Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

Diese Methode kann bei der Point-of-Care-Diagnostik von Patienten mit Anzeichen von Virusinfektionen hilfreich sein. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ohne Laborgeräte und Strom durchgeführt werden kann und daher auf einer Krankenstation durchgeführt werden kann. Das Verfahren der Blutentnahme wird von dem Arzt Anders Fomsgaard und dem Wissenschaftler Morten Rasmussen, beide aus meinem Labor, demonstriert.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Blutentnahmeröhrchen. Verwenden Sie eine 25-Gauge-1-Zoll-Nadel, die an einer 3-ML-Spritze befestigt ist, um 1,6 ML eines handelsüblichen Lysepuffers in ein 4-ml-EDTA-Vakuumröhrchen zu injizieren. Es ist wichtig, das Vakuum im Blutentnahmeröhrchen für die Blutentnahme aufrechtzuerhalten.

Verwenden Sie daher immer eine Nadel, um den Lysepuffer in das Blutentnahmeröhrchen zu injizieren. Als nächstes wird ein Volumen von 960 Mikrolitern magnetischer Glaspartikel (MGPs) vollständig resuspendiert und in ein beschriftetes 1,8-ml-Röhrchen überführt. Pipettieren Sie anschließend 4 ml Waschpuffer eins in ein 4,5-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung WB-1,1,5 ml, Waschpuffer zwei in ein 3,6-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung WB-2 und 3 ml Waschpuffer drei in ein 4,5-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung WB-3.

Geben Sie schließlich 100 Mikroliter Elutionspuffer in ein 1,8-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung EB und lassen Sie die Röhrchen bis zur Verwendung bei Raumtemperatur. Um dem Patienten intravenöses Vollblut zu entnehmen, verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel mit einem Verlängerungsschlauch mit kleinem Durchmesser und einen der zuvor vorbereiteten Blutentnahme-Vakuumröhrchen mit Lysepuffer. Legen Sie den Arm des Patienten in eine nach unten gerichtete Position.

Führen Sie die Schmetterlingsnadel in die Vene des Patienten ein und befestigen Sie den Blutentnahme-Vakuumschlauch an der Verlängerung mit kleiner Bohrung. Nach der Blutentnahme mischen Sie den Inhalt des Röhrchens, indem Sie das Röhrchen fünf- bis zehnmal umdrehen. Desinfizieren Sie die Außenseite der Tube mit 70 % Ethanol.

Inkubieren Sie die Röhrchen dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das Virus zu inaktivieren. Um Nukleinsäuren aus dem gesammelten Blut zu reinigen, mischen Sie den Inhalt des Röhrchens erneut, indem Sie das Vakuumröhrchen fünf- bis zehnmal von Hand wenden. Gießen Sie das vorbereitete Aliquot der MGPs direkt in das Blutentnahmeröhrchen.

Setzen Sie einen neuen Deckel aus einem unbenutzten Blutentnahmeröhrchen auf das Röhrchen mit der Probe. Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass das Röhrchen fest verschlossen ist, und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens, indem Sie es fünf- bis zehnmal wenden. Legen Sie die Tube in die Magnethalterung und halten Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass die Tube fest verschlossen ist.

Drehen Sie dann den Magnethalter mit der Röhre einige Male um, um die MGPs zu verteilen, bevor sie sich an der Seite der Röhre mit dem Magneten sammeln. Entfernen Sie den Deckel des Röhrchens und entsorgen Sie den Inhalt des Röhrchens mit einer Einwegpipette in ein 50-ml-Auffangröhrchen. Gießen Sie das vorbereitete Aliquot von WB-1 direkt in das Blutentnahmeröhrchen und schließen Sie den Deckel des Röhrchens.

Mischen Sie den Inhalt fünf- bis zehnmal mit der Hand. Sammeln Sie dann die Kügelchen an der Seite der Tube mit dem Magneten und entfernen Sie die Flüssigkeit wie zuvor. Die Kügelchen werden wieder in das vorbereitete Aliquot von WB-2 suspendiert, dann die Lösung verworfen und der Vorgang mit einem vorbereiteten Aliquot von WB-3 wiederholt.

Entfernen Sie abschließend das Röhrchen aus der Magnethalterung und gießen Sie das vorbereitete Aliquot von EB direkt in das Blutentnahmeröhrchen. Setzen Sie den Deckel auf die Tube und hängen Sie die MGPs wieder auf, indem Sie fünf- bis zehnmal mit einem Finger klopfen. Verwenden Sie abschließend eine 1,5-ml-Einwegpipette, um ein Tröpfchen der resuspendierten MGPs in den nachgeschalteten Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionsmix zu übertragen.

Stellen Sie sicher, dass Sie die MGPs vollständig resuspendieren, bevor Sie nur ein Tröpfchen in die PCR-Reaktion übertragen. Um den Wirksamkeitsnachweis zu erbringen, wurde negatives Vollblut mit 10-fachen Verdünnungen des Ebola-Virus-Standards, der aus dem jüngsten Ausbruch in Südguinea hergestellt wurde, oder mit drei verschiedenen Konzentrationen des Epstein-Barr-Virus versetzt. Die extrahierten Nukleinsäuren wurden mittels hauseigener virusspezifischer R2 qPCR oder qPCR analysiert.

Je niedriger die Kreuzungsschwelle (CT) ist, desto höher ist die Kopienzahl des viralen Genoms. Hier wurden Vollblutwerte, die mit unterschiedlichen Konzentrationen des Ebola-Virus versetzt waren, mit einer Ebola-Virus-spezifischen Lampe nachgewiesen. Die endgültige Viruskonzentration in der mit Dots dotierten Vollblutprobe ist auf der X-Achse und die Minuten bis zum positiven Ergebnis auf der Y-Achse zu sehen.

Hier wurde Vollblut mit 10-fachen Verdünnungen einer von der WHO standardisierten Serumprobe für Hepatitis C dotiert, wobei der Nachweis durch HCV-spezifische RT qPCR erfolgte. Schließlich zeigt dieses Bild die Ergebnisse einer Epstein-Barr-Virus-spezifischen Lampenreaktion an Epstein-Barr-Virus-positivem Vollblut. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den angegebenen Lysebindungspuffer zu verwenden.

Dies ist ein entscheidender Schritt und ein entscheidendes Reagenz für die Methode. Dieser Lysebindungspuffer inaktiviert das Virus in der Probe. Mit dieser Technik können Sie verschiedene molekulare Nachweismethoden wie Lampe und PCR durchführen und somit eine Differentialdiagnose durchführen.