Name: Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Transfektion primärer Motoneurone aus dem Rückenmark der Maus. Diese Methode ermöglicht die Modellierung neurodegenerativer Mechanismen bei Motoneuronerkrankungen.

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Wir möchten danken, der "Association pour le Développement De La Neurogénétique" für Dr. Jacquier Fellowship und AFM-Telethon für seine Unterstützung durch MyoNeurAlp Strategieplan. Wir möchten auch danke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul und Dr. Georg Haase, die bei der Entwicklung und Verbesserung der Technik teilgenommen und ihr Wissen zu verbreiten.

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Ethikkommission der Institution akzeptiert.
1. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>Bereiten Sie 10 mL von 4 % BSA in L-15 Medium dialysiert.<ol>
<li>Rinderserumalbumin Pulver bei 4 % (w/V) in 10 mL des L-15 Mediums auflösen.</li>
		<li>Ergänzen Sie die Projektmappe, um eine 20 mL-Dialyse-Kassette mit einer 20 kDa Cutoff. Dialyse gegen 500 mL L-15 Medium für 3 Tage unter Unruhe bei 4 ° C. Verändern Sie das L-15 Medium jeden Tag.</li>
		<li>Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm Membran und Aliquot in 15 mL-Tuben. Speichern Sie die Rohre bei-20 ° C. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet die folgenden Verweise: unmodifizierte raw L-15 Medium = L-15 Mittel, sauren L-15 Medium = pH L-15 und L-15 Basismedium = Bicarbonat L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 mL pH L-15 vorzubereiten.<ol>
<li>Stellen Sie den pH-Wert des Mediums L-15: Zuerst füllen eine Waschflasche mit einigen Stücken von Trockeneis. Gas (CO2) in das L-15 Medium zu injizieren, bis die Farbe Orange wird (~ pH 6,4 und ~ 40 Druck). Der pH-Wert kann auch mit einem standard-pH-Meter eingestellt werden.</li>
		<li>Filtern Sie das Medium durch einen 0,22 µm Membran und bei 4 ° C für einen Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mL Bicarbonat L-15 vorzubereiten.<ol>
<li>97,5 mL des L-15 Mediums 2,5 mL 7 % Sodium Bicarbonat hinzu und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die IPCS (Insulin Putrescin Conalbumin Selenit) ergänzt.<ol>
<li>2,5 mg Insulin in 0,5 mL 0,1 M HCl. Add 4,5 mL bidestilliertem Wasser auflösen.</li>
		<li>8 mg Putrescin in 5 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auflösen.</li>
		<li>100 mg in 10 mL PBS Conalbumin auflösen.</li>
		<li>1 mg Natriumselenit in 19,3 mL Wasser auflösen, anpassen des pH-Werts 7,4 und 10-fach verdünnen Sie die Lösung.</li>
		<li>Kombinieren Sie 1 mL Insulinlösung, 1 mL der Putrescin Lösung, 1 mL Conalbumin und 0,1 mL Natrium Selenit Lösung um 3,1 mL IPCS Ergänzung Lösung zu erhalten. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,02 mM Progesteron Lösung.<ol>
<li>Lösen Sie 1 mg Progesteron in 1,6 mL 80 % Ethanol.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Lösung 100-fold in 100 % Ethanol und bei-20 ° c lagern</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mL des kompletten L-15 Medium vorzubereiten.<ol>
<li>Fügen Sie 1,8 mL D-Glucose-Lösung (200 mg/mL) bis 92 mL pH L-15, eine Endkonzentration von 3,5 mg/mL Glukose zu erhalten.</li>
		<li>Kombinieren Sie 1 mL 100 x Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL), 2 mL des Hitze-inaktivierten Pferd Serum, 3,1 mL IPCS-Mix und 0,1 mL Progesteron-Lösung (2 x 10-5 M).</li>
		<li>Filtern Sie das Medium auf eine Membran 0,22 µm und bei 4 ° c lagern</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL Dichte-Gradienten-Lösung (Endkonzentration von 5,5 %) pro Experiment vorbereiten.<ol>
