Phosphopeptide Bereicherung gepaart mit quantitativen markierungsfreie Massenspektrometrie zu untersuchen, die Phosphoproteome bei Prostatakrebs

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in allen Forschungsbereichen zu beantworten, in denen das Phosphorylierungssignal von Interesse ist, wie z. B. im Krebsbereich, um Veränderungen in Signalnetzwerken nach therapeutischer Resistenz zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Tausende von Phosphopeptiden auf relativ einfache und kostengünstige Weise identifiziert werden können, um das Phosphoproteom global zu bewerten. Um Tumorgewebe zu gewinnen, wiegen Sie den Tumor und fügen Sie in einem Kulturreagenzglas zwei Milliliter eiskalten Lysepuffer pro 100 Milligramm Gewebe hinzu.

Verwenden Sie dann einen Hand- oder Tischhomogenisator, um das Lysat zu homogenisieren. Um die Probe zu reduzieren und zu alkoholisieren, erhitzen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius und kühlen Sie die Probe dann 15 Minuten lang auf Eis ab. Während Sie sich noch auf Eis befinden, beschallen Sie das Lysat dreimal und erhitzen Sie die Probe dann fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius.

Legen Sie das Beschallungsröhrchen in einen schwingenden Schaufelrotor und zentrifugieren Sie das Lysat 15 Minuten lang bei 3.500 g und 15 Grad Celsius, sammeln Sie dann den Überstand und entsorgen Sie das Pellet. Um das Lysat zu verdauen, verwenden Sie 100 millimolare Tris, um die Probe um das 12-fache zu verdünnen, um die Menge an Guanidinium zu reduzieren. Für fünf Milligramm Protein fügen Sie 10 Mikrogramm Lysyl-Endopeptidase oder Lys-C hinzu und inkubieren Sie die Probe fünf bis sechs Stunden lang bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie ein Milligramm pro Milliliter TPCK-behandeltes Trypsin in einem millimolaren HCL mit 20 Millimolar Calciumchlorid und Trypsin zu, die in einem Verhältnis von Trypsin zu Protein von eins zu 100 hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Probe drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann ein zusätzliches Aliquot Trypsin in das Röhrchen und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie die Probe in einen 15-Milliliter-10-Kilodalton-Sperrfilter. Die Probe wird in einem Schwingeimer oder Festwinkelrotor bei 3.500 g und 15 Grad Celsius zentrifugiert, bis das Retentatvolumen weniger als 250 Mikroliter beträgt. Sammeln Sie dann den Durchfluss und verwerfen Sie das Retentat.

Um die Probe anzusäuern, fügen Sie etwa 20 Mikroliter 5%ige Trifluoressigsäure oder TFA pro Milliliter Lysat hinzu. Mischen Sie das Röhrchen gut und verwenden Sie einen pH-Streifen, um den pH-Wert zu messen. Falls erforderlich, fügen Sie zusätzliche 5 % TFA hinzu, um den pH-Wert auf 2,5 einzustellen.

Verbinden Sie als Nächstes das kürzere Ende einer C18-Säule mit einem Vakuumverteiler. Nach dem Einstellen des Vakuums zwischen 17 und 34 Kilopascal verwenden Sie drei Milliliter 100%iges Acetonitril und eine Glaspipette, um die Säule zu befeuchten. Äquilibrieren Sie die Säule mit einer Glaspipette und tragen Sie zwei Drei-Milliliter-Aliquots von 0,1 % TFA auf.

Laden Sie dann die angesäuerte Probe auf die Säule. Verwenden Sie drei drei Milliliter Volumen von 0,1 TFA, um die Säule zu waschen. Tragen Sie dann zwei Milliliter 40 % ACN 0,1 % TFA auf, um die Probe zu eluieren, und sammeln Sie zwei Milliliterfraktionen in Glaskulturröhrchen.

