Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Diese Methode ermöglicht es Studenten, eisenbindende Metalloenzyme schnell zu reinigen und dieses Protein dann zu verwenden, um wichtige Fragen zu Struktur und Funktion zu beantworten, und das alles innerhalb der Grenzen des Lehrlabors. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf nicht-häm-Eisen-bindende Enzyme anwendbar ist. Es ist für Studenten im Grundstudium zugänglich und lässt sich leicht im Lehrlabor implementieren.

Um diesen Vorgang zu beginnen, besorgen Sie sich eine 1,5 x 20 Zentimeter große Säule, die mit einem Luer-Lock-Auslass, einer oberen Kappe, die auch eine Luer-Lock-Armatur enthält, und einer unteren Bettstütze zum Zurückhalten von Harzpartikeln ausgestattet ist. Montieren Sie die untere Luer-Lock-Armatur mit einem Absperrhahn, um den Durchfluss zu kontrollieren. Besorgen Sie sich als Nächstes eine Flasche mit einer 50%igen Aufschlämmung aus nickelgebundenem Nitriloessigsäureharz in 20%igem Ethanol, die zuvor bei vier Grad Celsius gelagert wurde.

Schwenken Sie die Flasche vorsichtig, um das Harz gleichmäßig wieder zu suspendieren. Bei Raumtemperatur wird mit einer Messpipette zwei Millimeter der Gülle entnommen und in die Säule überführt. Nachdem die überschüssige Lagerlösung aus dem Harz abgeflossen ist, verwenden Sie eine Pasteurpipette, um vorsichtig mindestens 30 Milliliter gekühlten Lysis-Bind-Puffer hinzuzufügen, wobei Sie darauf achten müssen, die Harzoberfläche nicht zu stören.

Führen Sie den Puffer an den Wänden der Säule entlang, um Spritzer zu vermeiden. Das Harz wird äquilibriert, indem der Puffer langsam durch die Schwerkraft aus der Säule in ein Auffangbecherglas abfließt. Bereiten Sie zunächst die Nickel-NTA-Säule für die Zugabe der zellfreien Rohextrakte vor, indem Sie den Absperrhahn öffnen und den verbleibenden Lysebindungspuffer durch die Schwerkraft durch das Nickel-NTA-Harz abfließen lassen.

Wenn der Puffer vollständig abgelassen ist und die Harzoberfläche freigelegt ist, schließen Sie den Absperrhahn. Verwenden Sie anschließend eine Pasteur-Pipette, um die zellfreien Rohextrakte vorsichtig auf das Harz zu pipettieren, wobei Sie darauf achten, die Oberfläche nicht zu stören. Lassen Sie die Rohextrakte an der Wand der Säule entlanglaufen, um Spritzer zu vermeiden.

Nachdem alle Rohextrakte in die Säule überführt wurden, wird der Absperrhahn geöffnet, damit die Säule durch die Schwerkraft entleert werden kann. Sammeln Sie 100 Mikroliter des Durchflusses für die spätere Analyse. Verwenden Sie einen kurzen Kunststoffschlauch, um eine 10-Milliliter-Luer-Lock-Spritze an die Kappe der Säule anzuschließen.

Ziehen Sie den Spritzenkolben heraus und füllen Sie dann die Säulenkappe fest auf die Oberseite der Säule. Drücken Sie den Kolben vorsichtig zusammen, während Sie das Eluent in einem Messzylinder sammeln, um die Durchflussrate manuell zu beurteilen. Raten zwischen einem und zwei Millilitern pro Minute sind mit dem Harz und dem Versuchsaufbau kompatibel.

Erhöhen Sie vorsichtig die Kompression des Spritzenkolbens, wenn sich die Durchflussrate verlangsamt. Wenn der Meniskus der aufgetragenen Flüssigkeit fünf bis 10 Milliliter über dem Harzbett erreicht, entfernen Sie die Säulenkappe und die angebrachte Handpumpe, um das Eindringen von Luft in das Harz zu verhindern. Lassen Sie das restliche Volumen durch die Schwerkraft ablaufen.

Nachdem die Rohextrakte abgetropft sind und die Harzoberfläche wieder freigelegt ist, geben Sie mit einer Pasteurpipette vorsichtig etwa 30 Milliliter gekühlten Waschpuffer in die Säule, wobei Sie darauf achten, die Harzoberfläche nicht zu beschädigen. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie den Waschpuffer durch die Säule ablaufen. Während die Säule entleert wird, beschriften Sie 16 Mikrozentrifugenröhrchen für die Fraktionssammlung.

