurden auch in einem BRE1 Löschung Stamm, was zu einem vollständigen Verlust des Histon H2B Ubiquitination durchgeführt. Interessanterweise konnte wesentlich milder, aber konsequente globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription nachgewiesen werden, bei fehlender Bre1, darauf hinweist, dass metabolische Kennzeichnung neu transkribierten RNA in Hefe erkennen und eine Vielzahl von Änderungen in mRNA zu quantifizieren Synthese-Preise.

<table><tbody><tr><td>4-Thiouracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboPure RNA-Aufreinigungskit, Hefe</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-freies Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Thiolutin</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro; MACS Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptor Reverse Transkriptase</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Hefegenom 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000</td><td>7G ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae beschriftung mit 4-thiouracil und quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mrna als proxy für rna-polymerase ii aktivität

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Globale Mängel in der RNA-Polymerase II Transkription könnte durch transkriptomischen Studien analysieren stationären RNA überblickt werden. Der weltweite Rückgang der mRNA-Synthese ist in der Tat nachweislich durch eine gleichzeitige Abnahme der mRNA Abbau zu normalen stationären wiederherstellen kompensiert werden. Daher ist die genomweite Quantifizierung der mRNA-Synthese, unabhängig von mRNA Decay, die beste direkte Reflexion der RNA-Polymerase II transkriptionelle Aktivität. Hier diskutieren wir eine Methode verwenden, nicht störend metabolische Kennzeichnung der im Entstehen begriffenen RNAs in Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae). Insbesondere die Zellen sind für 6 min. mit einem Uracil analog, 4-Thiouracil kultiviert, und die beschrifteten neu transkribierten RNAs sind gereinigt und quantifiziert, um die Synthese von allen einzelnen mRNA zu bestimmen. Darüber hinaus mit Schizosaccharomyces Pombe Zellen beschriftet, als interner Standard ermöglicht Vergleich der mRNA-Synthese in verschiedenen S. Cerevisiae Stämme. Mithilfe dieses Protokolls und Anpassung der Daten mit einem dynamischen kinetischen Modell, können die entsprechende mRNA Decay Tarife ermittelt werden.

Bei der metabolischen Kennzeichnung neu transkribierten RNA mehrere Aspekte kontrolliert werden müssen: die Zeit und Effizienz die Kennzeichnung der Spike-Anteil, die Extraktion-Protokoll und die biotinylierungen Wirksamkeit (einschließlich Signal-Rausch-Verhältnis), unter anderem. Diese Bedingungen wurden ausgiebig und methodisch von anderen7,10,11gezeigt. Hier konzentrieren wir uns hauptsächlic...