Decken Sie die Eluentenröhrchen mit Parafilm ab und stanzen Sie mit einer 20-Gauge-Nadel drei bis fünf Löcher in die Abdeckung, bevor Sie die Proben über Nacht lyophilisieren. Resuspendieren Sie das lyophilisierte Pulver mit 0,5 Millilitern eiskalter Immunpräzipitation oder IP-Bindungspuffer in jeder Fraktion. Übertragen Sie das 0,5 Milliliter Resuspensionsvolumen aus der zweiten Fraktion in das Röhrchen mit der ersten Fraktion und bewahren Sie die Pipettenspitze auf.

Verwenden Sie weitere 0,5 Milliliter IP-Puffer, um jedes Gefriertrocknungsröhrchen zu spülen, bevor Sie den Inhalt in das Kryoröhrchen übertragen, und wiederholen Sie dann die Spülung mit zwei Millilitern IP-Puffer. Nachdem Sie ein P200 mit einer abgeschnittenen Spitze verwendet haben, um den Vorrat von 0,5 Milligramm pro Milliliter Antikörperbead-Aufschlämmung in das Mikrofugenröhrchen zu übertragen, fügen Sie 450 Mikroliter eiskalten IP-Bindungspuffer hinzu, um 50 Mikroliter 4G10-Antikörperbead-Aufschlämmung und 25 Mikroliter 27 B10.4-Antikörperbead-Aufschlämmung in einem Mikrofuge-Röhrchen zu waschen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei 100 g und vier Grad Celsius.

Nach dem Ansaugen des Überstands wird ein Volumen zugegeben, das dem ursprünglichen Slurry des IP-Bindungspuffers entspricht, um die Kügelchen zu resuspendieren. Geben Sie vorgewaschene pY-Kügelchen in die resuspendierte Probenlösung in den Kryoröhrchen mit Schraubverschluss und inkubieren Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem durchgehenden Rotator. Bewahren Sie nach dem Abdrehen der Kügelchen den Überstand auf, der zur Anreicherung von pST-Peptiden verwendet wird.

Verwenden Sie anschließend 300 Mikroliter IP-Bindungspuffer, um die Kügelchen zu resuspendieren und in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Schleudern Sie die Proben bei 100 g und vier Grad Celsius eine Minute lang herunter. Waschen Sie die Kügelchen dann mit 500 Mikrolitern IP-Bindungspuffer dreimal.

Waschen Sie die Kügelchen viermal mit 450 Mikrolitern 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat pH 7,5. Tauchen Sie eine Gelladespitze etwas unter die Perlenoberfläche und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Fügen Sie den Perlen das vierfache Volumen von 0,1 % TFA hinzu.

Dann gut vermischen und das Röhrchen in einem Thermomixer bei 1.000 U/min und 37 Grad Celsius 15 Minuten lang inkubieren. Übertragen Sie die Resuspension in einen 0,2-Mikrometer-Spin-Filter und zentrifugieren Sie den Filter eine Minute lang bei 850 g. Nach dem Überführen der Elution in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung wird das Eluent über Nacht bei 40 Grad Celsius mit einer Heizzeit von 300 Minuten vakuumkonzentriert.

Um die in den Spitzen enthaltenen Titanoxidkügelchen herzustellen, fügen Sie 200 Mikroliter 100%ACN hinzu. Drehen Sie es dann um und schnippen Sie mit dem schmalen Ende, um die Flüssigkeit in Richtung der Kappe zu bewegen. Schneide die Spitze mit einer Rasierklinge ab und lege sie über das proteinarme Bindungsröhrchen.

Entfernen Sie dann die Kappe und führen Sie eine Mikropipette ein, um die verbleibende ACN herauszutauchen, bevor Sie den Waschvorgang wiederholen. Konditionieren Sie das Titandioxid zweimal mit 500 Mikrolitern 100%ACN. Konditionieren Sie dann das Titandioxid zweimal mit 500 Mikrolitern 0,2 molaren Natriumphosphatpuffer pH 7.

Zum Schluss verwenden Sie 300 Mikroliter Äquilibrierungspuffer, um die Kügelchen dreimal zu waschen. Geben Sie 400 Mikroliter 50 % ACN 0,1 % TFA in das proteinarme Bindungsröhrchen. Fügen Sie dann 84 Mikroliter Milchsäure hinzu.

