Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen
4. Juli 2018
Das aktuelle Protokoll beinhaltet eine Methodik für die Sortierung und Reinigung Alter abgestimmt Populationen von Caenorhabditis Elegans. Es verwendet eine einfache, kostengünstige, und effiziente maßgeschneiderte Werkzeug um eine große experimentelle Population von Nematoden für Forschung zu erhalten.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Molekularbiologie zu beantworten, indem sie Assays umfasst, die bestimmte Entwicklungsstadien von C. elegans erfordern. Wie Assays von Gen- und Proteinexpressionsniveaus. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue und effiziente Selektion einer großen Anzahl von C.elegans nach Körpergröße ermöglicht, was die Verwendung von Assays erleichtert, die normalerweise zeit- und kostenintensiv wären.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil sie den Schritt des Wölbungsumsatzes nicht ausführen können oder den Lösungsfluss nicht in der Mitte des Netzes halten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Wasch- und Wendeschritte schwer zu erlernen sind. Einige haben möglicherweise Schwierigkeiten, bestimmte Bewegungen im Text zu interpretieren und zu visualisieren.
Besorgen Sie sich zunächst zwei konische 50-ml-Röhrchen mit Deckeln und entfernen Sie dann mit einem Stufenbohrer die Mitte von der Innenlippe der Deckel. Verwenden Sie bei Bedarf eine Feile, Schleifpapier oder ein rotierendes Werkzeug, um die Ränder und Oberseiten der Deckel zu reinigen und zu schleifen. Schneiden Sie dann eine Scheibe aus monofilem Nylongewebe ab, die etwas kleiner als der Durchmesser des Deckels ist.
Texturieren Sie die oberen Flächen der Deckel und reinigen Sie sie mit Ethanol. Nachdem Sie die Deckel trocknen gelassen haben, tragen Sie Cyanacrylatkleber auf die Oberseite beider Lider auf. Legen Sie anschließend die monofile Netzscheibe auf einen verklebten Deckel.
Drehen Sie den zweiten Deckel auf das Netz um und drücken Sie die Deckel fest zusammen. Nachdem die erste Schicht Kleber getrocknet ist, tragen Sie einen großzügigen Ring Cyanacrylatkleber um den äußeren Spalt zwischen den Lidern auf. Beschriften Sie als Nächstes den Filter mit der entsprechenden Maschenporengröße.
Legen Sie zunächst das Sieb auf ein beschriftetes konisches 50-ml-Röhrchen. Pipettieren Sie dann Kochsalzlösung durch die Mitte des Siebs, bis sich ein Tröpfchen bildet, zusammenfließt und von der Mitte des Filters tropft. Waschen Sie mit M9-Puffer eine Population von C.elegans von einer Schneckenplatte ab und übertragen Sie dann mit einer Glaspasteurpipette den Puffer mit den Würmern auf die Oberseite des monofilen Netzes.
Spülen Sie den Filter in der Mitte des Siebs mit M9-Puffer und wiederholen Sie diesen Spülschritt nach Bedarf, um alle Bakterien und kleineren Würmer durch das Netz zu leiten. Befestigen Sie als Nächstes ein neues konisches 50-ml-Röhrchen an der Oberseite des Siebs, die zuvor gesammelten Würmer, die größer als die Poren im Netz sind, zeigen zur Innenseite des neuen Röhrchens. Entfernen Sie den Abfallschlauch und drehen Sie das Sieb schnell um.
Spülen Sie dann das Netz mit M9-Puffer in das neue Auffangröhrchen. Lassen Sie die gesammelten Würmer etwa eine Minute lang ruhen und saugen Sie dann die Pufferlösung vorsichtig vom Wurmpellet weg. Mit einer Glaspasteurpipette Würmtröpfchen auf einer NGM-Platte herstellen und trocknen lassen.
Zum Schluss spülen Sie das Sieb mit Umkehrosmosewasser und Ethanol aus. Bewahren Sie das Sieb nach dem Trocknen für die zukünftige Verwendung in einem sauberen Behälter auf. Entsorgen Sie das Sieb, wenn es ein schlaffes Aussehen entwickelt.
In diesem Protokoll wurde ein Sieb konstruiert, um altersgerechte Populationen von C.elegans zu sortieren und zu reinigen. Die Tiere in der Siebbehandlungsgruppe zeigten während des gesamten Erwachsenenalters ein normales und spontanes Bewegungsmuster. Darüber hinaus zeigten die Pickel- und Siebgruppen keine signifikanten Unterschiede in der pharyngealen Pumprate.
Die Tiere in der Siebgruppe reagierten auch normal auf vordere oder hintere mechanische Reize im Vergleich zu allen Behandlungsgruppen an einem der Testtage. Schließlich wurde die Fruchtbarkeit der Behandlungsgruppen verglichen; Die Verwendung des Siebs hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl der Nachkommen im Vergleich zur PICK-Behandlungsgruppe. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zehn Minuten durchgeführt werden.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, in der Mitte des Netzbereichs zu arbeiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Caenorhabditis-Sieb zusammenbauen und richtig verwenden, um Würmer nach Körpergröße zu sortieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Sortierung und Reinigung altersgerechter Populationen von Caenorhabditis elegans mithilfe eines selbstgefertigten Werkzeugs. Es ermöglicht Forschern, effizient und kostengünstig eine große experimentelle Population zu gewinnen.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Molekularbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Bestimmte Entwicklungsstadien von C.elegans sind für verschiedene Assays von entscheidender Bedeutung.
- Assays können die Expressionsebenen von Genen und Proteinen betreffen.
