Name: Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur Analyse endokriner Bauchspeicheldrüsenzellen bei der Maus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellentwicklung und Heterogenität für Diabetesforschung.

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Wir danken die National Center für Protein Sciences, Beijing (Peking-Universität) und dem Peking-Tsinghua-Center für die Life Science-Computing-Plattform. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2015CB942800), der National Natural Science Foundation of China (31521004, 31471358 und 31522036) und Finanzierung von Peking-Tsinghua Zentrum für Life Sciences, C.-R.X.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll haben wir eine effektive und einfach zu bedienende Methode zur Untersuchung der einzelligen expressionsprofile von pankreatischer β-Zellen gezeigt. Mit dieser Methode konnte, endokrine Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und einzellige transkriptomischen Analysen durchzuführen.
Die wichtigste Schritt ist die Isolierung der einzelnen β-Zellen in gutem Zustand. Voll PERFUNDIERTEN Bauchspeicheldrüsen reagieren besser auf nachfo...

Die Bauchspeicheldrüse ist eine wichtige Stoffwechselorgan bei Säugetieren. Die Bauchspeicheldrüse besteht aus endokrinen und exokrinen Fächer. Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse, Insulin produzierenden β-Zellen und Glukagon produzierenden α Zellen, einschließlich cluster gemeinsam in den Langerhans-Inseln und koordinativ systemische Glukose Homöostase zu regulieren. Dysfunktion der endokrinen Zellen führt zu Diabetes Mellitus, die eine wichtige gesundheitspolitische Frage weltweit geworden ist.
Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse stammen aus Ngn3+ Vorfahren während der Embryogenese1. Später, während der Perinatalperiode die endokrinen Zellen vermehren sich zu Form unreifen kleinen Inseln. Diese unreifen Zellen weiter zu entwickeln und allmählich reifer Inselchen, die reich durchblutet werden, um Blut-Glukose-Homöostase in Erwachsene2zu regulieren.
Obwohl eine Gruppe von transcriptional Faktoren, die β-Zell-Differenzierung zu regulieren identifiziert worden, ist die präzise Reifung Weg der β-Zellen noch unklar. Darüber hinaus beinhaltet der β-Zelle-Reifung auch die Regulierung der Zelle Nummer Erweiterung3,4 und die Generierung von zellulären Heterogenität5,6. Die Regulierungsmechanismen dieser Prozesse sind jedoch nicht gut untersucht worden.
Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, der Zelle Subpopulationen Profil und Zelle Abstammung Entwicklungsbiologie Bahnen7verfolgen kann. Nutzen diese Technologie, die Schlüssel, die Ereignisse, die während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen auftreten bei den einzelligen Ebene8entziffert werden können. Unter den einzelligen RNA-Sequenzierung Protokolle ermöglicht Smart-seq2 die Erzeugung von in voller Länge cDNA mit verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit und die Verwendung von standard Reagenzien bei niedrigeren Kosten9. Smart-seq2 dauert ungefähr zwei Tage, eine cDNA-Bibliothek für Sequenzierung10zu konstruieren.
Hier schlagen wir eine Methode zur Isolierung von Fluoreszenz-markierten β-Zellen aus den Bauchspeicheldrüsen von fetalen Erwachsenen Ins1-RFP Transgene Mäuse11, mit Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die Leistung des transkriptomischen analysiert, bei der einzellige Ebene, mit Smart-seq2 Technologie (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann erweitert werden, um das Transkriptom alle pankreatischen endokrinen Zelltypen in normalen und pathologischen Altern Staaten zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Nadel 1/2" Länge</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol Rundbodenrohr mit Zellsiebkappe</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Mikroplatte</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Dichtungsmatte</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwell-PCR-Röhrchen</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarpipette</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC-RNA-Spike-In-Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter RNase-Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Hochgestellte II-Reverse-Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Erststrangpuffer (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 für Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>Enthält 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V3 für Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td><td>Enthält 16 N6XX und 24 N8XX</td></tr> High <tr><td>Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td><td>Fortschrittliche Analysetechnologien</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS ohne Ca2+ und Mg2+</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Isolationspuffer</td><td></td><td></td><td>1 &times; HBSS mit 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,4</td></tr><tr><td>FACS-Puffer</td><td></td><td></td><td>1 & mal; HBSS mit 15 mM HEPES, 5,6 mM Glucose, 1 % FBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN Primer</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>Primer</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Forward Primer</td><td></td><td></td><td>5'-ATGGTGAAGC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Reverse Primer</td><td></td><td></td><td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Vorne Primer</td><td></td><td></td><td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Reverse Primer</td><td></td><td></td><td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

einzellige transkriptomischen analysen der maus endokrinen zellen der bauchspeicheldrüse