<li>4524 µL L-15 476 µL des kommerziellen 60 % Dichte Gradienten Mediums hinzufügen (wenn möglich ohne rote Phenol den visuellen Kontrast in der Interphase; erhöhen Verdünnungsverhältnisses von 1:10. 5).</li>
		<li>Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für 2 Wochen oder bei-20 ° c eingefroren</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL von Kulturmedien vorzubereiten.<ol>
<li>9,6 mL Neuron Zellkulturmedium 200 µL Medium Ergänzung hinzufügen.</li>
		<li>25 µL des Glutamins und 10 µL 2-Mercaptoethanol fügen Sie 200 µL der Hitze-inaktivierten Pferd Serum (was eher Gliazelle Vorstufen und arbeiten gegen die Verbreitung zu unterscheiden hinzu).</li>
		<li>Filtermedien Sie die durch einen 0,22 µm-Filter.</li>
		<li>Fügen Sie die folgenden neurotrophen Faktoren: ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) auf eine Endkonzentration von 10 ng/mL, und Gehirn abgeleiteten Neurotrophic Factor (BDNF) und Gliazelle abgeleiteten Neurotrophic Factor (GDNF) bei Endkonzentrationen von 1 ng/mL.</li>
		<li>Speichern Sie die Medien bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mL der Dissektion Medien vorbereiten.<ol>
<li>47,05 mL HBSS 2,25 mL Glukose (200 mg/mL) hinzufügen. Fügen Sie 700 µL 1 m HEPES mit pH 7.4. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine 4 % PFA-Lösung.<ol>
<li>Lösen Sie 20 g der PFA in 500 mL PBS.</li>
		<li>Erhitzen Sie unter einer chemischen Haube die Lösung auf 60 ° C und fügen Sie einige Tropfen von 1 M NaOH, bis die Lösung klar wird.</li>
		<li>Filtern Sie die Lösung durch ein Filterpapier und einstellen Sie den pH-Wert auf 7,2. Bei-20 ° c lagern Hinweis: Alternativ andere kommerziellen PFA-Lösungen verwendet und werden auf 4 % im PBS verdünnt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Dissektion Werkzeuge wie Zange, Schere und Silikon Gerichte mit 70 % Ethanol vor Gebrauch und mit Seife reinigen und klares Wasser nach Gebrauch.</li>
</ol>(2) Poly-Ornithin/Laminin (Po/L) Dish Beschichtung
Hinweis: Volumes werden Mantel einer 24-Well-Platte angepasst.
<ol><li>Wenn nötig, im Brunnen ein steril 12 mm Deckglas legen.</li>
	<li>Bestreichen Sie die Brunnen mit 500 µL 10 µg/mL Poly-L-Ornithin-Lösung in Wasser aufgelöst.</li>
	<li>Lassen Sie die Brunnen für 1 h bei Raumtemperatur zu begleichen.</li>
	<li>Die Poly-L-Ornithin-Lösung entfernen und für 30 min an der Luft trocknen.</li>
	<li>Bestreichen Sie die Brunnen über Nacht bei 37 ° C mit 500 µL 3 µg/mL Laminin in Bikarbonat L-15. Hinweis: Brunnen können für 7 Tage im Inkubator bei 37 ° C gespeichert werden. Für lange Inkubationen können hinzufügen von sterilen PBS zwischen den Vertiefungen um mittlere Verdunstung zu vermeiden.</li>
</ol>(3) Dissektion
<ol><li>Eine schwangere Maus zu opfern, wenn die Embryonen im embryonalen Stadium E12.5 sind. Reinigen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Entfernen der Gebärmutter durch Schneiden die beiden Eileiter und die Scheide und steckte es in eine Petrischale gefüllt mit kaltem PBS (ohne Ca2 + Mg2 +).</li>
	<li>Sammeln Sie alle Embryonen und übertragen Sie sie auf frischen, kalten PBS (ohne Ca2 + Mg2 +) in einer Petrischale.</li>
	<li>Setzen Sie ein Embryo in eine Schüssel mit Silikon beschichtet und voller Dissektion Medien (mit HBSS, 4,5 g/L Glukose und 7 mM HEPES pH 7.4). Hinweis: Embryo Dissektion erfolgt unter dem Mikroskop mit sauberen feinen Pinzetten und Scheren. Alternativ kann eine regelmäßige Petrischale ohne Silikon für Dissektion verwendet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Kopf, Schweif und Eingeweide, mit Pinzette als Schere.</li>