Wenn der Puffer vollständig entleert ist und die Harzoberfläche wieder freigelegt ist, schließen Sie den Absperrhahn. Geben Sie mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig etwa 30 Milliliter gekühlten Elutionspuffer in die Säule und achten Sie darauf, die Oberfläche des Harzes nicht zu stören. Öffnen Sie dann langsam den Absperrhahn, damit der Elutionspuffer das Polyhistidin-markierte Protein aus der Säule eluieren kann.

Sammeln Sie jeweils einen Milliliter Eluent in jedem der markierten Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Proteinprüfung werden die proteinhaltigen Fraktionen in einem sauberen konischen Röhrchen kombiniert. Fahren Sie mit einer Rekonstitution des Metallionen-Cofaktors fort oder frieren Sie das Protein in drei Milliliter-Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius ein.

Um mit der Rekonstitution des Metalls zu beginnen, legen Sie ein Aliquot von drei Millilitern des gereinigten Enzyms, das in Elutionspuffer suspendiert ist, auf Eis. Berechnen Sie unter Verwendung des Proteinvolumens im Röhrchen die erforderliche Menge an Natriumascorbat und Dithiothreitol, so dass die Endkonzentration von jedem 12,5 Millimolar in der Probe beträgt. Fügen Sie das feste Natriumascorbat und Dithiothreitol hinzu und mischen Sie es vorsichtig, aber gründlich, bis es sich vollständig auflöst.

Klopfen Sie ein paar Milliliter Granulat festen Eisensulfat-Heptahydrats auf ein Blatt Wiegepapier. Falten Sie das Papier über das Granulat und zerdrücken Sie es mit der flachen Seite eines Metallspatels. Geben Sie ein Korn des resultierenden Pulvers in das Röhrchen mit der Proteinlösung.

Vortex zum Mischen, was zu einer rosig-rosa Farbe führt. Verschließen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie die rosa Lösung zwischen 10 und 30 Minuten auf Eis. Die rosa Farbe verblasst mit der Zeit.

Verwenden Sie für die Gelfiltration eine Gelfiltrationssäule, die mit 10 Millilitern kugelförmigem Polyacrylamidgel in einer 1,5 x 12 Zentimeter großen Säule gefüllt ist, die ebenfalls mit einem 10-Milliliter-Reservoir ausgestattet ist. Äquilibrieren Sie dann die Spalte, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn der Puffer aus der Säule abgelassen wurde und die obere Bettstütze freiliegt, ist der Absperrhahn zu schließen.

Pipettieren Sie die drei Milliliter Lösung aus Eisen, zwei rekonstituierten Metalloenzymen, auf die freiliegende obere Bettstütze. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die gesamte Probe von drei Millilitern durch die Schwerkraft in die Säule gelangen. Entsorgen Sie die ersten drei Milliliter Eluent.

Jede rosa Farbe, die sich beim Hantieren mit der Lösung bildet, wird am oberen Rand der Säule eingeschlossen. Wenn die Säule aufgehört hat zu tropfen und die obere Bettstütze freiliegt, fügen Sie vier Milliliter des Gelfiltrationspuffers hinzu und sammeln Sie vier Milliliter Eluent über 8,5 Milliliterfraktionen. Nach der Kombination proteinhaltiger Fraktionen fahren Sie mit dem Assay oder der Lagerung der Probe fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

In dieser Studie reinigten die Studenten eine Polyhistidin-markierte nicht-Häm-Eisen-bindende Dioxygenase und rekonstituierten sie anschließend. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt, dass das markierte Protein effektiv gereinigt wird. Von Studenten gesammelte Aktivitätsdaten zur enzymatischen Wirkung von gereinigter L-Dopa-Dioxygenase nach Rekonstitution mit Eisen zwei und anschließender Gelfiltration sind hier dargestellt.

Die Verzögerung von fünf Sekunden vor Beginn der Datenerfassung ist typisch für Schüler, die diese Technik zum ersten Mal anwenden. Der Steady-State-Assay zeigt an, dass die kinetischen Parameter, die durch Anpassung der Fortschrittskurven bestimmt wurden, mit den veröffentlichten Ergebnissen übereinstimmen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass mehr Eisen nicht besser ist, da zu viel Eisen zu Proteinausfällungen führt.

Eisenkonzentrationen in einem drei bis fünf molaren Überschuss des Proteins sind ausreichend. Im Anschluss an dieses Verfahren können die Studierenden zusätzliche Experimente durchführen, um die Lösungsstruktur zu messen, die enzym- oder substratabhängige Chemie zu untersuchen und zusätzliche Fragen zum Reaktionsmechanismus zu beantworten.