Übertragen Sie die resuspendierten Phosphopeptide in das proteinarme Bindungsröhrchen und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem End-over-End-Rotator. Nach dem Pelletieren der Kügelchen werden sie mit 300 Mikrolitern Äquilibrierungspuffer zweimal gewaschen und heruntergeschleudert. Spülen Sie die Kügelchen mit 300 Mikrolitern Spülpuffer zweimal aus.

Übertragen Sie sie dann auf einen 0,2-Mikrometer-Schleuderfilter. Nach dem Schleudern die Filtereinheit in ein sauberes 1,5-Milliliter-Bindungsröhrchen mit niedrigem Proteingehalt umfüllen und mit 200 Mikrolitern 0,9 % Ammonium in Wasser den Inhalt zweimal eluieren. Nach Überprüfung des pH-Werts wird das Eluent über Nacht bis zur Trockenheit vakuumkonzentriert, um das Ammoniak zu verdampfen.

Um die Peptide für die MS-Analyse zu entsalzen, rekonstituieren Sie die Phosphopeptide mit 15 Mikrolitern 0,1 % TFA. Reinigen Sie die Probe mit einer C18-Spitze mit einem Bindevermögen von fünf Mikrogramm und befolgen Sie das Protokoll des Herstellers. Nachdem das Elutionsvolumen durch Vakuumkonzentration vollständig getrocknet wurde, werden die getrockneten Phosphopeptide in 12,5 Mikrolitern Massenspektrometrielösung resuspendiert.

Dieses Coomassie-gefärbte Gel aus vorverdautem Lysat bestätigt das Vorhandensein von Proteinen, während die Färbung des nachverdauten Lysats den vollständigen Verdau bestätigt. Für einen vollständigen Aufschluss sollten keine Banden über 15 Kilodalton auftreten, mit Ausnahme der 30-Kilodalton- und 23,3-Kilodalton-Banden für Lys-C bzw. Trypsin. Durch die Zugabe von Lys-C wird auch die Anzahl der übersehenen Spaltungen reduziert.

Die pY-Immunpräzipitation trennt effektiv pY- von pST-Peptiden: Im Durchschnitt sind 85 % der aus dem pY-Präparat identifizierten Phosphopeptide pY, und über 99 % der aus dem pST-Präparat identifizierten Phosphopeptide sind pST. Titandioxid wird in beiden Präparaten zur Anreicherung von Phosphopeptiden verwendet. Der erwartete Prozentsatz der phosphorylierten Peptide in der MS-fertigen Zubereitung liegt zwischen 30 und 50 %, und die Mehrzahl der nachgewiesenen Phosphopeptide weist eine einfache oder doppelte Phosphorylgruppe auf.

Nach der Durchführung der Massenspektrometrie werden die MS-Rohdateien in eine MS-Analysesoftware geladen. Wie hier dargestellt, filtert das Festlegen eines Lokalisierungswahrscheinlichkeits-Cutoffs von mehr als 0,75 etwa 5 % der pY-Peptide bzw. 15 % bzw. 34 % der pS- und pT-Peptide heraus. Nach Anwendung dieser Filter beträgt die erwartete Anzahl von Phosphopeptid-Identifizierungen am Ende der MS-Analyse etwa 300 pY-Peptide für fünf Milligramm des Ausgangsproteins und etwa 7.500 pS-Peptide und 640 pT-Peptide für 2,5 Milligramm der Ausgangspeptidmenge aus den jeweiligen Anreicherungspräparaten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Tagen durchgeführt werden, wenn die pY- und pST-Schritte parallel ausgeführt werden. Führen Sie jedoch bei mehr als acht Stichproben die Schritte nacheinander aus, um technische Fehler über weitere vier Tage zu reduzieren. Wenn Sie diese Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich auf die Details zu konzentrieren.

Jeder Schritt ist wichtig und kann sich auf die Qualität der letzten Vorbereitungen auswirken, einschließlich der notwendigen Qualitätskontrollen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteine extrahiert und verdaut, gefolgt von einer Phosphopeptidanreicherung zur Analyse mittels Massenspektrometrie, um globale Veränderungen im Phosphoproteom zu untersuchen.