	<li>Pflegen Sie den Embryo mit dem Bauch gegen das Silikon mit der Pinzette.</li>
	<li>Mit einem zweiten Paar Zangen Einfügen einer der Tipps in den Zentralkanal des Rückenmarks rostral.</li>
	<li>Schließen Sie die Zange um den dorsalen Gewebe ein paar Millimeter zu reißen.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Schritt in Richtung der kaudalen Seite, bis das gesamte Rückenmark geöffnet ist (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Die rostral Teil des Rückenmarks (zerebrale Stamm) aus dem Körper zu lösen.</li>
	<li>Drehen Sie den Embryo zur Aufrechterhaltung der offenen Rückenmark gegen das Silikon.</li>
	<li>Drücken den rostral Teil des Rückenmarks und ziehen des Embryos durch den Kopf, um das Rückenmark zu extrahieren. Hinweis: Hirnhaut und Dorsal Root Ganglien (DRGs) sollte für den Embryo nicht wegziehen lassen. Andernfalls ziehen Sie vorsichtig entfernt alle verbleibenden Meningen und DRGs noch zum Rückenmark befestigt. An dieser Stelle könnte auch DRGs für sensible Neuron Kultur gesammelt werden (siehe Diskussion).</li>
	<li>Glätten Sie das Rückenmark auf das Silikon und entfernen Sie die dorsale Hälfte der Schnur durch Schnitt entlang der Mitte jeder Seite mit einem Skalpell. Mittelteil in 10 Stücke mit einem Skalpell schneiden und die Stücke zu einem neuen Schlauch übertragen.</li>
</ol>(4) Rückenmark Zellsuspension
<ol><li>Wiederholen Sie diese Präparation für 6 bis 8 Rückenmark.</li>
	<li>Lassen Sie das Rückenmark Stücke sammeln sich am Boden des Rohres und der HBSS mit 1 mL Schinken-F10-Medium zu ersetzen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL von Trypsin (2,5 % w/V; Endkonzentration 0,025 %). Inkubieren Sie das Rohr für 10 min bei 37 ° c</li>
	<li>Um die enzymatische Verdauung zu stoppen, übertragen Sie die Fragmente auf eine neue 15 mL Tube mit 800 µL des kompletten L-15 Medium, 100 µL von 4 % (w/V) BSA und 100 µL der DNase (1 mg/mL in L-15 Medium).</li>
	<li>Genannte zweimal durch Absaugen von 1 mL mit einer Pipette P1000. Lassen Sie die Fragmente für 2 min. Sammeln der Überstand in ein frisches 15 mL-Tube zu begleichen.</li>
	<li>Die Fragmente fügen Sie hinzu, 900 µL des kompletten L-15 Medium, 100 µL von 4 % (w/V) BSA und 100 µL der DNase (1 mg/mL in L-15 Medium).</li>
	<li>Genannte 6 Mal durch Absaugen von 1 mL mit einer Pipette P1000. Lassen Sie die Fragmente für 2 min. Add Regeln Schritt 4.5 der Überstand an der 15 mL Tube abschloss.</li>
	<li>Die Fragmente fügen Sie hinzu, 900 µL des kompletten L-15 Medium, 100 µL von 4 % (w/V) BSA und 100 µL der DNase (1 mg/mL in L-15 Medium).</li>
	<li>Genannte 10mal durch Absaugen von 1 mL mit einer Pipette P1000. Lassen Sie die Fragmente für 2 min. Add Regeln Schritt 4.5 der Überstand an der 15 mL Tube abschloss. Fahren Sie mit der Überstand.</li>
	<li>Legen Sie eine 2 mL BSA 4 % (w/V) Polster mit einem P1000 pipettieren, sanft am unteren überstand Rohr. Bei 470 X g für 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 2 mL des kompletten L-15 Medium.</li>
</ol>(5) MN Anreicherung von Gradient Dichte
