Organkulturen

In-vitro-Kulturen von partiellen oder ganzen Organen werden häufig verwendet, um die Gewebe- und Organfunktion unter verschiedenen Testbedingungen genau zu modellieren. Die Kultivierung ganzer Organe kann die Dezellularisierung eines herausgeschnittenen Organs oder die Entnahme von Zellen beinhalten, um die native Organstruktur zu nutzen. Es folgt die Rezellularisierung mit neuen Zellen. Die Verwendung von spezialisierten Bioreaktoren wird häufig in den Rezellularisierungsprozess integriert, um das Gewebewachstum im Körper nachzuahmen. In diesem Video werden die Grundprinzipien der Ganzorgangewebekultur vorgestellt und das Verfahren im Labor demonstriert.

Dieser Prozess beginnt mit der Entnahme eines Spenderorgans. In diesem Beispiel zeigen wir eine Spenderlunge von einem Affen. Durch einen Prozess, der als Detergenzperfusion bezeichnet wird, wird das isolierte Organ systematisch durch eine Reihe von Wäschen von seiner nativen Zellpopulation gereinigt, was zu einer sterilen azellulären Organmatrix führt. Anschließend wird die Gewebematrix unter Verwendung bestimmter Zelltypen, wie z. B. einer etablierten Stammzelllinie, rezellularisiert. Zellen können auch von der Person gespendet werden, die das manipulierte Gewebe erhält, was als autologe Zelltransplantation bezeichnet wird. Dies mildert die Abstoßung und verbessert die Biokompatibilität des Organs. Alternativ können Zellen von einem anderen Spender verwendet werden, die sogenannte allogene Transplantation. Dies kann erforderlich sein, wenn dem potenziellen Empfänger keine ausreichende Anzahl von Zellen entnommen werden kann. Sobald die Zellen auf dem Organ ausgesät sind, werden Gewebebioreaktoren verwendet, um die Zellproliferation zu stimulieren und das Gewebewachstum zu steuern. Diese Reaktoren zielen darauf ab, das Organ dynamisch zu kultivieren und die natürliche Umgebung in vivo nachzuahmen. So kann das Organ beispielsweise an eine Schlauchpumpe angeschlossen werden, um den Blutfluss zu simulieren. Nachdem Sie nun die Prinzipien der Organkultur kennengelernt haben, werfen wir einen Blick auf ein Beispielverfahren, bei dem die gesamte Organkultur der Spenderlunge beteiligt ist.

Zu Beginn wird die Spenderlunge in eine Präparierschale gelegt und die Lungenarterie durch Einführung eines weiblichen Luer-Konnektors in den offenen Hohlraum kanüliert. Anschließend wird eine zweite weibliche Luer-Konnektorin in die Trachealöffnung eingeführt. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS, die 30 Einheiten pro Milliliter Heparin und fünf Mikrogramm pro Milliliter Natriumnitroprussid enthält, wird dann instilliert, um die Erweiterung der Blutgefäße und den Abtransport von eingeschlossener Luft aus der Lunge zu erleichtern. Die Lösung wird durch natürlichen Rückstoß ausgestoßen und vor dem Verschließen der Kanüle noch zweimal wiederholt, um die Lösung in der Lunge zu halten und eventuelles Restblut aufzulösen. Dann werden beide Vorhöfe zerrissen und die Kappe der trachealen Luer-Kanüle entfernt, um den Flüssigkeitsabfluss zu erleichtern. Die Perfusion wird mit PBS, Heparin und Natriumnitroprussidlösung fortgesetzt, bis so viel Blut wie möglich aus dem Lungengefäßsystem entnommen wird. Um mit der Dezellurisierung zu beginnen, wird die Lunge aufgeblasen und mit entionisiertem Wasser durchdrungen. Nach fünf arteriellen und vaskulären Waschungen wird die Lunge aus dem Wasser genommen und in ein Reinigungsmittel namens Triton getaucht, um Zellen zu entfernen und gleichzeitig die Organmatrix nur minimal zu beeinträchtigen. Die Lungen werden noch zweimal mit Triton-Lösung aufgeblasen, bevor sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert werden. Nach der Inkubation wird die Lunge noch fünfmal mit frischem entionisiertem Wasser gewaschen. Als nächstes wird die Lunge in 2%ige Natriumdesoxycholatlösung getaucht und dann noch mehrmals mit Wasser und Pufferlösung gewaschen, um die Dezellularisierung und Entfernung von Zelltrümmern zu erleichtern. Nach vollständiger Reinigung wird das Organ bis zur Verwendung in einer sterilen PBS-Lösung bei vier Grad Celsius gelagert.