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pankreatische endokrine Zellen, die in Inseln gruppiert sind, Regeln Blut-Glukose-Stabilität und Energiestoffwechsel. Die unterschiedlichen Zelltypen in Inseln, einschließlich Insulin-sezernierenden β-Zellen werden von gemeinsamen endokrine Vorfahren während der embryonalen Phase unterschieden. Unreife endokrine Zellen über Zellproliferation zu erweitern und einen lange postnatale Entwicklung Zeitraum Reifen. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Prozesse nicht klar definiert. Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein vielversprechender Ansatz für die Charakterisierung von unterschiedlichen Zellpopulationen und Ablaufverfolgung Zelle Abstammung Differenzierung Wege. Hier beschreiben wir eine Methode für die einzelne Zelle RNA-Sequenzierung der isolierte Pankreatische β-Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen.

Bauchspeicheldrüsen von embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Mäusen seziert wurden (Abbildung 2A und 2 b). Für Mäuse älter als postnatale 18.Tag hängt die verdauungsfördernde Wirkung vom Grad der Durchblutung; die Injektion ist daher der wichtigste Schritt zur Insel Isolierung (Abbildung 2-2E und Tabelle 6). Wie viel Kollagenase injiziert wurde, da die Bauc...

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Diese Methode kann wichtige Fragen im Pankreas-Isletfeld zur Differenzierung, Reifung und Regeneration der Pankreas-Islet-Linie beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Sammlung einzelner Pankreas-Isletzellen zur Generierung hochwertiger einzelliger RNA-Sequenzierungsdaten ermöglicht. Die Anwendung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Diabetes und anderen endokrine Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse durch die transkriptomische Analyse von mittelspeicheldrüsen endokrinen Einzelzellen auf die pathologischen Bedingungen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Einsetzen der Nadel in den schmalen Gallengang der Bauchspeicheldrüse für die Perfusion schwierig sein kann. Für den embryonalen Tag 17,5 Embryonen. Nach dem Öffnen der Bauchhöhle verwenden Sie eine Ellbogenpinzette, um das Viszeralgewebe in eine sechs Zentimeter schwarze Bodenschale mit kaltem PBS zu übertragen.Verwenden Sie Zangen, um die Bauchspeicheldrüse vom Viszeralgewebe zu lösen. Und legen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe in eine 20 Milliliter Durchstechflasche mit fünf Milliliter kalte Kollagennase-Lösung. Für postnatale Tag null b

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine...

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von Zellen in der Bauchspeicheldrüse Mikroumgebung aus embryonalen, neonatalen und adulten Mausgewebe, auf die Isolierung von mesenchymalen Zellen konzentriert. Dieses Verfahren ermöglicht Profilieren von Zell Genexpression und Proteinabsonderung, um die extrinsische Signale zu erläutern, die Pankreas-Entwicklung, Funktion und tumorigenesis regulieren.

Isolierung und Analyse von Zellen des Pankreas Mesenchyme durch Durchflusszytometrie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung hochwertiger, großflächiger Transkriptomdaten einzelner Zellen aus isolierten menschlichen Pankreasinseln unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie vor.

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Metaplastische Zellen der Bauchspeicheldrüse sind Vorläufer bösartiger Zellen, aus denen Pankreastumoren entstehen. Die Isolierung intakter, lebensfähiger Pankreaszellen ist jedoch eine Herausforderung. Hier stellen wir eine effiziente Methode zur Dissoziation von Pankreasgewebe vor. Die Zellen können dann für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) oder für die zwei- oder dreidimensionale Co-Kultivierung verwendet werden.

Pankreasgewebedissektion zur Isolierung lebensfähiger Einzelzellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie menschliche Bauchspeicheldrüsenschnitte von verstorbenen Organspendern erzeugt werden, um die Zellfunktion unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieser innovative Ansatz ermöglicht die Untersuchung normaler und strukturell geschädigter Inselzellen und des komplexen Zusammenspiels zwischen endokrinen und exokrinen Kompartimenten.

Generierung von menschlichen Pankreasgewebeschnitten zur Untersuchung der endokrinen und exokrinen Pankreasphysiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Erfahren Sie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur Analyse endokriner Bauchspeicheldrüsenzellen bei der Maus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellentwicklung und Heterogenität für Diabetesforschung.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

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