<ol><li>Die Zellsuspension in zwei Röhren in 15 mL (1 mL) aufgeteilt. Fügen Sie 2 mL des kompletten L-15 Medium. Wenn mit 6 Embryonen ab, verwenden Sie den Gegenwert von 3 Embryonen pro Röhre in 3 mL Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL Dichte-Gradienten-Lösung hinzu, indem Sie langsam die Lösung am Ende jedes Rohr eine scharfe Oberfläche zu erhalten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 830 X g für 15 min bei Raumtemperatur. Nach diesem Schritt sollte kleine Zellen an der Unterseite des Rohres, große Zellen wie MNs an der Dichte-Gradienten-Lösung/Medium-Schnittstelle vorzusehen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen an der Schnittstelle von 1 oder 2 mL Absaugen und übertragen Sie sie auf einem frischen 15 mL-Tube. Stellen Sie die Lautstärke auf 10 mL mit L-15 pH-Wert Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL 4 % BSA Kissen an der Unterseite des Rohres und Zentrifuge bei 470 X g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellets in 3 mL des kompletten L-15 Medium.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5.5.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL komplette Kulturmedium. Zählen Sie die Handynummer und die Lebensfähigkeit unter dem Phase-Kontrast-Mikroskop mit einer Hemocytometer. Hinweis: Für 6 Rückenmark ist die Zellzahl voraussichtlich rund 1 x 105 MNs.</li>
</ol>(6) MN-Kultur
<ol><li>Verdünnen Sie die MNs auf die entsprechende Dichte, in der Regel 5.000 bis 10.000 Zellen in 500 µL Kulturmedium pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte. Hinweis: Dichte Aussaat um 30.000 und 1.500 Zellen für 6 und 96-Well-Platten, bzw. ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Laminin-Lösung mit einem P1000.</li>
	<li>Sofortüberweisung der MNs in die Lackplatten in Kulturmedium verdünnt, um Austrocknen zu vermeiden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kultur für 2 Tage bei 37 ° c</li>
</ol>7. Magnetofection des MNs
Hinweis: In den folgenden Schritten sind die verwendeten Mengen für die Transfektion von einem Brunnen von einer 24-Well-Platte gedacht. Entnehmen Sie bitte den Hersteller Protokoll für ein anderes Format.
<ol><li>Für die DNA-Vorbereitung, Aufschwemmen 1 µg DNA in 50 µL der neuronalen Kulturmedium und Vortex für 5 s.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie für Perle Rohrvorbereitung 1,5 µL Perlen in 50 µL der neuronalen Kulturmedium.</li>
	<li>Die 50 µL DNA-Lösung 50 µL Wulst Lösung hinzufügen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren (Gesamtvolumen = 100 µL).</li>
	<li>Während diese Inkubation auszahlen Sie 100 µL Kulturmedium aus dem Brunnen, der transfiziert werden wird. Hinweis: Legen Sie die Magnetplatte im Inkubator es auf 37 ° c erwärmen</li>
	<li>100 µL DNA/Korn-Mix zum Brunnen zu übertragen, und inkubieren Sie die Platte 20-30 min auf der Magnetplatte bei 37 ° C.</li>
	<li>Warten Sie mindestens 24 Stunden vor dem Nachweis der cDNA Ausdruck.</li>
</ol>(8) Fixierung und Färbung
<ol><li>Waschen Sie die Kultur 2 Mal mit PBS.</li>
	<li>Inkubation die Kultur für 20 min bei Raumtemperatur in 4 % PFA/PBS.</li>
	<li>Waschen Sie die Kultur 2 Mal mit PBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kultur in 500 µL blocking-Puffer (PBS, 4 % BSA, 2 % normalen Serum, 0,3 % Triton x-100, 0,1 M Glycin) für 1 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Normale Serum sollte von der gleichen Art wie die sekundäre Antikörper (z. B. Normal Ziegenserum) abgeleitet.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 4 ° C mit Primärantikörper in 250 µL blocking-Puffer verdünnt. Hinweis: Z. B. TUJ1 dient bei 1/1000, SMI32 dient bei 1/1000 und Lc3b wird auf 1/200 verwendet.</li>
	<li>Waschen Sie die Kultur 3 Mal mit PBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kultur mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper verdünnt in 250 µL blocking-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Kultur 3 Mal mit PBS.</li>
	<li>Auf Glas-Objektträger mit Eindeckmedium montieren.</li>
</ol>