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die AKTIVITÄT der RNA-Polymerase II widerspiegelt, indem sie neu synthetisierte mRNA misst, die nicht durch den RNA-Abbau beeinflusst werden. Dieses Protokoll wurde ursprünglich mit Hilfe der Mikroarray-Hybridisierung beschrieben, kann aber leicht zur hochdurchdachten Sequenzierung von neu transkribierter mRNA übernommen werden. Demonstriert wird dieses Verfahren von Tiago Baptista, einem ehemaligen Grad-Studenten aus unserem Labor.Nach der Impfung der S.cerevisiae Zellen, wachsen sie über Nacht bei 30 Grad Celsius mit konstanter Agitation bei 150 U/min. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte bei 600 Nanometern. Verdünnen Sie die Kultur auf eine OD600 von etwa 0,1 in 100 Milliliter YPD Medium.Wachsen Sie die Zellen, bis die OD600 ist etwa 0,8. Danach messen Sie die OD600 der S.pombe Übernachtungskultur. Verdünnen Sie diese Kultur auf eine OD600 von etwa 0,1 in 500 Milliliter YAS-Medium und lassen Sie es wachsen, bis die OD600 etwa 0,8 ist.Zuerst bereiten Sie eine frische Lösung von zwei molaren Vierthiouracil. Halten Sie die vorbereitete Lösung bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Fügen Sie die Vier-Thiouracil-Lösung zu den S.cerevisiae und S.pombe Kulturen, so dass die endgültige Konzentration beträgt fünf Millimolar.Die S.cerevisiae und S.pombe Kulturen bei 30 Grad Celsius bzw. 32 Grad Celsius mit ständiger Agitation für sechs Minuten inkubieren. Danach entfernen Sie ein kleines Aliquot jeder Kultur und zählen Sie die Zellen entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einer Neubauer-Kammer. Zentrifuge bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu sammeln.Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit eiskalt ein mal PBS. Zentrifuge wieder bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Als nächstes, setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter eiskalt ein Mal PBS.Mischen Sie die S.cerevisiae und S.pombe Zellen in einem Verhältnis von drei zu eins. Zentrifugieren Sie die gemischten Proben bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dann entfernen Sie die PBS und blitzen die Zellen in flüssigem Stickstoff einfrieren.Bewahren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie die Zellen auf Demeis für etwa 20 bis 30 Minuten auf. Verwenden Sie ein angepasstes Hefe-RNA-Extraktionskit, um die RNA zu extrahieren, wie im Textprotokoll beschrieben.Danach die Filterpatrone in das endgnohe Entnahmerohr übertragen. Elute die RNA mit 50 Mikroliter DEPC-behandeltem RNase-freiem Wasser, das auf 100 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute.Verwenden Sie dann 50 Mikroliter vorgewärmtes, mit DEM DEPC behandeltes RNase-freies Wasser, um die RNA wieder in dieselbe Röhre zu bringen. Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenvolumen durch den Filter gegangen ist. Ist dies nicht der Fall, zentrifugieren Sie wieder für einen längeren Zeitraum.Nach Fertigstellung die Reinheit der Probe mit der entsprechenden Ausrüstung zu quantifizieren und zu überprüfen. Verwenden Sie DEPC-behandeltes nukleasefreies Wasser, um die Konzentration der zuvor erworbenen RNA auf zwei Milligramm pro Milliliter einzustellen. Aliquot 200 Mikrogramm gesamter RNA und erhitzen sie bei 60 Grad Celsius für 10 Minuten.Sofort zwei Minuten auf Eis abkühlen lassen. Fügen Sie 600 Mikroliter DEPC-behandeltes RNase-freies Wasser hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter Biotinylierungspuffer hinzu und fügen Sie dann 200 Mikroliter Biotin HPDP hinzu.Wenn die Biotin HPDP-Lösung aus der Lösung herausfällt, erhöhen Sie das Volumen von DMSO oder DMF um bis zu 40 % des Reaktionsvolumens, wie im Textprotokoll beschrieben. Schützen Sie die Probe vor Licht und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung für drei Stunden. Danach ein ungefähr gleiches Chloroformvolumen in die Rohre geben und kräftig mischen.Zentrifuge bei 13.000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Als nächstes übertragen Sie die obere Phase vorsichtig in neue Zwei-Milliliter-Röhren. Fügen Sie eine Menge von fünf molarem Natriumchlorid in Höhe von etwa 1/10 des Probenvolumens hinzu.Mischen Sie dann die Probe. Zuerst erhitzen Sie die biotinylierte RNA bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann kühlen Sie die Proben auf Eis für fünf Minuten.Fügen Sie der biotinylierten RNA 100 Mikroliter Streptavidin-beschichteter Magnetperlen hinzu. Bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln 90 Minuten bebrüten. Legen Sie die mit dem Kit gelieferten Säulen in den magnetischen Ständer.Als Nächstes fügen Sie 900 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer zu den Säulen hinzu. Tragen Sie die 200 Mikroliter Perle und RNA-Mischung auf die Spalten auf. Sammeln Sie den Durchfluss in 1,5 Milliliter-Röhren und wenden Sie ihn dann erneut auf dieselbe Magnetsäule an.Halten Sie diesen Durchfluss bei Bedarf, da er die unbeschriftete RNA-Fraktion darstellt. Um mit der RT-qPCR-Validierung der verschiedenen Fraktionen zu beginnen, synthetisieren Sie zunächst cDNA, wie im Text beschrieben. Verstärken Sie dann die cDNA durch Echtzeit-qPCR mit einem Standardprotokoll.Die gemessenen Transkripte in Fraktionen, die von Wildzellen gereinigt wurden, die mit und ohne Vierthiouracil kultiviert wurden, bestätigten dieses Verfahren, das speziell markierte RNA reinigt. Die Analyse des spt20 Deltastamms zeigt, dass die Menge der gesamten stationären RNA weitgehend unverändert ist oder für die getesteten Gene nur leicht reduziert wird. Ähnliche Ergebnisse werden für Stämme gesehen, die für bre1 gelöscht wurden.Die Analyse der neu transkribierten RNA im spt20-Delta-Stamm zeigt jedoch eine drei- bis fünffache Abnahme der mRNA-Synthese für alle getesteten Gene. In der Zwischenzeit führt der Verlust von bre1 zu einem diskreteren, aber immer noch sichtbaren Rückgang. Bei unzerstörbarer Erschöpfung von spt7 wird eine strukturelle Untereinheit des Saga-Komplexes, neu transkribierte mRNA-Spiegel, in einem Ausmaß reduziert, das dem Löschstamm ähnelt.Wenn die gesamten RNA-Spiegel durch genomweite Analyse gemessen werden, werden nur wenige Gene gesehen, dass ihre Expressionsniveaus beim Löschen von spt20 entweder durch Regulierung oder Down-Regulierung verändert werden. Die Analyse der neu transkribierten RNA zeigt jedoch, dass die Konzentrationen von über 4.000 Genen bei der Deletion von spt20 signifikant um das Zweifache reduziert werden, was auf eine globale positive Wirkung der Saga auf die Transkription der RNA-Polymerase II bei angehenden Hefen hindeutet. Obwohl diese Methode Einblicke in die Transkription in Saccharomyces cerevisiae liefern kann, wurde sie nur mit leichten Variationen angewendet, durch die Verwendung dieses Protokolls konnten wir eine globale Abnahme der mRNA-Synthese feststellen, die durch eine globale Abnahme des mRNA-Abbaus kompensiert wurde.