Um das natürliche Verhalten der Lunge nachzuahmen, kann ein spezieller Bioreaktor verwendet werden, wie der hier gezeigte. Zunächst wird die Hauptkammer des Reaktors mit Kulturmedium gefüllt, das auf die 5%ige Kohlendioxidatmosphäre ausgeglichen wurde. Dann wird die Orgel eingebaut. Nach dem Anschließen wird der Deckel gesichert und die gesamte Luft mit einer Spritze aus dem Schlauch entfernt. Der Bioreaktor wird dann zum Äquilibrieren in einen Gewebekultur-Inkubator gebracht. Anschließend wird die Lunge mit etwa einem vollen Atemzug alle zwei Minuten beatmet und das Medium über die Peristaltikpumpe mit etwa 10 Millilitern pro Minute durch das Gefäßsystem zirkuliert – insgesamt 30 Minuten lang.

Für die Aussaat der Atemwege wird die Lunge mit einer Zellsuspension aufgebläht, die mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark enthält. Um die Lungenbläschen zu rezellularisieren, die für den Sauerstoff- und Kohlendioxidgasaustausch verantwortlich sind, der in der Lunge stattfindet. Die Lunge wird dann über Nacht inkubiert, damit sich die Zellen an die dezellularisierte Matrix anheften können. Nach der Inkubation über Nacht wird die Belüftung wieder aufgenommen und die Zellen werden mehrere Tage lang in der Organmatrix wachsen gelassen. Als nächstes wird die Gefäßaussaat durch die allmähliche Einführung von Endothelzellen unter Verwendung der Peristaltikpumpe abgeschlossen, um die Rezellularisierung kleiner Gefäße zu initiieren, und dann mehrere Stunden lang statisch kultiviert, um die Entwicklung eines zellulären genauen Organs zu erleichtern. Das Kulturmedium wird erneut zirkuliert, und die Zellen werden eine Woche lang kultiviert, um das Wachstum und die Anheftung unter dynamischen Bedingungen zu fördern. Sobald das Gewebewachstum abgeschlossen ist, wird eine Histologie durchgeführt, um die Anheftung und das Wachstum sowohl der mesenchymalen Stammzellen als auch der Endothelzellen am Gefäßsystem und den Atemwegen des Organs zu bestätigen. Die Histologie zeigt die Anheftung von mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen an die Alveolen innerhalb des Matrixgerüsts und an kleine Gefäßgefäße, wodurch das Erscheinungsbild von nativem Lungengewebe entsteht.

Nachdem Sie nun etwas über die Ganzorgankultur gelernt haben, werfen wir einen Blick auf einige praktische Anwendungen dieser Technologie außerhalb des Hauptschwerpunkts der regenerativen Medizin und des Organersatzes. Ganzorgankulturen können auch als Mittel zum Testen von pharmazeutischen Wirkstoffen oder Medikamentenverabreichungsgeräten verwendet werden. In dieser Studie wurden beispielsweise embryonale Schilddrüsen von Mäusen explantiert, kultiviert und als Organmodell verwendet, um zu beobachten, wie experimentelle pharmazeutische Wirkstoffe durch das Organ und das Gewebe transportiert werden. Diese Simulation kann letztendlich zu einer realistischeren Darstellung führen, wie ein Medikament in vivo innerhalb eines Organs übertragen wird. Schließlich kann die Ganzorgangewebekultur verwendet werden, um das Verhalten von Geweben unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Bandscheiben aus Rinderschwänzen entnommen, um die möglichen Mechanismen der Bandscheibendegeneration zu untersuchen. Speziell entwickelte Bioreaktoren wurden eingesetzt, um eine mechanische Belastung der Scheibe zu induzieren, um besser zu verstehen, wie sich diese Belastungen auf die Degeneration auswirken.

Sie haben sich gerade das Video von Jupiter über die Kultur des gesamten Organgewebes angesehen. Sie sollten nun verstehen, wie ganze Organe in vitro kultiviert werden können und wie diese Technik im Bereich des Bioengineerings angewendet wird. Danke fürs Zuschauen.