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<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die kritischen Punkte in diesem Protokoll gehört, dass die Maus-Embryonen bei einem genauen Zeitfenster während der Entwicklung (E12.5), die Höhe der MNs erhalten am Ende zu optimieren seziert werden. Darüber hinaus sollte für optimalen Ertrag der Dissektion am Morgen oder in den frühen Nachmittag durchgeführt werden. Vor E12.5 (z. B. bei E11.5) ist Dissektion schwierig, insbesondere im Hinblick auf die Beseitigung von der Hirnhaut. Nach E12.5 sinkt die Anzahl der erhaltenen MNs deutlich. Um den Embryostadium de...

Neuromuskuläre Erkrankungen umfassen eine Vielzahl von klinisch und genetisch unterschiedlichen Pathologien, die durch die Veränderung von Muskel und/oder des Nervensystems gekennzeichnet sind. Aufgrund der Fortschritte in Sequenziertechnologien, Hunderte von Genen, die für diese seltenen Erkrankungen wurden während des letzten Jahrzehnts (Liste an Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Die Vielfalt der identifizierten Mutationen bedeutet, dass verschiedene Mutationen in einem einzelnen Gen verschiedene Phänotypen und Krankheiten1,2,3 verursachen können und Mutationen in verschiedenen Genen ähnliche Phänotypen erzeugen kann 4 , 5. in diesem Zusammenhang gibt es Bemühungen, zelluläre Modelle zu entwickeln, die leistungsfähige Werkzeuge für die Analyse von Mutation folgen und pathologischen Mechanismen werden kann.
Spinale MNs haben große Somas befindet sich in der ventralen Hörner des Rückenmarks, Form lange Axone Skelett-Muskelfasern und bewussten Bewegungen durch die Freisetzung von Acetylcholin an neuromuskulären Verbindungen ermöglichen. Da MNs von neuromuskulären Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung (CMT), betroffen sind und spinale Muskelatrophie, Dr. Henderson und Kollegen entwickelt das erste Protokoll6 , die für den Anbau von zulässig in-vitro- Wirbelsäule MNs und die Entdeckung von neurotrophen Faktor GDNF7 (Gliazelle abgeleiteten Neurotrophic Factor). Technische Raffinessen seitdem haben für eine genauere Reinigung von spinalen MNs und ihre Subtypen mit FACS8zugelassen, aber Anreicherung durch Dichtegradienten bleibt kräftig und weit verbreiteten im Labor arbeitet derzeit mit primärer spinaler MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. anschließend, es ist auch möglich, eine höhere Besoldungsgruppe von MN-Reinigung durch Immunopanning zu erhalten, unter Ausnutzung der Oberfläche Marker p75(NTR)15,16,17.
Das Rückenmark enthält verschiedene Subtypen des zervikalen, thorakalen und lumbalen MNs sowie mittlere und seitliche motor Spalten, die sich unter ihren Standort in der Vorderhornzellen auf einer Achse dorsal-Ventral unterscheiden und unter den Zielen sie innervieren8, 18. primäre MN Kulturen aller diese Subtypen MN in physiologischen Verhältnissen erholen können. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist die geringe Anzahl von MNs erhalten am Ende des Verfahrens; in der Tat können voraussichtlich erhalten rund 105 MNs aus sechs Embryonen für Mikroskopie aber einschränkend für Biochemie Experimente geeignet ist. Experimente mit mehr standardisierte Subtypen und reichlich MNs durchführen (> 106 Zellen), embryonale Stammzellen abgeleitet MNs18betrachtet werden.
Transfektion von Wild-Typ/Mutant transgene oder Knockdown endogene Gene in primären MNs ist ein schnelles und hilfreiches Werkzeug für die Entschlüsselung pathophysiologischen Wege, vor allem, wenn Maus-Modellen nicht zur Verfügung stehen. Magnetofection ist eine Technik für transfecting primären Neuronen, ähnlich wie Lipofektion ohne die damit verbundenen Neurotoxizität. Darüber hinaus kann Transfektion auf Reife Neuronen nach mehreren Tagen in Vitro, im Gegensatz zu Techniken basierend auf Elektroporation9durchgeführt werden. Ein Nachteil dieser Technik ist jedoch, dass die Perlen in der Kultur, Lärm in DAPI-labeling Nukleinsäuren binden. Virale Infektion ist wahrscheinlich die effizienteste Technik für transfecting MNs; Magnetofection erfordert jedoch keine bestimmte Sicherheitsvorkehrungen für virale Produktions- und zelluläre Infektion benötigt.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Sezierschale</td><td>Living systems Instrumentierung</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Sylgard</td></tr><tr><td>rundes Deckglas</td><td>NeuVitro, Knittelglas</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Slide a Lyzer Kassetten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20.000 MWCO ; 30 mL</td></tr><tr><td>Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>GP Sterile Spritzenvorsatzfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Platte</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Delta behandelte</td></tr><tr><td>Plattenzange</td><td>FST von Dumont</td><td>11252-20</td><td>#5 Pinzettenschere</td></tr><tr><td></td><td>FST von Dumont</td><td>14060-10</td><td>Feinscherenskalpell</td></tr><tr><td></td><td>FST von Dumont</td><td>10035-20</td> Skalpell <td>mit gebogener Klinge</td></tr><tr><td></td><td>FST von Dumont</td><td>10316-14</td><td>Mikromesser-Skalpell</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Greiner</td><td>663102</td><td>& Schrägstrich; x h = 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>15 mL Polypropylen-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Watman</td><td>1001125</td><td>Kreis, Glaskammer-Objektträger mit 125 mm Durchmesser</td></tr><tr><td></td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 Kammern</td></tr><tr><td>Plasmid pCAGEN</td><td>Addgen</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td><>Lösungen und Medien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium, kein rotes Phenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Poly-DL-Ornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2,5%, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca Mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>ohne Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Neuron Zellkulturmedium</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific A3582901</td><td>Neurobasal Plus Medium</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Medium mit Dichtegrad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>Ergänzungsmedium</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>Pferdeserum hitzeinaktiviert</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/ml</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Immuno Fluoreszenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>ohne Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>normales Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glycin Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Cholin-Acetyltransferase (CHAT)</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament H nicht phosphoryliert (SMI32)</td><td>Biolegenden</td><td>SMI-32P</td><td>IF bei 1/1000</td></tr><tr><td>Islet-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Islet-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vector Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Beta3 Tubulin (Tuj1 Klon)</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF bei 1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2775</td><td>IF bei 1/200</td></tr></tbody></table>