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die Durchführung...

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu...

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Die Steady-State-Level spezifischer mRNAs wird durch die Geschwindigkeit der Synthese und der Zerfall der mRNA bestimmt. Genomweite mRNA Abbauraten oder die Zerfallsraten spezifischer mRNAs kann durch Bestimmung mRNA Halbwertszeiten gemessen werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Messung der mRNA-Zerfallsraten in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Die Verwendung von thioliertem Uracil zur empfindlichen und gezielten Reinigung neu transkribierter RNA aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Extrem schnelle und spezifische metabolische Kennzeichnung von RNA In Vivo mit 4-Thiouracil (Ers4tU)

Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit 14C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.

Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie

Wir beschreiben zwei komplementäre Protokolle zur genauen Bestimmung der S-Phasendauer in S. cerevisiae unter Verwendung von EdU, einem Thymidinanalogon, das in vivo eingebaut und mittels Click-Chemie durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Es ermöglicht die einfache Charakterisierung der Dauer der DNA-Replikation und übersehener Replikationsdefekte in Mutanten.

Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae

Die RNA-Sekundärstruktur wurde hauptsächlich in reifer RNA mit Struktursondierungsmethoden beobachtet. Die Co-transkriptionelle Struktur-Tracking-Sequenzierung (CoSTseq) vereint den nuklearen Run-on, der zur Untersuchung der Polymeraseposition auf entstehender RNA verwendet wurde, mit Strukturprobing. CoSTseq ermöglicht dadurch die Beobachtung der RNA-Sekundärstruktur in RNA unter aktiver Transkription.

Vergleichende RNA-Strukturanalyse von entjungen und reifen Transkripten in Saccharomyces cerevisiae

Lernen Sie die Methode zur Beschriftung neu synthetisierter mRNA in Saccharomyces cerevisiae mit 4-Thiouracil zur Quantifizierung der RNA-Polymerase-II-Aktivität. Dieses Protokoll ermöglicht genaue Transkriptionsmessungen unabhängig vom RNA-Abbau.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität (Video) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

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