- Herkömmliche Methoden können zeitaufwendig und kostspielig sein.
- Visuelle Demonstrationen sind entscheidend, um die Methodik zu verstehen.
Zweck der Studie
- Eine effiziente Methode zur Auswahl von C.elegans anhand der Körperlänge bereitzustellen.
- Assays zu erleichtern, die bestimmte Entwicklungsstadien erfordern.
- Die Zugänglichkeit für Forschende zu verbessern, die neu in dieser Technik sind.
Verwendete Methoden
- Speziell angefertigtes Werkzeug zur Sortierung von Nematoden.
- Bogenförmiger Umspülungsschritt für eine effektive Reinigung.
- Aufrechterhaltung des Lösungsflusses in der Mitte des Siebs.
- Visuelle Demonstrationen zur Unterstützung des Lernprozesses.
Hauptergebnisse
- Genaue Auswahl großer Zahlen von C.elegans erreicht.
- Methode reduziert Zeit und Kosten für molekularbiologische Assays.
- Verbessertes Verständnis spezifischer Bewegungen durch visuelle Hilfsmittel.
- Verbesserte Zugänglichkeit für Forscher, die mit der Methode nicht vertraut sind.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Sortierung von C.elegans.
- Visuelle Hilfsmittel sind entscheidend für das effektive Erlernen der Technik.
- Diese Methodik kann der molekularbiologischen Forschung erheblich zugutekommen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
In der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung ist die Gewinnung synchronisierter Populationen von Modellorganismen wie C. elegans entscheidend für reproduzierbare phänotypische Screening- und Target-Validierungsassays. Der Caenorhabditis-Sieb ermöglicht eine schnelle, kostengünstige Sortierung nach Körperlänge und verringert so den zeitlichen und ressourcentechnischen Aufwand in frühen Entdeckungsworkflows. Dies trägt durch die Sicherstellung einheitlicher biologischer Eingaben zur vorhersagbaren Zuverlässigkeit der Assay-Bereitschaft und der Portfolio-Priorisierung bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen unter Verwendung altersgerechter Wurmpopulationen für konsistente phänotypische Auswertungen.
- Operationaler Wert: Bietet eine kostengünstige, skalierbare Methode zur Erzeugung synchronisierter Kohorten ohne spezielle Ausrüstung.
- Predictive Value: Verringert die biologische Variabilität in Assays und verbessert dadurch die Datenzuverlässigkeit für die Entschärfung von Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vor, indem spezifische Entwicklungsstadien isoliert werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Wurmpräparation und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit zwischen Assay-Platten und Screening-Kampagnen.
- Skalierbarkeit: Unterstützt die Anforderungen von Hochdurchsatzanalysen durch die schnelle Verarbeitung großer Wurmpopulationen in weniger als zehn Minuten.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erhält die phänotypische Treue von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Beweglichkeit, Stressantwort und Fruchtbarkeitsmarker erhalten bleiben.
- Mechanistische Risikominimierung: Ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Gen- und Proteinausprägung in synchronisierten Populationen und unterstützt damit die Abstimmung von Biomarkern.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Erleichtert Go/No-Go-Entscheidungen, indem konsistente Eingaben aus Modellsystemen für die Wirksamkeits- und Toxizitätscharakterisierung bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Caenorhabditis-Sieb ist in den Entdeckungsprozess von der frühen Entdeckung bis zur Leitstruktur-Identifizierung eingebettet und unterstützt gezielt die Bereitschaft von Assays sowie die Reproduzierbarkeit von Screening-Verfahren für auf C. elegans basierende phänotypische Screenings.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie einheitliche Wurmpopulationen für die Aufklärung von Signalwegen und funktionelle Bildschirme bereitstellt.
- Bildschirmanalyse: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch größenbasierte Sortierung und gewährleistet eine konsistente Wurmgröße und -entwicklungsstufe für zuverlässige Wirkstoffbewertungen.
- Analytik: Erzeugt quantitative, größenseparierte Ergebnisse, die es Teams ermöglichen, Bedingungen über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg mit reduziertem Rauschen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem wichtige Gesundheitsmarker (Beweglichkeit, Stressreaktion, Fruchtbarkeit) nach der Sortierung erhalten bleiben und somit die Validität von Biomarkern unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbares, wartungsarmes Werkzeug über verschiedene Teams und Projekte hinweg und fördert die Standardisierung im Umgang mit Modellorganismen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch verringerte mechanistische Mehrdeutigkeit in phänotypischen Assays.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Wurmbearbeitungsabläufen.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirtschaftlichkeit und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige Risikominderung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf zuverlässigen, phasenspezifischen Daten aus Modellsystemen.
Durchführungsaspekte
- Benötigt grundlegende Laborfähigkeiten für die Montage von Sieben und den Umgang mit Lösungen.
- Benötigt Zugang zu konischen Röhrchen, Nylon-Netzen, Cyanacrylat-Kleber und Standardpuffern (M9, Kochsalzlösung).
- Erfordert eine schulungsbezogene Zusammenarbeit zwischen den Teams hinsichtlich der korrekten, auf das Netz ausgerichteten Bedienung und der Umkehrtechnik, um die Konsistenz sicherzustellen.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Auswahl der Porengröße des Netzes für die Zielwurmstadien sowie die Verträglichkeit mit verschiedenen NGM- oder Flüssigkultursystemen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört das mögliche Durchhängen des Netzes im Laufe der Zeit, das eine regelmäßige Ersetzung erfordert, um die Sortiergenauigkeit aufrechtzuerhalten.