charcot-marie-zahn krankheit in vitro modellierung durch transfecting maus primären motoneurone

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration der spinalen Motoneurone (MNs) ist verwickelt in einem großen Spektrum von neurologischen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit und spinale Muskelatrophie, die Muskelatrophie zugeordnet sind. Primärkulturen von spinalen MNs haben verbreitet zu demonstrieren die Beteiligung bestimmter Gene in solchen Krankheiten und charakterisieren die zellulären folgen deren Mutationen. Dieses Protokoll Modelle eine primäre MN Kultur abgeleitet von der bahnbrechenden Arbeit von Henderson und Kollegen vor mehr als zwanzig Jahren. Zuerst zeigen wir eine Methode der sezieren die vorderen Hörner des Rückenmarks aus einem Maus-Embryo und MNs aus benachbarten Zellen mit einem Dichtegradienten zu isolieren. Dann präsentieren wir Ihnen eine neue Art des effizient transfecting MNs mit Ausdruck Plasmide mit Magnetofection. Schließlich zeigen wir, wie Sie zu beheben und Immunostain primäre zeigt MNs. mit Neurofilament-Mutationen, die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 2 verursachen, dieses Protokoll einen qualitativen Ansatz, mit dem Ausdruck interessierender Proteine und studieren ihre Beteiligung an MN-Wachstum, Wartung und überleben.

Nach 24 Stunden in der Kultur sollte Motoneurone (MNs) zeigen bereits erhebliches axonale Wachstum (mindestens 6 mal länger als die Soma-Größe). In den folgenden Tagen sollte Axone weiter wachsen und Verzweigung (Abbildung 2) angezeigt. Es werden unterschiedliche Morphologien durch Subtyp Besonderheiten. Zum Beispiel mittlere Spalte MNs, die axiale Muskeln innervieren haben kürzere und mehr verzweigten Axone als seitliche motor Spalte MNs, die Extremität Musk...

Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Neurobiologie zu beantworten, wie motorische Neuronenpolarität, Axon-Führung, Axonhandel, und neurodegenerative Mechanismen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist es, eine hoch angereicherte motorische Neuronenkultur zu erhalten, während wir unser Knockdown-Protein nach minutenhoher Zuneigung ausdrücken. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie einen Embryo in eine Schale von Seziermedien mit Silizium kodiert.Halten Sie den Embryo unter dem Mikroskop mit der Zange mit dem Bauch gegen das Silizium. Mit dem zweiten Zangenpaar eine der Spitzen in den zentralen Kanal des Rostradrückenmarks einlegen. Schließen Sie dann die Zange, um das Rückengewebe leicht zu reißen.Wiederholen Sie diese Operation in Richtung der Seite, bis das gesamte Rückenmark geöffnet ist. Als nächstes positionieren Sie den Embryo so, dass das offene Rückenmark gegen das Silizium ist. Anschließend lösen Sie den rostradien Teil des Rückenmarks vom Körper.Kneifen Sie den Rostradteil des Rückenmarks und ziehen Sie den Embryo am Kopf, um das Rückenmark zu extrahieren. Ziehen Sie alle verbleibenden Hirngebungen und DRGs, die noch am Rückenmark befestigt sind, vorsichtig w

modeling-charcot-marie-tooth-disease-vitro-transfecting-mouse-primary

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Forschung

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Neurowissenschaften

Cultured Muskelzellen sind ein unzureichendes Modell zu rekapitulieren innervierten...

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren in Muskeldystrophie 1 Myoblasten Modelle Gründung, einschließlich optimierte C2C12 Zell Wartung, Gen-Transfektion / Transduktion und Myozyten-Differenzierung.

Modellierung Muskeldystrophie 1 in C2C12 Myoblastenzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Die Messung der Nervenleitgeschwindigkeit ist ein nützliches Instrument zur Maus-Modellen der Neurodegeneration zu beurteilen, aber es ist häufig nur angewendet, um den Ischiasnerv im Hintergliedmaßen zu stimulieren. Hier beschreiben wir eine Technik, um zusammengesetzte Muskel Aktionspotential (CMAP) in Vivo in der Maus vordergliedmaße Muskeln innerviert den Plexus brachialis zu messen.

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der zusammengesetzten Muskel Aktionspotential aus die Vorderbeine in Maus-Modellen der Motor Neuron Degeneration

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Umwandlung von induzierten pluripotenten Stammzellen in motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen-oder Schädelidentität, indem es die Transkriptionsfaktoren von induzierbaren PiggyBac-Vektoren ausführt.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um homogene Zellkulturen von primären okulomotorischen, Trochlea- und Spinalmotorneuronen zu ergeben. Diese Kulturen können für vergleichende Analysen der morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften von augen- und spinalmotorischen Neuronen verwendet werden.

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von In-vitro-NMJs aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zur Verfügung. Diese Methode kann NMJs mit ausgereifter Morphologie und Funktion in 1 Monat in einem einzigen Brunnen induzieren. Die daraus resultierenden NMJs könnten potenziell verwendet werden, um verwandte Krankheiten zu modellieren, pathologische Mechanismen zu untersuchen oder medikamentöse Verbindungen für die Therapie zu untersuchen.

In vitro Neuromuskuläre Junction Induziert von humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung menschlicher motorischer Einheiten in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten durch Kokulturierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Motoneuronen mit humanen primären Mesoangioblasten-abgeleiteten Myotuben, was zur Bildung funktionell aktiver neuromuskulärer Verbindungen führt.

Erzeugung humanmotorischer Einheiten mit funktionellen neuromuskulären Verbindungen in mikrofluidischen Geräten

Wir beschreiben ein reproduzierbares, automatisiertes und unvoreingenommenes Bildgebungssystem zur Charakterisierung der neuromuskulären Verbindungsfunktion unter Verwendung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und optogenetischen Motoneuronen. Dieses System ermöglicht die funktionelle Quantifizierung der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit und erkennt eine verminderte neuromuskuläre Funktion, die durch Neurotoxine und Myasthenia gravis Patientenserum verursacht wird.

Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Die Verwendung eines immunkompetenten, autochthonen Tumormodells, das von häufigen Patientenmutationen angetrieben wird, für präklinische Tests ist für immuntherapeutische Tests von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Hirntumor-Mausmodellen unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die häufige Patientenmutationen repräsentieren, und liefert so ein genaues, reproduzierbares und konsistentes Mausmodell.

Modellierung von Hirntumoren in vivo unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die die Mutationssignaturen von Patienten repräsentiert

Erfahren Sie die Isolierung und Transfektion primärer Motoneurone aus dem Rückenmark der Maus. Diese Methode ermöglicht die Modellierung neurodegenerativer Mechanismen bei Motoneuronerkrankungen.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

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